孫 娜，耿 鵬，趙凌舟，龔佳麗，邢 巖，陳志鋼，趙晉華

1. 上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，上海 200080；

2. 東華大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，上海 201620

腦膠質(zhì)瘤是最常見(jiàn)的顱內(nèi)原發(fā)性惡性腫瘤，呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，術(shù)后復(fù)發(fā)率高，且易對(duì)放化療產(chǎn)生抵抗，目前臨床治療效果不佳［1-3］。納米材料二氧化鈦（TiO2）是金屬鈦（Ti）最常見(jiàn)的化合物。既往研究［4］發(fā)現(xiàn)，TiO2在正電子核素18F的切倫科夫輻射下可產(chǎn)生大量的活性氧類（reactive oxygen species，ROS），能有效地殺傷腫瘤細(xì)胞，具有優(yōu)異的光動(dòng)力治療效果。2017年，Yu等［5］向TiO2中摻雜元素鈮（Nb）合成了鈮-二氧化鈦（Nb0.12-TiO2），發(fā)現(xiàn)Nb0.12-TiO2可在近紅外光（near-infrared light，NIR）的激發(fā)下將光能迅速轉(zhuǎn)換為熱能，有潛力用于腫瘤的光熱治療。此外，Cheng等［6］的研究表明，光敏劑用于腫瘤的光熱治療時(shí)，或許可以在有效殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)下調(diào)低氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）的表達(dá)，改善腫瘤的乏氧微環(huán)境，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。乏氧是腦膠質(zhì)瘤微環(huán)境的主要特點(diǎn)之一，與腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和放化療抵抗密切相關(guān)［7-9］。本研究擬初步評(píng)估Nb0.12-TiO2對(duì)腦膠質(zhì)瘤的光熱治療效果，并同時(shí)探討其對(duì)HIF-1α表達(dá)水平的影響。

1 材料與方法

1.1 一般材料

人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞（U87細(xì)胞）購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)/中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心，將U87細(xì)胞置于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中，于37 °C、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%、飽和濕度的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。

1.2 試劑與儀器

Nb0.12-TiO2由東華大學(xué)纖維材料改性國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇｛1, 2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-［square（polyethylene glycol）］，DSPE-PEG｝購(gòu)自上海炎怡生物科技有限公司，油酸、十八烯、十八醇、氯化鈮購(gòu)自Sigma-Aldrich（上海）貿(mào)易有限公司，四乙醇鈦、氯仿、丙酮、甲醇購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，X射線衍射儀（X-ray diffractometer，XRD）購(gòu)自布魯克（北京）科技有限公司，透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM）購(gòu)自美國(guó)FEI公司，電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜儀（inductively coupled plasma-atomic emission spectrometer，ICP-AES）購(gòu)自美國(guó)Leeman Labs公司，胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、磷酸鹽緩沖生理鹽水（phosphatebuffered saline，PBS）購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）購(gòu)自東仁化學(xué)科技（上海）有限公司，活死細(xì)胞雙染試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，TRIzol總RNA提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，引物和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（realtime fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）試劑盒購(gòu)自上海冠泰生物科技有限公司（BioTNT）。激光器購(gòu)自西安赫胥爾鐳得激光科技有限公司，酶標(biāo)儀購(gòu)自德國(guó)Thermo Fisher Scienti fic公司，激光掃描共聚焦顯微鏡購(gòu)自美國(guó)Thorlabs公司，PCR儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 Nb0.12-TiO2的制備和表面改性

在連續(xù)的干燥氮?dú)饬髦校瑢⒂退幔? mL）、十八烯（7 mL）和十八醇（20 mmol）混合物加熱至130 ℃并保持30 min，去除殘存的水汽和氧氣。然后將溶液冷卻至80 ℃，先后加入四乙醇鈦（2 mmol）和氯化鈮甲醇溶液（0.4 mmol）。待甲醇完全蒸發(fā)后，在30 min內(nèi)將上述溶液升溫至280 ℃以上，并在此溫度下保持60 min使納米晶體生長(zhǎng)，溶液變成藍(lán)色。隨后，將體系自然冷卻至80 ℃，加入適量丙酮，快速離心（5 000 r/min，5 min）后得到深藍(lán)色沉淀，即Nb摻雜TiO2納米晶。當(dāng)前驅(qū)體中氯化鈮和四乙醇鈦的摩爾比為20%，使用ICP-AES確定合成的納米晶樣品中的Nb/（Nb+Ti）摩爾比為12.2%，該樣品命名為Nb0.12-TiO2。所合成的Nb0.12-TiO2納米晶表面是油酸配位，不能分散在水中。為了獲得親水性，將20 mg Nb0.12-TiO2納米晶與50 mg DSPE-PEG分散在10 mL氯仿溶液中，超聲10 min后，在室溫條件下持續(xù)磁力攪拌氯仿分散液，使其緩慢蒸發(fā)。隨后，將5 mL去離子水加入到脂質(zhì)膜中并超聲處理10 min，將水分散液低速離心（3 500 r/min，20 min）以除去可能形成的大聚集體，高速離心（10 000 r/min，10 min）以純化可能的過(guò)量脂質(zhì)，最終得到磷脂包裹的納米晶體（記為Nb0.12-TiO2/PEG）。之后對(duì)Nb0.12-TiO2的表征、分散性能和光熱轉(zhuǎn)換性能等進(jìn)行分析。

1.3.2 CCK-8法測(cè)定Nb0.12-TiO2對(duì)U87細(xì)胞的毒性

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U87細(xì)胞，以每孔5×103個(gè)接種于96孔板上，在37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的無(wú)菌細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過(guò)夜，吸棄96孔板各孔內(nèi)的舊培養(yǎng)基，加入含不同Nb0.12-TiO2質(zhì)量濃度（0.02、0.10、0.50、1.00、5.00 g/L）的新鮮完全培養(yǎng)基，同時(shí)設(shè)立PBS對(duì)照組和空白對(duì)照組，以上各組均設(shè)立5個(gè)復(fù)孔，加樣結(jié)束后置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的無(wú)菌細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)靜置溫育24 h，之后按照CCK-8說(shuō)明進(jìn)行測(cè)定。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次以確認(rèn)結(jié)果。

1.3.3 活死細(xì)胞染色評(píng)估Nb0.12-TiO2對(duì)U87細(xì)胞的殺傷作用

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期U87細(xì)胞，以每孔1×104個(gè)接種于6孔板上，在37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的無(wú)菌細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)過(guò)夜，棄去各皿內(nèi)的舊培養(yǎng)基，加入新鮮的完全培養(yǎng)基，隨機(jī)分為PBS組、Nb0.12-TiO2組、PBS + NIR組和Nb0.12-TiO2+NIR組，PBS作為對(duì)照組，Nb0.12-TiO2組和Nb0.12-TiO2+NIR組的終質(zhì)量濃度為0.2 g/L，之后繼續(xù)在無(wú)菌細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)4 h，PBS+NIR組和Nb0.12-TiO2+NIR組均以功率密度為1.0 W/cm2的1 064 nm波長(zhǎng)NIR照射10 min，之后各組細(xì)胞按照活死細(xì)胞雙染色試劑盒說(shuō)明進(jìn)行染色，并置于激光共聚焦顯微鏡下488 nm處觀察各皿內(nèi)細(xì)胞的熒光亮度，在同一放大倍數(shù)（×20）下拍攝圖像并存儲(chǔ)。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次以確認(rèn)結(jié)果。

1.3.4 Nb0.12-TiO2介導(dǎo)的光熱治療對(duì)U87細(xì)胞HIF-1α基因表達(dá)水平的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期U87細(xì)胞，以每孔1×105個(gè)接種于6孔板上，在37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的無(wú)菌細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)過(guò)夜，棄去各皿內(nèi)的舊培養(yǎng)基，加入新鮮的完全培養(yǎng)基，隨機(jī)分為PBS組、Nb0.12-TiO2組、PBS+NIR組和Nb0.12-TiO2+NIR組，PBS作為對(duì)照組，Nb0.12-TiO2組和Nb0.12-TiO2+NIR組的終質(zhì)量濃度為0.2 g/L，之后繼續(xù)在無(wú)菌細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)4 h，PBS+NIR組和Nb0.12-TiO2+NIR組均以功率密度為1.0 W/cm2的1 064 nm波長(zhǎng)NIR照射10 min，之后對(duì)各組細(xì)胞提取RNA，RTFQ-PCR法評(píng)估各組細(xì)胞HIF-1α的基因表達(dá)水平，引物序列見(jiàn)表1。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次以確認(rèn)結(jié)果。

表1 RTFQ-PCR引物序列

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 Nb0.12-TiO2的表征分析

使用XRD研究TiO2納米晶的晶相，如圖1A所示，純的TiO2納米晶和Nb摻雜的TiO2納米晶樣品都顯示出同樣的衍射峰圖形，且所有衍射峰與銳鈦礦相TiO2標(biāo)準(zhǔn)卡片［粉末衍射標(biāo)準(zhǔn)聯(lián)合委員會(huì)（the Joint Committee on Powder Diffraction Standards，JCPDS）標(biāo)準(zhǔn)卡片編號(hào)為21-1272］的衍射峰匹配一致，表明兩者具有相同的TiO2納米晶。對(duì)于Nb0.12-TiO2摻雜樣品，并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)任何其他雜峰，結(jié)果表明，Nb5+離子被成功地?fù)诫s到了TiO2的晶格中，但是因?yàn)閮煞N元素離子半徑比較接近，所以摻雜并未明顯改變TiO2基質(zhì)晶格。

動(dòng)態(tài)光散射（dynamic light scattering，DLS）結(jié)果顯示，去離子水中Nb0.12-TiO2的平均動(dòng)力學(xué)直徑約為30 nm，最終修飾改性后的Nb0.12-TiO2/PEG的直徑約為80 nm（圖1B），兩者均顯示出較小的納米級(jí)水動(dòng)力學(xué)直徑。

TEM結(jié)果表明，Nb0.12-TiO2樣品由直徑約為20 nm的納米顆粒組成，這些小納米顆粒沒(méi)有具體的形狀（圖1C）。Nb0.12-TiO2納米晶表面是油酸配位，不能分散在水中，而經(jīng)過(guò)改性后的Nb0.12-TiO2/PEG可以很好地分散在水溶液中（圖1D），且與本課題組之前已發(fā)表的研究［5］報(bào)道一致，Nb0.12-TiO2納米晶的光熱轉(zhuǎn)換效率為40.6%，高于典型的半導(dǎo)體。這么高的光熱轉(zhuǎn)換效率應(yīng)歸因于Nb摻雜TiO2納米晶的強(qiáng)近紅外吸收和高效的非輻射躍遷。以上結(jié)果證實(shí)Nb摻雜的TiO2納米晶體具有優(yōu)異的光熱性能和激光穩(wěn)定性，賦予其在光熱治療中的巨大潛力。

2.2 CCK-8法檢測(cè)

Nb0.12-TiO2（0.02～5.00 g/L）與U87細(xì)胞共培養(yǎng)24 h后，各組細(xì)胞活性均大于90%，與PBS組的組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖2）。由此可見(jiàn)Nb0.12-TiO2在0.02～5.00 g/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)對(duì)U87細(xì)胞無(wú)明顯的毒性作用。

圖2 CCK-8法檢測(cè)不同質(zhì)量濃度的Nb0.12-TiO2對(duì)U87細(xì)胞活性的影響

2.3 活死細(xì)胞染色

PBS組、Nb0.12-TiO2組和PBS+NIR組未出現(xiàn)明顯的細(xì)胞凋亡，而Nb0.12-TiO2+NIR組出現(xiàn)大量細(xì)胞死亡（圖3），說(shuō)明Nb0.12-TiO2對(duì)腦膠質(zhì)瘤具有顯著的光熱治療效果。

圖3 活死細(xì)胞染色評(píng)估Nb0.12-TiO2對(duì)U87細(xì)胞的殺傷作用

2.4 RTFQ-PCR實(shí)驗(yàn)

Nb0.12-TiO2+NIR組HIF-1α的表達(dá)大幅下調(diào)，與PBS組（0.52 ± 0.20vs1.00±0.00，P＜0.001）、Nb0.12-TiO2組（0.52±0.20vs0.99±0.07，P＜0.001）和PBS+NIR組（0.52±0.20vs1.01±0.03，P＜0.001）的組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖4）。

圖4 RTFQ-PCR評(píng)估Nb0.12-TiO2光熱治療后U87細(xì)胞的HIF-1α基因水平

3 討 論

腦膠質(zhì)瘤是最常見(jiàn)的顱內(nèi)原發(fā)性惡性腫瘤，但目前尚無(wú)有效的治療方法。光動(dòng)力治療與光熱治療是近年來(lái)新興的治療方法，因其具有創(chuàng)傷小、治療時(shí)間短且不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)而引起了研究者的廣泛關(guān)注［10-12］。

納米材料TiO2作為金屬鈦?zhàn)畛Ｒ?jiàn)的化合物，合成簡(jiǎn)便、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、價(jià)廉易得，且與已經(jīng)廣泛應(yīng)用于醫(yī)用植入物的金屬Ti相似，具有優(yōu)異的生物相容性［13-14］。Yamaguchi等［15］將TiO2納米顆粒與腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞共培養(yǎng)3 h后，在紫外光照射下超過(guò)90%的腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞出現(xiàn)死亡或生長(zhǎng)抑制，治療效果顯著。然而紫外光穿透能力弱，且長(zhǎng)時(shí)間紫外光照射會(huì)損傷機(jī)體DNA甚至誘發(fā)癌變，因而限制了TiO2在腦膠質(zhì)瘤中的進(jìn)一步應(yīng)用。Kotagiri等［4］以正電子核素18F的切倫科夫輻射可激活TiO2的光動(dòng)力學(xué)效應(yīng)開(kāi)展研究，體內(nèi)治療試驗(yàn)顯示纖維肉瘤裸小鼠移植瘤模型的腫瘤體積在18F激發(fā)的TiO2的光動(dòng)力治療后第3天縮小40%左右，1個(gè)月后腫瘤完全消失，4個(gè)月后達(dá)到完全緩解，說(shuō)明光動(dòng)力治療效果顯著。2017年Yu等［5］合成了Nb0.12-TiO2，發(fā)現(xiàn)Nb0.12-TiO2在常溫條件下NIR光照10 min即可快速升溫至50 ℃以上，說(shuō)明光熱轉(zhuǎn)換能力顯著優(yōu)于傳統(tǒng)的光敏劑。本研究結(jié)果表明，TiO2在摻雜Nb后仍有很高的生物相容性，且Nb0.12-TiO2在NIR照射下可有效地殺傷腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞，光熱治療效果顯著。

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與腫瘤微環(huán)境的變化密切相關(guān)，乏氧是腦膠質(zhì)瘤微環(huán)境的主要特點(diǎn)之一。乏氧不僅使腦膠質(zhì)瘤自身更具侵襲性，而且與腦膠質(zhì)瘤的放化療抵抗密切相關(guān)。HIF-1α在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)受氧濃度的調(diào)節(jié)，在常氧條件下，HIF-1α?xí)豢焖俳到猓诜ρ鯒l件下，HIF-1α保持穩(wěn)定并進(jìn)入細(xì)胞，激活多種下游基因如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-1（glucose transporter-1，Glut-1）等的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)、增殖和遷移［16-19］。Gillespie等［20］在顱內(nèi)原位腦膠質(zhì)瘤模型中利用HIF-1α siRNA抑制HIF-1α的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)治療50 d后腫瘤體積較對(duì)照組減少了79%，且HIF-1α的轉(zhuǎn)錄靶向分子VEGF、Glut-1的表達(dá)也顯著降低。由此可見(jiàn)，改善腦膠質(zhì)瘤的乏氧微環(huán)境有利于腦膠質(zhì)瘤的治療。本研究結(jié)果表明，光敏劑Nb0.12-TiO2在對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞發(fā)揮光熱治療作用的同時(shí)顯著下調(diào)了HIF-1α的表達(dá)，或可改善腦膠質(zhì)瘤的乏氧微環(huán)境。

綜上所述，Nb0.12-TiO2作為一種新型光敏劑，具有優(yōu)異的光熱治療效果，并可在發(fā)揮光熱治療時(shí)抑制HIF-1α的表達(dá)，改善腦膠質(zhì)瘤的乏氧微環(huán)境，有望在將來(lái)用于腦膠質(zhì)瘤的臨床治療。