曲靚靚，朱麗娟，楊薇

(錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，遼寧 錦州 121000)

肺浸潤(rùn)性腺癌是發(fā)生于肺泡上皮細(xì)胞的惡性腫瘤。病變的形成和進(jìn)展與多種遺傳物質(zhì)及細(xì)胞因子的改變有關(guān)，其中包括多種DNA、RNA及蛋白等[1]。正性調(diào)控域鋅指蛋白(PRDM2)是鋅指蛋白家族中的成員，具有組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶活性和抑制轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的功能。近年研究顯示PRDM2在惡性腫瘤中的表達(dá)升高，是腫瘤形成的重要促進(jìn)因子[2]。微小RNA(microRNAs，miRNAs)是近年關(guān)注到的與多種腫瘤形成相關(guān)的基因，是19～25個(gè)核苷酸組成的非編碼單鏈小RNA，通過與目標(biāo)基因的3’UTR結(jié)合調(diào)節(jié)生物功能[3]。課題組前期進(jìn)行生物信息學(xué)分析，選擇與肺浸潤(rùn)性腺癌密切相關(guān)，且文獻(xiàn)中尚未見報(bào)道的微小RNA-153-3p(miR-153-3p)進(jìn)行研究，同時(shí)應(yīng)用TargetScan數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)到PRDM2可能是miR-153-3p的靶因子?；诖?，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，檢測(cè)肺浸潤(rùn)性腺癌組織中miR-153-3p的表達(dá)，分析其臨床及預(yù)后意義，探討miR-153-3p與PRDM2的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

選擇2016年4月至2017年12月確診為肺浸潤(rùn)性腺癌的患者56例作為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)患者均行手術(shù)治療，術(shù)后均具有明確的病理診斷，符合WHO中的標(biāo)準(zhǔn)；(2)首次確診；(3)臨床、病理及隨訪資料齊全。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)診斷有異議者或病理診斷中伴有其它異源性成分者；(2)肺手術(shù)前患者行放、化療者；(3)隨訪資料不全或家屬不同意觀察者。本組中男26例，女30例，年齡31～79歲，平均年齡(60.1±7.6)歲。其中有胸膜累犯15例，無胸膜累犯41例，腫瘤最大徑0.9～6.7cm，平均(3.2±0.9)cm。選擇腫瘤組織作為觀察組，選擇距腫瘤邊緣>3 cm的正常肺組織作為對(duì)照組，均留取術(shù)后新鮮組織(-80 ℃冰箱凍存)及石蠟包埋組織。研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，符合《赫爾辛基宣言》中的相關(guān)要求，患者或家屬已簽知情同意書。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)miR-153-3p的表達(dá)

應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法(qRT-CPR)檢測(cè)miR-153-3p的表達(dá)。基于新鮮組織進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，采用TRizol(美國(guó)Invitrogen公司)提取總RNA。引物由北京三博遠(yuǎn)志公司合成。miR-153-3p上游引物：5'-GTCAATTGAGCACGTGGCCAC-3'；下游引物：5'-GACGTACGGACTGACGGACCAC3'。以U6為內(nèi)參，引物上游：5'-GGAAGTAGCACCTGATTAGC-3＇下游：5'-TTGGAATACGAATTGGCCG-3'。逆轉(zhuǎn)錄法合成cDNA(試劑盒為北京百奧萊博公司)。PCR反應(yīng)的程序設(shè)定：95 ℃預(yù)變性30 s；變性95 ℃ 30 s，退火60 ℃ 10 s，延伸72 ℃ 30 s，共35個(gè)循環(huán)，充分延伸72 ℃ 5 min。結(jié)果以2-ΔΔCt表示。PCR儀為美國(guó)伯樂公司生產(chǎn)。

1.2.2 免疫組化法檢測(cè)PRDM2的表達(dá)

應(yīng)用免疫組化SP法檢測(cè)肺浸潤(rùn)性腺癌組織中PRDM2的表達(dá)。PRDM2為濃縮液，購(gòu)自江蘇睿贏生物技術(shù)公司，二抗和DAB購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)公司。術(shù)后標(biāo)本常規(guī)固定、脫水汲石蠟包埋后，切取4 μm切片。先按不同比例對(duì)PRDM2的濃縮液行預(yù)實(shí)驗(yàn)，選擇預(yù)實(shí)驗(yàn)中PRDM2配比濃度為1∶120顯色最理想的濃度用于正式實(shí)驗(yàn)。正式實(shí)驗(yàn)均由同一病理科技師操作，嚴(yán)格按說明書手工操作，一次性完成，DAB顯色。PRDM2的陽性部位是細(xì)胞質(zhì)和(或)細(xì)胞膜，選擇5個(gè)400倍視野(熱點(diǎn)區(qū))進(jìn)行觀察，計(jì)算陽性率的平均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 兩組中miR-153-3p表達(dá)的比較

兩組中miR-153-3p的表達(dá)量差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即觀察組中miR-153-3p的表達(dá)量明顯低于對(duì)照組(P<0.05)，見表1、圖1。

表1 兩組中miR-153-3p的表達(dá)量的比較

圖1 miR-153-3p表達(dá)(qRT-PCR法)

2.2 miR-153-3p在不同臨床病理特征分組中表達(dá)的比較

MiR-153-3p在不同腫瘤最大徑、肺膜累犯分組的表達(dá)中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而在不同性別和年齡的分組中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2 miR-153-3p在不同臨床病理特征分組中表達(dá)的比較

2.3 miR-153-3p 表達(dá)的生存分析

肺浸潤(rùn)性腺癌患者均進(jìn)行術(shù)后3年(36個(gè)月)的隨訪，隨訪方式有電話隨訪、門診隨訪及家訪，截止時(shí)間點(diǎn)為2020年12月31日。其中存活26例，死亡27例，失訪3例。死亡患者確診后的生存時(shí)間為6～36個(gè)月，中位生存時(shí)間為22個(gè)月。以miR-153-3p表達(dá)的平均值(1.36)為臨界值分組行K-M生存分析，結(jié)果顯示miR-153-3p的表達(dá)與預(yù)后相關(guān)(χ2=5.67，P=0.036)，即miR-153-3p低表達(dá)患者的預(yù)后差，見圖2。

圖2 miR-153-3p表達(dá)的生存分析

2.4 觀察組中miR-153-3p與PRDM2的相關(guān)性

TargetScan數(shù)據(jù)庫(kù)檢索顯示miR-153-3p與PRDM2具有可能結(jié)合的位點(diǎn)，見表3。免疫組化方法檢測(cè)到PRDM2的陽性率范圍是10%～70%，平均為41.1%，見圖3。相關(guān)分析顯示miR-153-3p與PRDM2呈負(fù)相關(guān)性(r=-0.69，P=0.013)，見圖4。

表3 TargetScan數(shù)據(jù)庫(kù)檢索顯示miR-153-3p與PRDM2具有可能結(jié)合的位點(diǎn)

圖3 PRDM2的表達(dá)(免疫組化SP法，200×)

圖4 miR-153-3p與PRDM2的相關(guān)性

3 討 論

肺腺癌是起源于肺上皮細(xì)胞形成的腫瘤，最肺組織中最常見的非小細(xì)胞癌，其發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，其形成與多種分子生物學(xué)通路表達(dá)異常有關(guān)。PRDM2 是近年關(guān)注的與腫瘤形成相關(guān)的因子，也稱為 Blimp2，主要通過募集轉(zhuǎn)錄共抑制因子進(jìn)而調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄[4]。PRDM2最早期的研究認(rèn)為PRDM2是調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能中B淋巴細(xì)胞向漿細(xì)胞分化的因子，進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，PRDM2可通過降低細(xì)胞的增殖和促進(jìn)T細(xì)胞的凋亡，維持T細(xì)胞之間的平衡[5]。近年學(xué)者發(fā)現(xiàn)PRDM2可能具多種生物學(xué)作用，尤其是發(fā)現(xiàn)PRDM2可以調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖，并認(rèn)為這可能是肺浸潤(rùn)性腺癌病變形成的經(jīng)典途徑[6-7]。研究顯示PRDM2異常表達(dá)是腫瘤進(jìn)展的重要調(diào)控因子，可能與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲及遷移有關(guān)[8]。PRDM2在惡性腫瘤的病變組織高表達(dá)，具有癌基因樣的作用[9-10]。但是其起作用需要更多的介導(dǎo)因子。研究認(rèn)為PRDM2的上游調(diào)控因子較多，包括miRNAs、長(zhǎng)鏈非編碼RNA、環(huán)狀RNA及經(jīng)典的蛋白調(diào)控通路[5]841-846。miRNAs的種類繁多。課題組在實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行篩查，選擇出miR-153-3p進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)miR-153-3p異常表達(dá)對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖有一定的調(diào)節(jié)作用[11-12]。miR-153-3p在正常人體組織中具有穩(wěn)定的表達(dá)狀態(tài)，而在上皮源性惡性腫瘤中常伴有miR-153-3p表達(dá)的下調(diào)[13]。miR-153-3p在腫瘤中的作用可能與抑癌基因的作用相似，miR-153-3p 對(duì)下游多種因子的靶向作用可能是其調(diào)節(jié)腫瘤形成和進(jìn)展的重要方式[14-15]。

本研究結(jié)果顯示肺浸潤(rùn)性腺癌中miR-153-3p的表達(dá)下調(diào)，提示miR-153-3p低表達(dá)是肺腺癌形成的重要分子事件。miR-153-3p在肺腺癌形成過程中發(fā)揮抑癌基因樣的作用。結(jié)果顯示MiR-153-3p在不同腫瘤最大徑、肺膜累犯分組的表達(dá)中差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示miR-153-3p 與腫瘤的生長(zhǎng)及周圍組織累犯相關(guān)，也提示miR-153-3p異常表達(dá)與腫瘤的生物學(xué)行為相關(guān)，miR-153-3p低表達(dá)時(shí)具有較高的侵襲潛能及生長(zhǎng)潛能[16-18]。生存分析發(fā)現(xiàn)miR-153-3p的表達(dá)與預(yù)后有關(guān)，提示miR-153-3p可能對(duì)判斷預(yù)后有一定價(jià)值，即miR-153-3p低表達(dá)的患者生存時(shí)間短，預(yù)后差。這種預(yù)后判斷的具體價(jià)值需要后續(xù)臨床進(jìn)行多中心、大樣本的研究來證實(shí)，并進(jìn)一步確定其判斷的臨界值。生物信息學(xué)顯示miR-153-3p和PRDM2具有結(jié)合的位點(diǎn)，相關(guān)分析顯示兩者具有負(fù)相關(guān)性，提示兩者可能具有靶向調(diào)控作用。但是此種作用需要基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)的雙熒光素酶報(bào)告基因等實(shí)驗(yàn)來進(jìn)一步證實(shí)。李冠軍等[4]58-63通過在膀胱癌中研究，發(fā)現(xiàn)miR-153與PRDM2具有靶向作用，其能通過JAK/STAT信號(hào)通路影響膀胱癌的侵襲和遷移，此研究與研究的結(jié)論具有相似性。miR-153-3p異常表達(dá)可以活化PRDM2的表達(dá)，目前認(rèn)為PRDM2在體內(nèi)有2種啟動(dòng)子，外部啟動(dòng)子產(chǎn)物為PRDM2，但是當(dāng)其甲基化后則影響后續(xù)的轉(zhuǎn)錄作用[8]2991-3002。PRDM2作為一種癌基因，可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞增殖活性的改變，介導(dǎo)同質(zhì)型粘附能力下降，細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng)，侵襲和遷移能力增強(qiáng)[19]。Sun等[20]通過在膠質(zhì)瘤中研究miR-153-3p的表達(dá)特征，發(fā)現(xiàn)miR-153-3p可能通過調(diào)控Bcl-2介導(dǎo)腫瘤的凋亡作用。miR-153-3p還可能通過對(duì)下游FOXO3等基因的靶向調(diào)控發(fā)揮作用[16]105126。因此miR-153-3p的作用方式及作用途徑復(fù)雜，但是miR-153-3p調(diào)控的具體作用及在肺腺癌中的作用尚需要更多基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)來進(jìn)一步明確[21-22]。

綜上所述，MiR-153-3p在肺浸潤(rùn)性腺癌中的表達(dá)下降，其與病變的形成和進(jìn)展有關(guān)。MiR-153-3p與PRDM2可能具有協(xié)同負(fù)向作用。術(shù)后檢測(cè)MiR-153-3p的表達(dá)可能對(duì)判斷預(yù)后有一定作用。