杜天宇，肖旭陽

(錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，遼寧 錦州 121000)

肺癌目前是我國最常見的惡性腫瘤，在中國每年肺癌新發(fā)病例73.33萬人，死亡病例61.02萬人，居惡性腫瘤發(fā)病率及死亡率的首位[1]。隨著人們體檢意識增強(qiáng)，肺腺癌的檢出率、發(fā)病率逐漸提升，因此肺腺癌的發(fā)生、發(fā)展、耐藥等基礎(chǔ)研究一直是腫瘤研究中的熱點(diǎn)。

Rac 3是一種分子量為21 kd的小分子蛋白，屬于Rac家族成員，該家族被認(rèn)為是細(xì)胞骨架的重要調(diào)節(jié)因子，在神經(jīng)發(fā)育及腫瘤中起到重要作用[2]。Rac 3在肺癌中表達(dá)增高，沉默Rac 3后影響肺腺癌A549細(xì)胞的侵襲、遷移、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，抑制增殖并促進(jìn)凋亡[3-5]。自噬是一種高度保守的生物學(xué)過程，在腫瘤生存條件惡劣時可以提供必要的養(yǎng)分供細(xì)胞生存，而另一方面自噬可誘導(dǎo)凋亡，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的死亡。Rac 3能在多種細(xì)胞系內(nèi)引起自噬[6]，但是探討Rac 3對肺癌自噬影響的研究較少，相關(guān)機(jī)制仍不明確。

CRISPR/cas9是一種新興的基因編輯技術(shù)，在小向?qū)NA(small guide RNA，sgRNA)的作用下可以切斷DNA雙鏈，并在基因組受損修復(fù)過程中發(fā)生移碼突變，從而達(dá)到敲除基因的效果[7]。本研究使用CRISPR/cas9技術(shù)，敲除肺腺癌A549細(xì)胞中的Rac 3基因并構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞系，并建立Rac 3過表達(dá)細(xì)胞株，探討Rac 3對肺腺癌自噬的影響及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)和主要試劑

1.1.1 細(xì)胞培養(yǎng)：肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549購自中科院細(xì)胞庫，用含10%胎牛血清的RPMI-1640，于37 ℃、5% CO2的恒溫恒濕培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑：Addgene購買質(zhì)粒pSpCas9(BB)-2A-Puro (PX459，Plasmid #48139)，Rac 3抗體夠自ABCam，SQSTM-1/p62、AMPKα購自萬類生物，LC3、Phospho-AMPKα、ERK 1/2、Phospho-ERK 1/2購自CST，AKT、Phospho-AKT、MAGEA6購自ProteinTech。

1.2 puro-cas9-Rac 3-sgRNA質(zhì)粒的構(gòu)建

1.2.1 sgRNA的設(shè)計與合成：通過在線工具(https://zlab.bio/guide-design-resources)設(shè)計2條sgRNA，分別位于第2、3外顯子，序列分別為：sgRNA1#：5’-CGGTGGGGATGTACTCTCCG-3’和sgRNA2#：5’-CGGGTCAGGAGGACTACGAT-3’。sgRNA的正義鏈及反義鏈由Takara公司合成，收到的2對寡核苷酸鏈常規(guī)退火。

1.2.2 sgRNA載體構(gòu)建：PX459質(zhì)粒使用BbsI酶37 ℃酶切1 h，T4連接酶16 ℃過夜連接，導(dǎo)入到感受態(tài)細(xì)胞DH5α凃板，挑菌提取質(zhì)粒，BbsI酶切后產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，選取不含酶切位點(diǎn)的質(zhì)粒送堿基測序驗證。

1.3 Rac 3敲除及過表達(dá)A549細(xì)胞株的建立

1.3.1 敲除質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及單克隆提?。嘿|(zhì)粒使用Lipofectamine 3000試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染，用篩選培養(yǎng)基(嘌呤霉素濃度1 μg/mL)篩選72 h后轉(zhuǎn)為維持濃度繼續(xù)培養(yǎng)，鏡下觀察單個細(xì)胞形成約含50個細(xì)胞的細(xì)胞集落時，消化稀釋細(xì)胞濃度至0.5個/微升，按2 微升/孔接種到96孔板內(nèi)，標(biāo)記出單個細(xì)胞的孔并加培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，約7 d后對標(biāo)記的單克隆消化、擴(kuò)大培養(yǎng)及鑒定。

1.3.2 Rac 3敲除細(xì)胞株的鑒定：根據(jù)sgRNA位置設(shè)計PCR引物，分別為：sgRNA1#(5’-CTTAGGTCGCCACGGATCTG-3’，5’-CTAGAACTCTGGCCAGCACC-3’)和sgRNA2#(5’-GGTGCTGGCCAGAGTTCTA-3’，5’-GGCTCACCAGAGAGAAGCAG-3’)。PCR產(chǎn)物使用T7EI酶于37 ℃反應(yīng)20 min后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，選取存在編輯的樣本送生物公司測序。

1.3.3 Rac 3過表達(dá)慢病毒感染A549細(xì)胞：Rac 3過表達(dá)慢病毒HBLV-h-RAC3-3xflag-NEO由上海漢恒公司包裝，A549細(xì)胞接種于96孔板，向孔內(nèi)加入慢病毒，隨后用含G418培養(yǎng)基(800 μg/mL)進(jìn)行篩選，72 h后降至維持濃度并擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.4 EBSS饑餓法誘導(dǎo)自噬

待檢測細(xì)胞按每個平皿按照1×106接種入10 cm培養(yǎng)皿中，至細(xì)胞融合約70%時棄液，PBS清洗2次后加入EBSS 10 mL，于37 ℃ 5%CO2的孵箱內(nèi)，培育4 h后提取蛋白進(jìn)行鑒定。

1.5 Western Blot檢測蛋白表達(dá)

待檢測的各細(xì)胞株在細(xì)胞融合至約70%時，用含PMSF及磷酸酶抑制劑的RIPA細(xì)胞裂解液提取蛋白，并采用BCA法進(jìn)行定量。各組進(jìn)行SDS-PAGE電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%BSA封閉，4 ℃搖床過夜孵育一抗，二抗室溫孵育，ECL化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行顯影。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

采用GraphPad Prism 7.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，采用t檢驗進(jìn)行比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 sgRNA的設(shè)計

從NCBI獲得人源Rac 3蛋白的cDNA，使用在線工具分別于第2、3外顯子上設(shè)計sgRNA1#和sgRNA2#，確保當(dāng)基因編輯導(dǎo)致移碼突變時，所有的Rac 3轉(zhuǎn)錄本都不能正確翻譯，以達(dá)到敲除的效果，見圖1。

圖1 通過在線工具設(shè)計sgRNA序列

2.2 Rac 3敲除的驗證

將含有puro-cas9-sgRNA1#和puro-cas9-sgRNA2#的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入A549細(xì)胞中，單克隆篩選后進(jìn)行T7E1酶切實(shí)驗。由sgRNA1#、sgRNA2#介導(dǎo)的Rac 3敲除細(xì)胞株分別記為KO1、KO2。T7E1酶切實(shí)驗中KO1和KO2細(xì)胞株的PCR產(chǎn)物都被切成了大小不同的兩條帶，證實(shí)基因組DNA存在錯配，即兩種sgRNA都對基因組DNA進(jìn)行了編輯。將發(fā)生基因編輯的KO1和KO2細(xì)胞株送測序，提示KO1存在2個堿基丟失，KO2存在35個堿基丟失，均達(dá)到移碼突變的效果，見圖2。

圖2 T7E1酶切實(shí)驗及Sanger測序驗證Rac 3基因編輯

2.3 Western Blot驗證Rac 3的敲除及過表達(dá)

對KO1、KO2兩珠Rac 3敲除細(xì)胞株及慢病毒過表達(dá)Rac 3細(xì)胞株(OE)提取蛋白進(jìn)行Western Blot檢測，提示與野生型A549細(xì)胞(WT)相比，KO1、KO2細(xì)胞株的中Rac 3蛋白被完全敲除了，OE細(xì)胞株表達(dá)Rac 3-3xflag，且Rac 3表達(dá)水平明顯高于WT組，見圖3。

**P<0.01

2.4 EBSS誘導(dǎo)自噬后LC3、SQSTM-1/p62的表達(dá)

經(jīng)過EBSS誘導(dǎo)自噬4 h后提取蛋白。與未誘導(dǎo)的WT組A549細(xì)胞相比，EBSS誘導(dǎo)后各細(xì)胞株的LC3 II及LC3 II/I的比值升高。EBSS誘導(dǎo)后，KO1和KO2兩組的LC3 II、LC3 II/I比值均高于WT組，SQSTM-1/p62低于WT組，OE組的LC3 II、LC3 II/I比值低于WT型，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義。提示在肺腺癌A549細(xì)胞中，Rac 3敲除后自噬被激活，Rac 3過表達(dá)自噬受到抑制，見圖4。

*P<0.05；**P<0.01

2.5 雙向調(diào)控Rac 3后相關(guān)蛋白表達(dá)的變化

EBSS誘導(dǎo)自噬后，對各組進(jìn)行Western Blot檢測活化的caspase3、MAGEA6、AKT及其磷酸化蛋白、ERK 1/2及其磷酸化蛋白、AMPK及磷酸化蛋白的變化。在Rac 3敲除后，MAGEA6表達(dá)下降，AMPKα及磷酸化AMPKα的表達(dá)增強(qiáng)，caspase3活化增強(qiáng)；在Rac 3過表達(dá)后，MAGEA6表達(dá)升高，AMPKα及磷酸化AMPKα表達(dá)降低，caspase3活化減弱。Rac 3表達(dá)出現(xiàn)變化后AKT和ERK1/2變化不顯著。提示EBSS誘導(dǎo)自噬，Rac 3敲除可以促進(jìn)凋亡，并且降低MAGEA6的表達(dá)，促進(jìn)AMPKα的表達(dá)及磷酸化水平，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞自噬，而Rac 3過表達(dá)則相反，見圖5。

*P<0.05；**P<0.01

3 討 論

本研究通過CRISPR/cas9技術(shù)敲除肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549中的Rac 3基因，使用慢病毒感染的方法過表達(dá)了A549細(xì)胞中的Rac 3基因，再以EBSS誘導(dǎo)自噬的方法，確定了Rac 3抑制A549細(xì)胞的自噬，并初步明確了Rac 3是通過MAGEA6/AMPKα途徑影響肺腺癌自噬。簇狀規(guī)則間隔的短回文重復(fù)序列(CRISPR)是一種廣泛存在于微生物內(nèi)的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，在進(jìn)行工程化后的CRISPR/cas9技術(shù)具有快速、低成本、高效、拓展性高等特點(diǎn)[7]。CRISPR/cas9技術(shù)是通過設(shè)計sgRNA引導(dǎo)cas9蛋白靶向切割基因組DNA達(dá)到DNA雙鏈斷裂，隨后細(xì)胞以非同源末端連接的方式修復(fù)基因組DNA，在這一過程中有概率發(fā)生堿基的插入或丟失并導(dǎo)致移碼突變，從而達(dá)到敲除基因的效果[8]。sgRNA序列通常為在線工具所設(shè)計，因存在與其他基因相似序列結(jié)合的可能，故CRISPR/cas9基因編輯存在脫靶的風(fēng)險并導(dǎo)致實(shí)驗結(jié)論的錯誤[9]。本研究通過設(shè)計兩個位于不同外顯子的sgRNA，并設(shè)立過表達(dá)組來減少該類誤差。

Rac 3是小分子GTPase，這類蛋白常在細(xì)胞中起到分子開關(guān)的作用，目前已知其在腫瘤及神經(jīng)發(fā)育中起到重要作用。既往的研究表明，在膀胱癌中Rac 3通過PYCR1/JAK/STAT通路促進(jìn)增殖、遷移和侵襲性[10]，在肺癌中沉默Rac 3能抑制細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[4]3061-3065，并且Rac 3可以通過p38 MAPK途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移、侵襲和EMT[3]2511-2522，在乳腺癌中沉默Rac 3導(dǎo)致侵襲性減少[11]，Rac 3過表達(dá)誘導(dǎo)促生長和促遷移的基因，并且提示ERα陽性乳腺癌預(yù)后不良[12]。Rac 3在結(jié)腸癌中可以維持和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞干性，并可以誘導(dǎo)非腫瘤細(xì)胞向腫瘤轉(zhuǎn)化[13]。Rac 3還可以增強(qiáng)宮頸癌細(xì)胞對順鉑的耐藥[14]。自噬是目前的一個研究熱點(diǎn)，在腫瘤細(xì)胞中自噬既可以保護(hù)腫瘤生存，同時也可以促進(jìn)凋亡，而Rac 3被發(fā)現(xiàn)在多種細(xì)胞系中可以抑制自噬[6]35291-35298。我們研究發(fā)現(xiàn)在A549細(xì)胞中敲除Rac 3可以促進(jìn)LC3 I型向II型轉(zhuǎn)化、p62積累水平降低及促進(jìn)caspase3活化，而相反的過表達(dá)Rac 3抑制LC3 I型向II型轉(zhuǎn)化并抑制caspase3活化。這提示Rac 3對肺腺癌的自噬及凋亡起抑制的作用。在前期的預(yù)實(shí)驗中，我們對Rac 3敲除及過表達(dá)的細(xì)胞株做了RNA-Seq，篩選得到4個差異基因ADAMTS2、GABRA3、MAGEA6及CSRNP3，通過預(yù)實(shí)驗驗證及查詢文獻(xiàn)，我們推測Rac 3對自噬的抑制與MAGEA6基因有關(guān)。

MAGEA6是黑色素瘤抗原家族的成員，該家族成員在真核生物中保守，在腫瘤中常被異常激活。MAGEA6沉默在膠質(zhì)瘤、腎細(xì)胞癌等多種腫瘤中直接上調(diào)AMPKα表達(dá)及磷酸化并抑制mTORC1通路[15-16]。MAGEA3/6可以特異性的結(jié)合TRIM28 E3泛素連接酶，導(dǎo)致AMPKα的泛素化降解[17]。在我們的研究中觀察到，當(dāng)Rac 3敲除后MAGEA6表達(dá)隨之降低，這導(dǎo)致了AMPKα泛素化降解的減少，AMPKα及其磷酸化水平的增高。AMPKα磷酸化水平增高會抑制mTORC1的活性，從而解除了mTOR通路對自噬的抑制，導(dǎo)致自噬的增強(qiáng)[18-19]。當(dāng)過表達(dá)Rac 3后，MAGEA6表達(dá)隨之升高，這導(dǎo)致AMPKα降解的增加及活性降低，從而導(dǎo)致mTOR通路被激活，抑制自噬。在肺癌等多種腫瘤中，Rac 3表達(dá)水平上升，這也就導(dǎo)致MAGEA6的高表達(dá)，進(jìn)而抑制AMPKα并激活mTOR通路，導(dǎo)致自噬被抑制，從而達(dá)到減少凋亡、促進(jìn)細(xì)胞成活的目的。但是Rac 3是如何調(diào)控MAGEA6的機(jī)制目前尚不確認(rèn)，有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)Rac 3可以上調(diào)MAGEA6的表達(dá)水平，抑制AMPKα表達(dá)及活性，激活mTOR信號通路，抑制自噬及凋亡，從而達(dá)到使肺腺癌細(xì)胞成活的目的。這提示Rac 3在肺腺癌中起到重要作用，可能會為肺癌的治療提供新的靶標(biāo)。