楊云海,趙 蕓,范黎明,王凱博,2,蘇發(fā)武,查友貴,葉 敏*

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 云南生物資源保護(hù)與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,云南 昆明 650201；2.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 環(huán)境資源與植物保護(hù)研究所,云南 昆明 650201)

紫莖澤蘭(Ageratinaadenophora)是菊科澤蘭屬多年生草本植物,原產(chǎn)于中美洲墨西哥至哥斯達(dá)黎加一帶[1],自20世紀(jì)40年代左右,由東南亞邊境地區(qū)經(jīng)云南南部傳入后,在我國(guó)迅速蔓延擴(kuò)散,現(xiàn)已廣泛分布于云南、貴州、廣西、西藏等西南地區(qū),已成為我國(guó)主要的惡性入侵雜草之一[2-4]。紫莖澤蘭入侵定植后,由于其較強(qiáng)的生長(zhǎng)和繁殖能力,很難被清除,可迅速地侵占農(nóng)田、林地、天然草地、路邊和閑置空地等,與本土植物爭(zhēng)奪水、肥、陽(yáng)光等,嚴(yán)重影響本土植物的生長(zhǎng);在入侵天然草地后,牲畜誤食一定量的紫莖澤蘭后會(huì)出現(xiàn)腹瀉、脫毛等癥狀,嚴(yán)重時(shí)甚至?xí)劳鯷5,6];紫莖澤蘭給當(dāng)?shù)氐霓r(nóng)、林、畜牧業(yè)生產(chǎn)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失和生態(tài)環(huán)境的“綠色災(zāi)難”[7,8]。因此,探究紫莖澤蘭侵入農(nóng)田后對(duì)旱地作物生長(zhǎng)的影響,對(duì)農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展具有重要意義。

近年來(lái),入侵植物的化感作用引起了科研人員的廣泛關(guān)注。據(jù)報(bào)道,化感作用是導(dǎo)致外來(lái)植物成功入侵的重要因素[9-11]。對(duì)紫莖澤蘭化感作用方面的研究始于20世紀(jì)80年代,主要集中于澳大利亞、印度和中國(guó)等,越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)化感作用是紫莖澤蘭入侵后逐漸發(fā)展成為單種優(yōu)勢(shì)種群的重要原因[12,13]。已有大量研究表明紫莖澤蘭的水提取物可抑制多種植物的生長(zhǎng)發(fā)育,對(duì)植物有強(qiáng)烈的化感抑制作用。張學(xué)文等[14]研究發(fā)現(xiàn)紫莖澤蘭不同部分的化感作用有明顯差異,在相同濃度下紫莖澤蘭地上部分水浸提液的化感作用明顯強(qiáng)于地下部分。熊勇等[15]發(fā)現(xiàn)紫莖澤蘭莖、葉的水提取物對(duì)供試的玉米、水稻種子發(fā)芽率和幼苗根長(zhǎng)、株高均有不同程度的影響,水提液的濃度越大,化感抑制作用越強(qiáng)。此外,紫莖澤蘭地上部的水浸提液對(duì)紫花苜蓿、非洲狗尾草、白三葉、鴨茅等7種牧草種子的萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)均表現(xiàn)出強(qiáng)烈的抑制作用[16]。迄今關(guān)于紫莖澤蘭地上部分化感作用的研究主要局限于水提液,而有關(guān)水提液中有機(jī)溶劑萃取物的化感作用研究尚鮮有報(bào)道。本文以旱地常見(jiàn)的單子葉植物小麥和雙子葉植物綠豆為供試作物,用不同有機(jī)溶劑萃取紫莖澤蘭地上部分的水提液,研究了不同極性萃取物對(duì)兩種作物種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的化感作用,以期為評(píng)估紫莖澤蘭對(duì)旱地作物生長(zhǎng)的影響提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 紫莖澤蘭植物材料的采集 2018年2月在云南省昆明市富民縣附近采集紫莖澤蘭植物材料,摘取高度幾乎相同且無(wú)病蟲(chóng)害的紫莖澤蘭地上部分,放置于陰涼、通風(fēng)和干燥的地方,陰干后粉碎備用。

1.1.2 供試作物種子 綠豆(Triticumaestivum,品種為極早綠珍珠二號(hào))、小麥(Vignaradiata,品種為煙農(nóng)0428),購(gòu)于昆明市的種子公司。

1.1.3 主要試劑 石油醚(分析純,天津化學(xué)試劑有限公司)、乙酸乙酯(分析純，西隴化工股份有限公司)、正丁醇(分析純，科安隆博華天津醫(yī)藥化學(xué)有限公司)、丙酮(分析純，重慶川東化工有限公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 紫莖澤蘭地上部分各萃取相提取液的制備 稱取500 g陰干粉碎的紫莖澤蘭地上部分,按1∶5(w/w)的固液比加入蒸餾水,靜置浸泡24 h,采用超聲波水浴(超聲波頻率為35 kHz,功率為500 W)輔助提取30 min,然后過(guò)濾，得濾液；再將過(guò)濾后的殘?jiān)貜?fù)上述操作,合并兩次提取所得的濾液,得到固液比為1∶10(w/w)的紫莖澤蘭地上部分水提液。采用溶劑極性梯度萃取法,按溶劑極性從小到大的順序依次用等體積的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇將所得的水提液各萃取3次,合并相應(yīng)的萃取液；將各有機(jī)溶劑萃取液和剩余水相用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮,得到相應(yīng)提取物的浸膏。將所得浸膏分別裝入棕色廣口瓶中,密封保存于4 ℃冰箱，備用。

1.2.2 紫莖澤蘭提取物對(duì)小麥和綠豆種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的影響測(cè)定 稱取一定量的各有機(jī)溶劑萃取物浸膏和剩余水相浸膏,用8%的丙酮水溶液對(duì)有機(jī)溶劑萃取物浸膏進(jìn)行稀釋,用蒸餾水對(duì)水相浸膏進(jìn)行稀釋,分別配制濃度為1.25、2.50、5.00、10.00、20.00 mg/mL的水溶液,保存?zhèn)溆谩?/p>

本實(shí)驗(yàn)主要采用燒杯-濾紙培養(yǎng)法測(cè)定植物種子的發(fā)芽率、幼苗的莖長(zhǎng)及根長(zhǎng)等,作為化感作用強(qiáng)度的生物測(cè)定指標(biāo)[17-19]。選取大小相對(duì)一致且籽粒飽滿的小麥和綠豆種子,用75%的酒精浸泡2 min,然后用蒸餾水多次反復(fù)沖洗,將種子自然陰干,放置于底部墊有兩層定性濾紙的燒杯中,每個(gè)燒杯中分別整齊地放入小麥和綠豆種子8粒,并加入3 mL配制好的各濃度水溶液,使之剛好浸沒(méi)種子體積的1/3。以加入8%丙酮的水溶液作為有機(jī)溶劑萃取液的空白對(duì)照,剩余水相處理以蒸餾水作為空白對(duì)照。用塑料保鮮膜封閉燒杯，并用大頭針在保鮮膜上扎孔10個(gè),以保證空氣流通并減少水分快速蒸發(fā)。將燒杯放入光照培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng),光照培養(yǎng)箱設(shè)置：白天溫度26.5 ℃,光照時(shí)間14 h,光照強(qiáng)度11000 lx；夜晚溫度26.0 ℃,光照時(shí)間0 h,光照強(qiáng)度0 lx。培養(yǎng)5 d后,測(cè)定兩種作物種子的最終萌發(fā)率、莖長(zhǎng)、根長(zhǎng)(小麥測(cè)量最長(zhǎng)根)、根數(shù)。本實(shí)驗(yàn)每個(gè)處理設(shè)置6次重復(fù)。

1.3 計(jì)算方法

1.3.1 植物種子最終萌發(fā)率的計(jì)算 供試植物種子的最終萌發(fā)率(FG)和發(fā)芽化感效應(yīng)指數(shù)(RI)采用康小武等[20, 21]報(bào)道的方法進(jìn)行計(jì)算，公式如下:

FG(%)=發(fā)芽種子總數(shù)/供試種子總數(shù)×100

RI(%)=1-C/T(T≥C),RI=T/C-1(T

上式中：C為對(duì)照值；T為處理值;RI為化感效應(yīng)指數(shù)。當(dāng)RI>0時(shí)表現(xiàn)為促進(jìn)作用；當(dāng)RI<0時(shí)表現(xiàn)為抑制作用；RI的絕對(duì)值越大，則作用強(qiáng)度越強(qiáng)。

1.3.2 根長(zhǎng)、苗高、根數(shù)抑制率的計(jì)算 關(guān)于紫莖澤蘭地上部分提取物不同濃度水溶液對(duì)小麥、綠豆種子根長(zhǎng)、苗高和根數(shù)的影響,參照施蕊等[22]報(bào)道的方法計(jì)算抑制率(IR),計(jì)算公式如下:

上式中：Ti為各濃度提取物的處理值；T0為空白對(duì)照值。當(dāng)IR>0時(shí)表示具有抑制作用;當(dāng)IR=0時(shí)表示無(wú)作用;當(dāng)IR<0時(shí)表示具有促進(jìn)作用。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法

用SPSS 22.0數(shù)據(jù)處理軟件處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),結(jié)合LSD檢驗(yàn)進(jìn)行單向ANOVA分析, 評(píng)價(jià)處理間的差異顯著性和重復(fù)間的離散度。采用Oringin 9.1進(jìn)行圖形繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫莖澤蘭地上部分各萃取物對(duì)小麥和綠豆種子萌發(fā)的影響

紫莖澤蘭地上部分各萃取物對(duì)農(nóng)作物小麥、綠豆種子發(fā)芽率及發(fā)芽化感效應(yīng)指數(shù)的影響結(jié)果見(jiàn)表1,其中CK為對(duì)照組。

表1 紫莖澤蘭地上部分各萃取物對(duì)受試作物種子萌發(fā)的影響

從表1可以看出：丙酮對(duì)受試作物種子的萌發(fā)沒(méi)有影響,因此丙酮可以作為配制萃取物的稀釋溶劑；各有機(jī)溶劑萃取物對(duì)小麥種子的萌發(fā)有明顯的抑制作用,總體上表現(xiàn)為石油醚萃取物>乙酸乙酯萃取物>正丁醇萃取物>剩余水相；在相同溶劑下發(fā)芽率隨各有機(jī)萃取物濃度升高而逐漸降低。在1.25 mg/mL濃度下,各萃取物處理后的小麥種子發(fā)芽率與對(duì)照相比無(wú)顯著差異。當(dāng)石油醚和乙酸乙酯萃取物的濃度為10.00 mg/mL時(shí),小麥種子均沒(méi)有萌發(fā);正丁醇萃取物處理的小麥種子萌發(fā)率為50.00%,剩余水相為91.67%。在20.00 mg/mL濃度下,石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取物能完全抑制小麥種子的萌發(fā),而剩余水相處理后仍有91.67%的萌發(fā)率,與空白對(duì)照(萌發(fā)率為100.00%)相比沒(méi)有明顯差異。各有機(jī)溶劑萃取物對(duì)雙子葉植物綠豆種子發(fā)芽的抑制活性低于對(duì)單子葉植物小麥的抑制活性。10.00 mg/mL以上濃度的石油醚萃取物能完全抑制綠豆種子的萌發(fā)；當(dāng)乙酸乙酯和正丁醇萃取物濃度為20.00 mg/mL時(shí)綠豆種子均沒(méi)有萌發(fā)；經(jīng)其余各有機(jī)溶劑萃取物處理后綠豆種子的發(fā)芽率均為100.00%；剩余水相不影響綠豆種子的萌發(fā)。綜上所述,對(duì)受試作物種子萌發(fā)有抑制活性的物質(zhì)主要集中于石油醚和乙酸乙酯部分。

2.2 紫莖澤蘭地上部分各萃取相對(duì)小麥和綠豆幼苗生長(zhǎng)的影響

2.2.1 紫莖澤蘭地上部分各萃取相對(duì)小麥幼苗生長(zhǎng)的影響 由圖1可知,經(jīng)各萃取液處理的小麥種子在萌發(fā)后,其幼莖長(zhǎng)度與萃取物濃度總體上呈負(fù)相關(guān),總體抑制作用表現(xiàn)為石油醚>乙酸乙酯>正丁醇>剩余水相。在1.25 mg/mL濃度條件下,經(jīng)石油醚和乙酸乙酯處理后小麥幼莖長(zhǎng)度分別為42.78和57.00 mm,與對(duì)照(110.17 mm)相比有顯著差異(P<0.05);而經(jīng)正丁醇和剩余水相處理后小麥幼莖長(zhǎng)度分別為106.71和108.29 mm,與對(duì)照相比無(wú)顯著差異。當(dāng)濃度大于5.00 mg/mL時(shí),石油醚和乙酸乙酯對(duì)小麥幼莖生長(zhǎng)的抑制率均大于90.00%,正丁醇萃取相的抑制率為53.10%,但剩余水相的抑制率僅為22.52%。當(dāng)石油醚和乙酸乙酯萃取物的濃度為10.00 mg/mL時(shí)它們完全抑制小麥幼苗的生長(zhǎng)；20.00 mg/mL的正丁醇萃取相完全抑制小麥幼莖的生長(zhǎng)；剩余水相的抑制率為68.84%。

如圖2所示,經(jīng)同種溶劑相同濃度處理后,它們對(duì)小麥幼根生長(zhǎng)的抑制作用大于對(duì)幼莖的抑制作用,這可能與根先接觸化感物質(zhì)有關(guān)。經(jīng)2.50 mg/mL以上濃度的石油醚萃取相處理后小麥幼根均未生長(zhǎng),根長(zhǎng)抑制率均為100.00%;乙酸乙酯萃取物的抑制效果次之,其25.00 mg/mL處理能完全抑制小麥幼根的生長(zhǎng);正丁醇萃取物對(duì)小麥幼根的抑制效果略低于石油醚和乙酸乙酯萃取相,20.00 mg/mL的濃度才能使小麥種子不分化出幼根;經(jīng)剩余水相20.00 mg/mL處理后小麥根長(zhǎng)為6.49 mm,抑制率為91.13%,與其余有機(jī)溶劑萃取相相比抑制效果最差,但與對(duì)照相比仍有顯著差異(P<0.05)。

從圖3可以看出,石油醚、乙酸乙酯萃取物在低濃度時(shí)能增加小麥幼根的數(shù)量。正丁醇萃取相對(duì)小麥幼根數(shù)量的促進(jìn)作用隨濃度的增加而逐漸增大,在5.00 mg/mL時(shí)促進(jìn)效果最明顯,與對(duì)照相比幼根數(shù)量增加了11.96%；爾后隨濃度增加,其促進(jìn)作用減弱，抑制作用增強(qiáng)。經(jīng)剩余水相部分處理后的小麥幼根數(shù)量與水溶液濃度呈正相關(guān),剩余水相的濃度越高,小麥幼苗分化出的根數(shù)越多。究其原因，可能是因?yàn)楦鬏腿∥镆种菩←溣赘纳L(zhǎng),小麥植株通過(guò)改變體內(nèi)的激素來(lái)增加幼根的數(shù)量,以吸收足夠的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)來(lái)保證植株的正常生長(zhǎng)。

圖1 紫莖澤蘭地上部分有機(jī)溶劑萃取物對(duì)小麥幼莖生長(zhǎng)的影響

2.2.2 紫莖澤蘭地上部分各萃取物對(duì)綠豆幼苗生長(zhǎng)的影響 本試驗(yàn)結(jié)果顯示,在相同處理濃度下,紫莖澤蘭地上部分各萃取物對(duì)雙子葉植物綠豆的抑制作用大于對(duì)單子葉植物小麥的抑制作用,且各萃取相對(duì)綠豆幼苗生長(zhǎng)的抑制作用表現(xiàn)為石油醚>乙酸乙酯>正丁醇>剩余水相。由圖4可知：當(dāng)濃度大于2.50 mg/mL時(shí)，石油醚萃取相物質(zhì)能完全抑制綠豆幼莖的生長(zhǎng)分化,其抑制作用顯著強(qiáng)于乙酸乙酯、正丁醇和剩余水相。綠豆的幼莖長(zhǎng)度與乙酸乙酯萃取相呈現(xiàn)明顯的濃度效應(yīng)關(guān)系,經(jīng)1.25 mg/mL處理后綠豆幼莖長(zhǎng)度為85.02 mm,抑制率為26.39%，而10.00 mg/mL乙酸乙酯萃取相對(duì)綠豆幼莖的抑制率達(dá)到100.00%。正丁醇萃取相對(duì)綠豆幼莖生長(zhǎng)表現(xiàn)出“低促高抑”現(xiàn)象,當(dāng)濃度為1.25和2.50 mg/mL時(shí)，綠豆幼莖長(zhǎng)度與對(duì)照相比分別增加了2.02%和4.08%;爾后隨正丁醇萃取液濃度增加,其抑制作用逐漸增強(qiáng),在20.00 mg/mL處理下綠豆幼苗不生長(zhǎng)。剩余水相處理對(duì)綠豆幼莖生長(zhǎng)的抑制作用隨處理濃度增加而逐漸增強(qiáng),但抑制效果弱于石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取相,其20.00 mg/mL濃度處理對(duì)綠豆幼莖生長(zhǎng)的抑制率僅為52.36%。

圖2 紫莖澤蘭地上部分有機(jī)溶劑萃取物對(duì)小麥幼根生長(zhǎng)的影響

圖3 紫莖澤蘭地上部分有機(jī)溶劑萃取物對(duì)小麥幼根數(shù)量的影響

由圖5可知,各萃取物對(duì)綠豆幼苗根長(zhǎng)的抑制效果與對(duì)其幼苗莖長(zhǎng)的抑制效果表現(xiàn)出一致性,均具有較強(qiáng)的濃度依賴效應(yīng)。石油醚萃取物對(duì)綠豆幼根生長(zhǎng)的抑制效果最好,1.25 mg/mL的抑制率為77.18%,濃度大于2.50 mg/mL能使綠豆不分化出幼根。乙酸乙酯萃取相的抑制效果稍弱于石油醚,綠豆幼根在1.25 mg/mL處理下長(zhǎng)度為66.25 mm,抑制率為25.70%；此后隨水溶液濃度升高,其抑制作用逐漸增強(qiáng),10.00 mg/mL的抑制率達(dá)100.00%。經(jīng)正丁醇萃取物處理后的綠豆幼根長(zhǎng)度與溶液濃度呈負(fù)相關(guān),經(jīng)1.25 mg/mL處理后綠豆幼根長(zhǎng)度為79.38 mm,抑制率為10.91%；此后隨濃度增加幼根長(zhǎng)度縮短,10.00 mg/mL完全抑制綠豆幼根生長(zhǎng)。剩余水相對(duì)綠豆幼根長(zhǎng)度的抑制效果最差,抑制率最大為68.43%；當(dāng)其濃度為1.25 mg/mL時(shí)綠豆幼根長(zhǎng)度為87.75 mm,與對(duì)照(89.07 mm)相比沒(méi)有顯著差異。

圖4 紫莖澤蘭地上部分有機(jī)溶劑萃取物對(duì)綠豆幼莖生長(zhǎng)的影響

3 討論

紫莖澤蘭植株中含有大量具有化感活性的天然產(chǎn)物,在自然條件下水溶性的化感活性物質(zhì)可經(jīng)雨水、露水等的淋溶作用滴落在土壤里發(fā)揮化感生態(tài)學(xué)效應(yīng)[10,23],當(dāng)積累到一定量時(shí)能抑制周圍植物種子萌發(fā)和幼苗、幼根生長(zhǎng),這些化感物質(zhì)均會(huì)使鄰近植物的生長(zhǎng)發(fā)育受到影響,進(jìn)而失去與紫莖澤蘭的競(jìng)爭(zhēng)力[24-27]。

圖5 紫莖澤蘭地上部分有機(jī)溶劑萃取物對(duì)綠豆幼根生長(zhǎng)的影響

本課題組前期對(duì)紫莖澤蘭化感活性物質(zhì)的活性進(jìn)行了大量的系統(tǒng)研究,發(fā)現(xiàn)紫莖澤蘭地上部分水提物對(duì)植物種子和幼苗的生長(zhǎng)具有生物抑制活性。為分離和鑒定紫莖澤蘭地上部分提取物中的化感活性物質(zhì),本文采用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇對(duì)紫莖澤蘭水提液進(jìn)行初步萃取分離。試驗(yàn)結(jié)果表明：各萃取相對(duì)小麥和綠豆這兩種作物均有抑制作用,且對(duì)幼苗生長(zhǎng)的抑制作用強(qiáng)于對(duì)種子萌發(fā)的抑制作用;不同有機(jī)溶劑萃取物對(duì)兩種植物的抑制效果表現(xiàn)為石油醚萃取相>乙酸乙酯萃取相>正丁醇萃取相>剩余水相;同種溶劑萃取物在同一濃度下處理兩種作物種子,對(duì)綠豆幼莖生長(zhǎng)的抑制作用大于對(duì)小麥幼莖的抑制作用,而小麥幼根的敏感程度高于綠豆幼根,說(shuō)明紫莖澤蘭提取物對(duì)小麥和綠豆不同部位的影響程度不同。各萃取物對(duì)小麥幼根的抑制效果總體上大于對(duì)幼莖的抑制效果,且呈現(xiàn)明顯的濃度效應(yīng),即隨提取物濃度升高,對(duì)幼根和苗高的抑制作用增強(qiáng)。其中石油醚萃取物的抑制活性最好,其10.00 mg/mL處理能完全抑制小麥幼莖生長(zhǎng),2.50 mg/mL處理能使小麥幼根不分化。乙酸乙酯萃取物的抑制作用次之,其10.00 mg/mL處理能使小麥幼莖不生長(zhǎng),5.00 mg/mL處理對(duì)幼根的抑制率為100.00%。有機(jī)溶劑各萃取物對(duì)小麥幼根數(shù)量則表現(xiàn)為“低促高抑”效應(yīng)。對(duì)于雙子葉植物綠豆而言,不同有機(jī)溶劑萃取物對(duì)其的抑制作用與小麥呈現(xiàn)一致性,石油醚萃取物的抑制活性最強(qiáng),其2.50 mg/mL處理完全抑制綠豆幼莖、幼根的生長(zhǎng);乙酸乙酯的抑制活性次之,其2.50 mg/mL處理對(duì)綠豆幼莖、幼根的抑制率分別為55.91%和52.99%,而10.00 mg/mL處理完全抑制綠豆幼苗生長(zhǎng)。正丁醇萃取物對(duì)綠豆幼莖生長(zhǎng)呈現(xiàn)低濃度促進(jìn)、高濃度抑制的效應(yīng)。

綜上所述，紫莖澤蘭地上部分水提液中各極性萃取物對(duì)小麥和綠豆種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)均有化感抑制作用,并且活性物質(zhì)主要集中在石油醚萃取相部分。如果紫莖澤蘭侵入農(nóng)田，則將對(duì)某些旱地作物的生長(zhǎng)產(chǎn)生嚴(yán)重的負(fù)面影響。關(guān)于紫莖澤蘭水提液中具體起化感作用的活性成分及其作用機(jī)制,尚有待進(jìn)一步研究。