張丹妮，王洪新

錦州醫(yī)科大學心腦血管藥物研究重點實驗室，遼寧 錦州 121001

糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）是影響人類健康的一種代謝紊亂疾病，已成為腫瘤和心血管病之后最重要的非傳染病。專家預(yù)測2030年全球糖尿病患者可達4億[1]。DM可從3個方面影響心血管健康，心自主神經(jīng)性病變，加速冠狀動脈疾病進展和糖尿病心肌病[2]。心血管疾病是DM最常見的并發(fā)癥，占糖尿病患者死亡率和發(fā)病率的2/3以上，糖尿病患者心力衰竭的發(fā)病率達19%～26%[3]。因此，對糖尿病患者延緩和減輕心血管疾病的發(fā)生是十分必要且迫切的。高血糖是糖尿病心肌?。╠iabetic cardiomyopathy，DCM）發(fā)生的主要誘因。DCM的發(fā)展過程中，高糖和血脂異?？梢酝ㄟ^直接調(diào)節(jié)心肌細胞內(nèi)信號通路誘導(dǎo)細胞中粘附分子，細胞因子和趨化因子分泌增多[4]，導(dǎo)致心肌出現(xiàn)低度慢性炎癥。炎癥在DCM起著很大的作用；控制炎癥以及調(diào)控相關(guān)的炎癥通路或許能改善或者預(yù)防DCM發(fā)生。肌肽（caenosine，Car）是由β-丙氨酸和L-組氨酸構(gòu)成由酶促合成的內(nèi)源二肽[5]，具有抗衰老、抗氧化和抗糖基化作用[6]。肌肽是一種直接作用的低分子量親水抗氧化劑，研究證明，在接近生理濃度（20～50 mmol/L）的培養(yǎng)基中加入肌肽可以延長細胞的壽命[7]。這些肽含有L-組氨酸的具緩沖作用的咪唑環(huán)，還含有高反應(yīng)性親核胺，賦予它們與多種脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物（如HNE和丙烯醛）結(jié)合的能力[8]。肌肽在心肌表達水平較高，然而糖尿病大鼠心肌肽含量降低[9]，提示肌肽對大鼠心具有保護作用，但是具體分子機制不清楚。本實驗通過高糖誘導(dǎo)建立心肌細胞損傷模型，觀察肌肽對H9C2心肌細胞的保護作用以及潛在的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

H9C2心肌細胞系由實驗室保存，購自上海桑戈生物科技有限公司。肌肽（純度＞98%，蘇州富士萊醫(yī)藥股份有限公司）；二氫乙錠（南京百鑫德諾生物科技有限公）；二甲基亞砜（DMSO）、噻唑藍（MTT）、胰蛋白酶（美國Sigma公司）；低糖DMEM 培養(yǎng)基（Hyclone公司）；胎牛血清（Gbico公司）；青鏈霉素混合液（Solarbio公司）；IL-1β、IL-6、TNF-αELISA試劑盒（美國R&D公司）；細胞核蛋白與細胞漿蛋白抽提試劑盒（萬類生物公司）；MDA、SOD測定試劑盒（南京建成生物工程有限公司）；LDH、AST測定試劑盒（萬類生物公司）；bcl-2、bax、p65、IκB-α、lamin B、GAPDH一抗、Goat anti-Rabbit（Proteintech公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 H9C2心肌細胞培養(yǎng) 將H9C2心肌細胞用添加了10%胎牛血清，青霉素（100 U/L）和鏈霉素（100 U/L）的低糖DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2、95%O2的無菌孵箱中培養(yǎng)。當細胞占培養(yǎng)瓶80%～90%時，進行細胞傳代或收集細胞以及培養(yǎng)液作為對照組。細胞傳代，用0.25%胰酶消化5～10 min，鏡下觀察大約80%的細胞形狀變成近乎圓形時，加入完全培養(yǎng)基終止胰酶消化，用移液管輕輕吹打，將細胞從培養(yǎng)瓶壁上吹下來，并使其成為單細胞懸液，將細胞懸液放置離心管中離心5 min，棄上清，加入培養(yǎng)基，吹打混勻，接種至培養(yǎng)瓶中，放置于37℃、5%CO2、95%O2的無菌孵箱中培養(yǎng)。次日換液。根據(jù)細胞的生長情況，每2～3 d進行傳代。

1.2.2 H9C2心肌細胞分組 將H9C2心肌細胞隨機分為：正常低糖對照組（5.5 mmol/L葡萄糖）；高糖模型組（50 mmol/L葡萄糖）；甘露醇組（甘露醇15 mmol/L）；（肌肽5 mmol/L+50 mmol/L葡萄糖）組；（肌肽15 mmol/L+50 mmol/L葡萄糖）組。對數(shù)生長期的細胞，換用無血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，按各實驗組條件更換培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后進行后續(xù)實驗。

1.2.3 MTT法 各實驗組按條件持續(xù)培養(yǎng)，每孔加入20μl MTT（0.5 mg/ml），37℃培養(yǎng)箱中孵育4 h，吸出含MTT的培養(yǎng)液，每孔加150μl DMSO，搖床反應(yīng)10 min，酶標儀測定490 nm波長處吸光度A。與空白對照組的百分比表示細胞活力。

1.2.3 二氫乙錠檢測H9C2心肌細胞ROS 各實驗組按條件持續(xù)培養(yǎng)48 h后，吸出96孔板里的培養(yǎng)液，用PBS沖洗3遍，加入溶于PBS的二氫乙錠（10 mol/L），37℃孵箱中避光反應(yīng)1 h，熒光顯微鏡觀察。之后迅速在熒光酶標儀上將96孔板于530 nm波長處檢測吸光度。

1.2.4 試劑盒檢測 取細胞上清液，按照說明書步驟進行ELISA操作。取細胞上清液，按照廠家說明書在96孔板上進行乳酸脫氫酶（LDH）及天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）含量檢測。取細胞上清液，按照說明書進行丙二醛（MDA）及超氧化物歧化酶（SOD）活性檢測。

1.2.5 Western-blot 提取H9C2心肌細胞全蛋白。收集細胞沉淀，將收集的細胞沉淀中加入200μl含1%PMSF的RIPA強裂解液，離心取上清。采取BCA法測定提取到的蛋白濃度，用TBST配平，將配平好的蛋白煮沸5 min，上樣進行SDS-PAGE凝膠電泳，半干法進行轉(zhuǎn)膜，用BSA封閉液封閉，用TBST洗膜，裁膜后分別加入稀釋好的bcl-2、bax、IκB-α、p65、GAPDH一抗，4℃孵育雜交過夜，次日，二抗孵育1.5 h，滴加顯影液，上機顯影檢測。

1.2.6 高效液相色譜法檢測H9C2心肌細胞肌肽含量 按照實驗分組給予細胞相應(yīng)條件因素持續(xù)刺激48 h后，各組細胞上清液棄去，將細胞刮下，用PBS沖洗并離心得細胞沉淀，加入三氟乙酸溶解，離心分離，保留上清液，再加入NaOH（1 mm）調(diào)節(jié)至9。將1 ml鄰苯二甲醛（OPA）溶液（10 mg/ml，溶于甲醇）、2 ml硼酸緩沖液和20μl 2-巰基乙醇混合制備衍生化試劑。OPA衍生試劑與樣品按1：1混合。采用高效液相色譜-熒光檢測法測定細胞中肌肽的含量。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 肌肽對H9C2心肌細胞活力的影響

與對照組H9C2心肌細胞存活率（100%）相比，甘露醇組細胞活力無明顯差異，高糖誘導(dǎo)組細胞的存活率顯著降低；與高糖組細胞存活率比較，肌肽（5、15 mmol/L）處理組的細胞存活率明顯升高。表明肌肽對高糖引起的細胞活力降低具有改善作用(圖1)。

圖1 MTT法測定H9C2心肌細胞活力Control：正常低糖對照組（5.5 mmol/L葡萄糖）Man：甘露醇組（甘露醇15 mmol/L）Glu：高糖模型組（50 mmol/L葡萄糖）Car L：（肌肽5 mmol/L+50 mmol/L葡萄糖）組Car H：（肌肽15 mmol/L+50 mmol/L葡萄糖）組 n=6##P<0.01與對照組比較*P<0.05，**P<0.01與高糖組比較Fig.1 Cell viability of H9C2 assayed by MTTControl:normal low glucose group(5.5 mmol/L glucose);Man:mannitol group(mannitol 15 mmol/L);Glu:high glucose group(50 mmol/L glucose);Car L:(carnosine5 mmol/L+50 mmol/L glucose)group;Car H:(carnosine 15 mmol/L+50 mmol/L glucose)group n=6,##P<0.01 vs.control group;*P<0.05,**P<0.01 vs.high glucosegroup

2.2 肌肽對H9C2心肌細胞凋亡影響

與正常對照組相比，甘露醇組H9C2心肌細胞bax、bcl-2的表達水平，bax/bcl-2比值無明顯變化；高糖組H9C2心肌細胞bax蛋白表達水平，bax/bcl-2比值明顯增高，bcl-2表達水平明顯下降；與高糖組比較，肌肽（5、15 mmol/L）處理組H9C2細胞bax、bax/bcl-2比值明顯降低，bcl-2蛋白表達水平升高。表明肌肽能夠抑制H9C2心肌細胞的凋亡(圖2)。

圖2 肌肽對H9C2心肌細胞凋亡的影響Western blot檢測bax和bcl-2在H9C2心肌細胞的表達（A）H9C2心肌細胞中bax（B）、bcl-2（C）的表達及bax/bcl-2比值（D）統(tǒng)計圖n＝4##P<0.01與對照組比較**P<0.01與高糖組比較Fig.2 Effects of carnosineon apoptosis of H9C2 cardiac myocytesA:Western blot detected bax and bcl-2 expression in H9C2 cardiomyocytes;B:Diagram of bax expression in H9C2 cardiomyocytes;C:Diagram of bcl-2 expression in H9C2 cardiomyocytes;D:Diagram of bax/bcl-2 ratio in H9C2 cardiomyocytes statistics n=4,##P<0.01 vs.control group;**P<0.01 vs.high glucose group

2.3 肌肽對H9C2心肌細胞毒性損傷的影響

與對照組相比，甘露醇組細胞上清液中LDH、AST的含量變化不明顯，高糖組細胞上清培養(yǎng)液中LDH、AST含量明顯升高；與高糖組相比，肌肽（5、15 mmol/L）處理組的上清液中LDH、AST含量有所降低。表明肌肽能減輕高糖誘導(dǎo)的細胞毒性，減弱細胞損害，改善細胞狀態(tài)，且與劑量濃度有關(guān)（圖3）。

圖3 H9C2心肌細胞中LDH（A）及AST（B）含量統(tǒng)計圖n＝8##P<0.01與對照組比較*P<0.05，**P<0.01與高糖組比較Fig.3 Diagram of LDH and ASTcontent in H9C2 cardiac myocytesn=8,##P<0.01 vs.control group;*P<0.05,**P<0.01 vs.high glucose group

2.4 肌肽對H9C2細胞炎癥反應(yīng)的影響

與對照組相比，甘露醇組細胞上清液中IL-1β，IL-6與TNF-α的含量變化不明顯，高糖組細胞上清培養(yǎng)液中IL-1β，IL-6與TNF-α含量明顯升高；與高糖組相比，肌肽（5、15 mmol/L）處理組的上清液中IL-1β，IL-6與TNF-α含量有所降低。表明肌肽能減輕高糖誘導(dǎo)的細胞炎癥反應(yīng)，且與劑量濃度有關(guān)（圖4）。

圖4 H9C2心肌細胞TNF-α（A）、IL-1β（B）和IL-6（C）含量統(tǒng)計圖n＝8##P<0.01與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01與高糖組比較Fig.4 Diagram of TNF-α(A),IL-1β(B)and IL-6(C)content in H9C2 cardiac myocytesn=8,##P<0.01 vs.control group;*P<0.05,**P<0.01 vs.high glucose group

2.5 肌肽對H9C2心肌細胞中ROS的含量影響

與對照組相比，甘露醇組細胞中ROS的含量變化不明顯，高糖組細胞中ROS含量明顯升高；與高糖組相比，肌肽（5、15 mmol/L）處理組ROS含量有所降低。表明肌肽通過減少H9C2心肌細胞中超氧陰離子的含量，能改善高糖誘導(dǎo)的細胞氧化應(yīng)激水平(圖5)。

圖5 H9C2心肌細胞活性氧含量統(tǒng)計圖n=8##P<0.01與對照組比較 *P<0.05，**P<0.01與高糖組比較Fig.5 Diagram of on ROS content of H9C2 cardiac myocytesn=8,##P<0.01 vs.control group;*P<0.05,**P<0.01 vs.high glucose group

2.6 肌肽對H9C2細胞中MDA、SOD的含量影響

與對照組相比，甘露醇組細胞中MDA、SOD的含量變化不明顯，高糖組細胞中MDA含量升高，SOD活性減低；與高糖組相比，肌肽（5、15 mmol/L）處理組MDA含量有所降低，SOD活性增強。表明肌肽可能通過減少H9C2心肌細胞中MDA的含量，提升SOD活性，提升細胞的抗氧化能力（圖6）。

圖6 H9C2心肌細胞SOD（A）和MDA（B）含量統(tǒng)計圖n=8##P<0.01與對照組比較*P<0.05，**P<0.01與高糖組比較Fig.6 Diagram of SOD(A)and MDA(B)activity in H9C2 cardiac myocytesn=8,##P<0.01 vs.control group;*P<0.05,**P<0.01 vs.glucose group

2.7 肌肽對H9C2細胞p65和IκB-α蛋白表達水平的影響

與正常組相比，甘露醇組H9C2心肌細胞核中的p65蛋白表達水平，胞漿中的IκB-α的表達水平無明顯變化；高糖組H9C2心肌細胞核中p65蛋白表達水平明顯增高，胞漿中IκB-α表達明顯下降；與高糖組比較，肌肽（5、15 mmol/L）處理組H9C2心肌細胞核中p65蛋白含量明顯降低，同時細胞漿中IκB-α蛋白含量表達升高，表明肌肽能抑制p65從胞漿轉(zhuǎn)位至細胞核，進而抑制p65的激活并調(diào)控下游相關(guān)炎癥因子釋放（圖7）。

圖7 Western blot檢測H9C2心肌細胞核中p65（A）和胞漿中IκB-α（B）蛋白表達n＝4##P<0.01與對照組比較*P<0.05，**P<0.01與高糖組比較Fig.7 The proteins expression of p65(A)in nucleus and IκB-α(B)in H9C2 cardiac myocytes detected by Western blotn=4,##P<0.01 vs.control group;*P<0.05,**P<0.01 vs.high glucose group

2.8 H9C2心肌細胞中肌肽的含量

與對照組相比，甘露醇組細胞中肌肽的含量變化不明顯，高糖組細胞中肌肽含量明顯減少；與高糖組相比，肌肽（5、15 mmol/L）處理組細胞中肌肽含量有所升高。表明高糖刺激可以引起心肌組織中肌肽減少，而補充肌肽可以增加細胞中肌肽含量（圖8）。

圖8 肌肽對H9C2心肌細胞肌肽含量的影響n＝4##P<0.01與對照組比較*P<0.05，**P<0.01與高糖組比較Fig.8 Effects of carnosine on carnosine content of H9C2 cardiac myocytesn=4,##P<0.01 vs.control group；*P<0.05,**P<0.01 vs.high glucose group

3 討論

DM作為一種以慢性高脂血癥和高血糖狀態(tài)為特征的疾病，影響全身的臟器功能，包括眼、腎、心、血管和外周神經(jīng)[10]。糖尿病的主要原因包括胰島功能受損引起的胰島素缺乏和細胞對胰島素敏感性降低引起的高血糖癥[11]。高血糖還可以通過改變線粒體功能來增加心肌細胞程序性死亡[12]。

本實驗采用葡萄糖（50 mmol/L）作用于大鼠H9C2心肌細胞，模擬機體高糖環(huán)境下的心肌，MTT方法檢測H9C2心肌細胞活力，結(jié)果顯示，高糖可以誘導(dǎo)H9C2心肌細胞損傷；以甘露醇作為對照，結(jié)果顯示，高滲條件并不能造成H9C2心肌細胞損傷。進一步檢測H9C2心肌細胞的酶學指標，說明在高糖環(huán)境下H9C2心肌細胞的細胞膜受損，造成細胞損害。肌肽能有效提高H9C2心肌細胞的存活能力，減弱高糖引發(fā)的細胞損害；肌肽能減輕高糖誘導(dǎo)的細胞毒性，改善細胞狀態(tài)。采用免疫印跡法檢測凋亡蛋白bax、bcl-2的蛋白水平以及bax/bcl-2比值，結(jié)果表明在高糖環(huán)境下H9C2心肌細胞凋亡增加，肌肽處理過的細胞凋亡蛋白水平降低，說明肌肽可以改善H9C2心肌細胞的凋亡。檢測高糖環(huán)境下H9C2心肌細胞氧化應(yīng)激水平，發(fā)現(xiàn)H9C2心肌細胞氧化還原系統(tǒng)失衡，細胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平升高；肌肽能夠清除細胞內(nèi)過剩的ROS，減少細胞損害，肌肽預(yù)處理可以改善由于高糖誘導(dǎo)產(chǎn)生的氧化抗氧化系統(tǒng)不平衡，減弱氧化應(yīng)激。有研究顯示，各種糖尿病小鼠模型中細胞炎癥因子濃度增加，表明炎癥對糖尿病性心肌病的發(fā)展有重要作用。本研究采用ELISA法檢測細胞上清液中IL-1β、IL-6與TNF-α的含量，結(jié)果顯示高糖環(huán)境下H9C2心肌細胞中炎癥分子上調(diào)，表明肌肽能顯著抑制高糖誘發(fā)的炎癥反應(yīng)，提升細胞的活力。

有研究表明，肌肽會抑制ROS的增加[13]，ROS會抑制IκB-α的磷酸化從而影響NF-κB的活化[14]。NFκB通路是調(diào)節(jié)細胞炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵信號通路，ROS的產(chǎn)生促進NF-κB的p65核易位，激活NF-κB信號傳導(dǎo)途徑[15]。通過蛋白質(zhì)印跡法檢測H9C2心肌細胞p65、IκB-α在細胞中的蛋白表達水平表明，與對照組相比，高糖實驗組H9C2心肌細胞p65的表達水平在細胞核中明顯升高，而IκB-α表達下降，與高糖實驗組相比，肌肽（5、15 mmol/L）預(yù)處理能降低p65在細胞核內(nèi)的表達，同時提高IκB-α的表達。這可能因肌肽清除了細胞內(nèi)過多的ROS，減少氧化應(yīng)激，從而抑制了NF-κB的活化轉(zhuǎn)位。

綜上所述，肌肽作為體內(nèi)存在的二肽，是繼維生素C和維生素E后發(fā)現(xiàn)的新型抗氧化劑，目前的研究中，肌肽可以減弱其他的糖尿病并發(fā)癥，但是在心肌的研究甚少。本實驗從細胞水平上探討了肌肽對細胞的保護作用，并研究其機制是否與減弱氧化應(yīng)激，抑制NF-κB活性，削弱炎癥反應(yīng)有關(guān)。對肌肽的抗氧化作用有進一步的了解。肌肽可以削弱高糖引起的炎癥，提高H9C2心肌細胞的存活能力，可能與ROS/NF-κB信號通路相關(guān)，為肌肽的心肌保護作用提出了新的機制，也為DCM的抗氧化治療提供了理論基礎(chǔ)。