楊曉瓊,何 璐*,袁建民,許智萍,孔維喜,雷 虓

(1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 熱區(qū)生態(tài)農(nóng)業(yè)研究所,云南 元謀 651300;2.云南省元謀干熱河谷植物園,云南 元謀 651300)

余甘子為大戟科(Euphorbiaceae)葉下珠屬PhynanthusLinn.植物余甘子PhyllanthusemblicaL.的成熟果實(shí)[1],俗名橄欖子、油甘子、滇橄欖。余甘子源產(chǎn)于緬甸和印度,現(xiàn)在菲律賓、印度尼西亞、中南半島、中國(guó)等國(guó)家和地區(qū)均有分布,在中國(guó)的產(chǎn)量較多[2]。余甘子是一種“藥食同源”的植物,具有悠久的藥用歷史,其性涼,味酸、澀、甘,具有清熱涼血、生津止咳、消食健胃等功效[3]?，F(xiàn)代研究表明,余甘子具有抗菌消炎[4]、降血糖血脂[5]、保肝[6]、抗糖尿病[7]、提高機(jī)體免疫力[8]、美白[9]等生理功效。余甘子中富含鞣質(zhì)、黃酮、多酚、多糖、三萜、維生素和有機(jī)酸等多種活性物質(zhì)[10-12],其中最具特征的成分是多酚,約占余甘子成分的20%,其中有效多酚的主要成分是沒(méi)食子酸[13-16],沒(méi)食子酸具有抗氧化、抗癌、降糖、降脂、抗菌、消炎等生物活性[17-18]。

余甘子富含礦質(zhì)元素。袁建民等[19]利用ICP-OES法測(cè)定了干熱河谷區(qū)余甘子不同器官中的礦質(zhì)元素,發(fā)現(xiàn)不同器官中各礦質(zhì)元素含量存在顯著性差異,其中Fe、Zn、Mg、Mn元素含量豐富。蔡英卿等[20]利用火焰原子吸收法測(cè)定了余甘子不同器官中的礦質(zhì)元素含量,發(fā)現(xiàn)Fe、Cu、Mn、Zn元素在余甘子不同器官中都有一定的分布。礦質(zhì)元素在植物的生理活動(dòng)中發(fā)揮著極其重要的作用,例如Mg直接影響植物的光合作用,且是構(gòu)成葉綠素的元素,同時(shí)也是多種酶的活化劑[21]。礦質(zhì)元素與人體健康息息相關(guān),在體內(nèi)具有激活酶、運(yùn)載宏量元素、代謝核酸和參與激素生成等生物學(xué)功能[19]。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn),礦質(zhì)元素不僅會(huì)影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育,還會(huì)影響其有效成分的累積,從而影響中醫(yī)臨床的治療效果[22-23]。余甘子作為一種“藥食同源”的藥材[3],因富含礦質(zhì)元素和有效活性成分,又具有較好的藥用價(jià)值,所以被應(yīng)用到各種中藥和保健品的研發(fā)中。目前,對(duì)余甘子化學(xué)成分、含量分析、藥理藥效的研究報(bào)道較多,但對(duì)其礦質(zhì)元素與有效活性成分之間的相關(guān)性研究尚未見報(bào)道。因此,明確余甘子中礦質(zhì)元素與有效活性成分之間的相關(guān)性,可為余甘子的質(zhì)量控制提供參考依據(jù)[22]。

本研究利用高效液相色譜法測(cè)定了18種余甘子中有效成分沒(méi)食子酸的含量,利用ICP-OES(電感耦合等離子體發(fā)射光譜)法測(cè)定了余甘子中20種礦質(zhì)元素(Al、B、Fe、Cr、Cu、Ca、Mn、K、P、Na、S、Si、Zn、Se、Mg、Mo、Ni、Cd、Co、Pb)的含量,并對(duì)余甘子中主要有效成分沒(méi)食子酸含量與礦質(zhì)元素含量之間的相關(guān)性進(jìn)行了分析,以期為其質(zhì)量的控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料概況 供試材料余甘子樣品分別采集于元謀(YM)、元江(YJ)、賓川(BC),詳細(xì)信息見表1。采集時(shí)間為2019年12月,采集時(shí)期為余甘子果實(shí)成熟期,均由云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱區(qū)生態(tài)農(nóng)業(yè)研究所分析測(cè)試中心野外采集。

1.1.2 儀器設(shè)備與試劑 Agilent1260高效液相色譜儀,含Agilent ZORBAX Eclipse XRD-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);Milestone Ethos up微波消解儀(意大利邁爾斯通);PQ-9000電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(德國(guó)耶拿);GZX-9140MBE電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海博訊);UPH-IV-20T超純水儀(中國(guó)優(yōu)普);ATX224萬(wàn)分之一電子分析天平(日本島津);QM3SP行星式球磨機(jī)(南京馳順);RAININ移液槍(美國(guó)瑞寧);超聲波清洗機(jī)(寧波新芝,300 W,40 kHZ);0.45 μm微孔濾膜;粉碎機(jī)。

表1 余甘子樣品及產(chǎn)地信息

將實(shí)驗(yàn)用的18批余甘子樣品于60 ℃電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中烘至恒重,過(guò)60目尼龍篩,混勻,保存?zhèn)溆?。乙?色譜純)、甲醇(色譜純)、氫氧化鈉(AR)、磷酸(AR)、沒(méi)食子酸對(duì)照品(純度99.8%)、無(wú)水乙醇(AR)、硝酸鋁(AR)、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(純度99%)、亞硝酸鈉(AR)、30%過(guò)氧化氫(GR)、濃硝酸(GR)、超純水，均為市購(gòu);氬氣(純度99.999%)、多元素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液以及單個(gè)元素(Fe、B、Mg、Cr、Al、Mn、Zn、Cd、Ni、Cu、Co、Pb、Ca、Na、S、P、Se、K、Mo)標(biāo)準(zhǔn)溶液,購(gòu)自國(guó)家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 有效成分含量的測(cè)定方法 (1)色譜條件：Agilent ZORBAX Eclipse XRD-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動(dòng)相為乙腈+0.2%磷酸水溶液(5∶95),等度洗脫;流速為1.000 mL/min；進(jìn)樣量為5 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)為273 nm；柱溫為30 ℃[23]。

(2)對(duì)照品溶液的配制：精確稱取20 mg沒(méi)食子酸對(duì)照品,溶解,加入濃度為50%的甲醇溶液定容至10 mL棕色容量瓶,得到濃度為2.0 mg/mL的沒(méi)食子酸對(duì)照品溶液。

(3)供試品溶液的制備：將采集的新鮮余甘子洗凈、去核、烘干、粉碎、過(guò)篩后,保存?zhèn)溆?；用萬(wàn)分之一的電子天平準(zhǔn)確稱取0.1000 g余甘子粉末,每份樣品平行3次,置于10 mL容量瓶中,加入10 mL 50%的甲醇溶液,超聲提取90 min(超聲功率為300 W,頻率為40 kHZ)；然后冷卻,再稱定質(zhì)量,用50%的甲醇溶液補(bǔ)足質(zhì)量,搖勻，最后用0.45 μm有機(jī)系微孔濾膜過(guò)濾；取濾液,待上機(jī)測(cè)試。

(4)線性關(guān)系考察：精密吸取沒(méi)食子酸對(duì)照品溶液(2.00 mg/mL)適量,用50%的甲醇進(jìn)行梯度稀釋,分別配制成濃度為0.030、0.0625、0.125、0.25、0.50、1.00、2.00 mg/mL的系列對(duì)照品溶液,按1.2.1節(jié)(1)中的色譜條件進(jìn)行測(cè)定。

(5)檢出限與定量限試驗(yàn)：取1.2.1節(jié)(2)中濃度為2.00 mg/mL的沒(méi)食子酸對(duì)照品溶液適量,進(jìn)行倍比稀釋,按1.2.1節(jié)(1)中的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次,記錄峰面積。當(dāng)信噪比為3∶1時(shí),得出檢出限;當(dāng)信噪比為10∶1時(shí),得出定量限。

(6)精密度試驗(yàn)：取濃度為2.00 mg/mL的沒(méi)食子酸對(duì)照品溶液適量,按1.2.1節(jié)(1)中的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次,計(jì)算峰面積的RSD。

(7)穩(wěn)定性試驗(yàn)：依據(jù)1.2.1節(jié)(3)中的方法制備余甘子提取液,按1.2.1節(jié)(1)中的色譜條件對(duì)同一樣品在0、2、4、6、8、10、12、24 h分別進(jìn)行測(cè)定,計(jì)算余甘子中沒(méi)食子酸含量的RSD。

(8)重復(fù)性試驗(yàn)：參照1.2.1節(jié)(3)中的方法平行制備6份余甘子提取液,在1.2.1節(jié)(1)中的色譜條件下進(jìn)行測(cè)試,計(jì)算余甘子中沒(méi)食子酸含量的RSD。

(9)加標(biāo)回收率試驗(yàn)：按照1.2.1節(jié)(3)中的方法制備余甘子提取液,加入不同濃度的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液,按1.2.1節(jié)(1)中的色譜條件進(jìn)行測(cè)試，計(jì)算加標(biāo)回收率。

(10)樣品含量的測(cè)定：參照1.2.1節(jié)(3)中的方法制備18批余甘子樣品提取液,在1.2.1節(jié)(1)中的色譜條件下,連續(xù)進(jìn)樣3次,分別計(jì)算18批余甘子樣品中沒(méi)食子酸的含量。

1.2.2 礦質(zhì)元素含量的測(cè)定方法 (1)樣品的前處理：準(zhǔn)確稱取18批余甘子樣品各0.2000 g,每批樣品平行稱取3份,置于聚四氟乙烯高壓微波消解罐中,分別加入6 mL濃HNO3和2 mL H2O2,擰緊消解罐,在確保完全密封的條件下將消解罐放入微波消解爐內(nèi),設(shè)定微波消解程序(微波消解最大功率為1800 W；首先設(shè)置溫度為140 ℃,爬升時(shí)間設(shè)置為15 min,保持時(shí)間為5 min;然后將溫度升高至180 ℃,爬升時(shí)間設(shè)置為10 min,保持時(shí)間為20 min;最后冷卻至室溫)進(jìn)行消解。在微波消解完畢后,先利用趕酸儀趕酸60 min左右；再用2%HNO3溶液少量多次洗滌高壓消解內(nèi)罐,合并洗液，將其轉(zhuǎn)入50 mL容量瓶,定容并混勻；最后用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾,取濾液,待上機(jī)測(cè)試。同時(shí)制備空白對(duì)照品[21]。

(2) ICP-OES的工作參數(shù)：利用軸向(axial)作為等離子體觀測(cè)方式;氬氣壓力為0.65 MPa;高頻發(fā)射器功率為1200 W;冷卻氣流量為12 L/min;霧化氣流量為0.5 L/min;輔助氣流量為0.5 L/min;快泵流速為4.0 mL/min;蠕動(dòng)泵正常流速為1.00 mL/min;測(cè)定次數(shù)為3次。

(3)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：準(zhǔn)確吸取濃度為100 μg/mL的多元素標(biāo)準(zhǔn)溶液10 mL于100 mL容量瓶中,定容搖勻,從而得到濃度為10 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。吸取一定量的10 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液,進(jìn)行梯度稀釋,得到濃度分別為0.00、0.10、0.50、1.00、2.50和5.00 mg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液,待上機(jī)測(cè)試,從而獲得礦質(zhì)元素的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

(4)待測(cè)樣品礦質(zhì)元素含量的測(cè)定：對(duì)18批余甘子樣品的待測(cè)液分別進(jìn)行Al、B、Mn、Zn、Fe、Cu、Ca、Cr、K、S、Cd、Se、P、Na、Si、Mg、Mo、Ni、Co、Pb共20種礦質(zhì)元素含量的測(cè)定,每批平行測(cè)定3次。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS 20.0和SAS統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)；差異性多重比較采用LSD(least significant difference)分析法；雙變量相關(guān)性分析(Pearson correlation analyis)的顯著性水平為0.05；采用Origin 8.6繪制系統(tǒng)聚類分析結(jié)果圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 采用HPLC法測(cè)定余甘子中沒(méi)食子酸含量

2.1.1 色譜條件的選擇 為了考察供試品余甘子提取液的系統(tǒng)適用性,采用甲醇+0.2%磷酸水(5∶95)進(jìn)行等度洗脫,結(jié)果發(fā)現(xiàn)余甘子中沒(méi)食子酸峰的理論塔板數(shù)不理想，分離度低，重現(xiàn)性差(圖1)；采用乙腈+0.2%磷酸水(5∶95)進(jìn)行等度洗脫,發(fā)現(xiàn)余甘子中沒(méi)食子酸峰的理論塔板數(shù)高于2000，分離度較好，出峰快，重現(xiàn)性好,因此選擇乙腈+0.2%磷酸水(5∶95)作為流動(dòng)相條件測(cè)定余甘子中沒(méi)食子酸的含量。目前大部分研究中沒(méi)食子酸的檢測(cè)波長(zhǎng)為273 nm[25],因此選擇273 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

圖1 沒(méi)食子酸對(duì)照品A和供試品B的HPLC圖譜

2.1.2 線性關(guān)系考察 以沒(méi)食子酸對(duì)照品溶液的濃度(x)為橫坐標(biāo),以峰面積(y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到回歸方程y=18934x-16.921,R2=0.9999 (n=7),結(jié)果表明,沒(méi)食子酸在0.030～2.00 mg/mL濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系(圖2)。檢出限為0.17614 mg/kg,定量限為0.58938 mg/kg,此方法具有較低的檢出限和定量限,因此其靈敏度較高。

圖2 沒(méi)食子酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖譜

2.1.3 精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性與回收率 通過(guò)對(duì)沒(méi)食子酸對(duì)照品進(jìn)行精密度考察,計(jì)算得到?jīng)]食子酸峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.21%,說(shuō)明儀器的精密度較高;對(duì)供試品提取液進(jìn)行穩(wěn)定性考察,發(fā)現(xiàn)沒(méi)食子酸峰面積的RSD為1.01% (n=6),說(shuō)明供試品溶液在室溫下放置24 h穩(wěn)定性較好;取供試品進(jìn)行重復(fù)性實(shí)驗(yàn),計(jì)算得到?jīng)]食子酸峰面積的RSD為0.79%,表明該方法的重復(fù)性良好。在余甘子提取液中按照0.5、1.0、5.0 mg/kg三個(gè)水平分別添加沒(méi)食子酸,每個(gè)添加水平重復(fù)6次。添加回收試驗(yàn)結(jié)果如表2所示,在0.5～5.0 mg/kg 3個(gè)添加水平下,余甘子中沒(méi)食子酸的平均回收率在92.2%～98.7%, RSD為2.12%～5.63%,說(shuō)明本試驗(yàn)方法具有較好的回收率且加標(biāo)回收結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

表2 沒(méi)食子酸的添加回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

2.2 18種余甘子中沒(méi)食子酸含量的變化

由圖3可知,18種余甘子中沒(méi)食子酸的含量差異顯著,其中以BCYY的沒(méi)食子酸含量最高,高達(dá)(3011.589±34.368)mg/kg；以BCYS的含量最低,僅有(215.209±2.097)mg/kg；BCYY的沒(méi)食子酸含量是BCYS的14倍，差異顯著(P<0.05)。YMYY中沒(méi)食子酸的含量略低于BCYY中的沒(méi)食子酸含量,為(2403.698±28.623)mg/kg,但高于其他種質(zhì)的含量。方差分析結(jié)果表明：YM02和BCJY的沒(méi)食子酸含量無(wú)顯著性差異(P>0.05)；YMJY和YJ01、YJ03、YJ06、YJ08的沒(méi)食子酸含量無(wú)顯著性差異(P>0.05)；在其余種質(zhì)間沒(méi)食子酸的含量具有顯著性差異。表3列出了18種余甘子中沒(méi)食子酸含量的平均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差、最大值、最小值和變異系數(shù),通過(guò)平均值可知BCYY中沒(méi)食子酸的含量最高,且平行測(cè)定3組數(shù)據(jù)間的變異系數(shù)較小,說(shuō)明測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確。

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

表3 不同種質(zhì)余甘子中沒(méi)食子酸含量的統(tǒng)計(jì)值(n=3)

2.3 18種余甘子中礦質(zhì)元素含量的變化

2.3.1 礦質(zhì)元素的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程 使用ICP-OES(電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀)測(cè)試多種元素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)。結(jié)果如表4所示,當(dāng)線性范圍為0～5.00 mg/L時(shí),Al、B、Mn、Zn、Fe、Cu、Ca、Cr、K、S、Cd、Se、P、Na、Si、Mg、Mo、Ni、Co、Pb共20種元素在相關(guān)系數(shù)范圍0.9968～0.9999內(nèi)具有較好的線性關(guān)系。

2.3.2 18種余甘子中礦質(zhì)元素含量的比較 利用單因素方差分析法分析余甘子中礦質(zhì)元素含量是否存在差異性,由表5可以看出,18種余甘子中20種礦質(zhì)元素的含量差異性顯著,其中K元素的含量最高,其次是Mg元素,而Ni、Cr元素的含量居后兩位。在18種余甘子中個(gè)別礦質(zhì)元素的含量差異顯著,其中YJ05中Mn元素的含量是YM02的5.7倍,YM05中Fe元素的含量是YJ05的7.6倍,而Ca元素的含量又是BCJY的7.5倍。18種余甘子均含有人體必需的微量元素如Fe、Zn、Mn、Cu、Ni、B和Si,同時(shí)含有人體必需的礦質(zhì)元素如Ca、Mg、P和Na；有害元素Pb、Cd在18種余甘子中均未檢出。由變異系數(shù)可知：Cu元素的變異系數(shù)最大,為139.05%,說(shuō)明18種余甘子中Cu元素的含量差異較大；其次是Al、B,變異系數(shù)分別為136.86%、106.47%；Mg元素含量的變異系數(shù)最小,為6.14%,說(shuō)明18種余甘子中Mg元素的含量差異最小。

表4 線性回歸方程及其相關(guān)系數(shù)

2.3.3 18種余甘子中礦質(zhì)元素含量的相關(guān)性分析 相關(guān)性分析結(jié)果(表6)表明：18種余甘子中Fe元素含量與Al、B、Cr、Ni、Ca、Na、Si元素含量之間存在極顯著的正相關(guān)關(guān)系,相關(guān)系數(shù)分別為0.944、0.675、0.923、0.700、0.352、0.405、0.813,說(shuō)明在Fe元素含量高的余甘子產(chǎn)地,其Al、B、Cr、Ni、Ca、Na、S元素的含量也較高；Al元素含量與B、Cr、Ni、Ca、Na、Si元素含量之間存在極顯著正相關(guān)關(guān)系；B含量與Cr、Ni、Ca、Na、S含量間呈極顯著正相關(guān)；Cr含量與Ni、Ca、Na、S含量間呈極顯著正相關(guān)；Fe、Al、B、Cr、Ni、Ca、Na、Si含量在18種余甘子中存在正相關(guān)關(guān)系；Cu與Ni、Zn之間呈極顯著正相關(guān)；Mn與Mg呈顯著正相關(guān)，與P呈極顯著負(fù)相關(guān)；Ni與Zn、Si之間存在極顯著正相關(guān)；Zn與Na呈極顯著正相關(guān)；Ca與K、Na、Mg之間存在極顯著正相關(guān)；K與Na、Mg之間存在顯著正相關(guān),與S元素存在極顯著負(fù)相關(guān)；Na與Mg存在顯著正相關(guān)。

2.3.4 18種余甘子中礦質(zhì)元素含量的聚類分析 采用系統(tǒng)聚類法對(duì)18種余甘子中的礦質(zhì)元素含量進(jìn)行聚類分析,結(jié)果如圖4所示,可將18種余甘子樣品分為3類：YM02、YM03、YMJY、YJ05、YJ06、YJ07、YJ08、BCYY、BCYS為Ⅰ類群,其特點(diǎn)為Mn元素含量較高,而Cr、P、Si元素的含量較低;YM01、YM04、YM05、YJ01、YJ02、YJ03為Ⅱ類群,其特點(diǎn)為K、Ca、Na三種元素的含量較高;YMYY、YJ04、BCJY為Ⅲ類群,其特點(diǎn)為P元素的含量較高,而Mn、Zn、Cu、K四種元素的含量較低。

2.4 沒(méi)食子酸含量與礦質(zhì)元素含量間的相關(guān)性

對(duì)18種余甘子中的沒(méi)食子酸含量和礦質(zhì)元素含量進(jìn)行雙變量相關(guān)性分析。由表7可知：沒(méi)食子酸含量與Ca元素含量存在極顯著的負(fù)相關(guān),相關(guān)系數(shù)為-0.374,與Na元素含量存在顯著的負(fù)相關(guān),相關(guān)系數(shù)為-0.286,說(shuō)明當(dāng)Ca、Na元素含量較高時(shí),余甘子中沒(méi)食子酸的含量較低。沒(méi)食子酸作為一種次生代謝產(chǎn)物,其含量會(huì)受到礦質(zhì)元素的影響,同時(shí)礦質(zhì)元素也會(huì)參與植物次生代謝產(chǎn)物的合成,最終影響植物次生代謝產(chǎn)物的形成和積累[26]。

3 討論

余甘子在金沙江干熱河谷區(qū)分布較為廣泛,以野生居多,作為一種在干熱河谷區(qū)具有較好發(fā)展前景的“藥食同源”特色資源植物,其種質(zhì)資源優(yōu)勢(shì)和加工利用價(jià)值未得到充分發(fā)揮,存在優(yōu)良品種栽培少、開發(fā)利用率低、加工技術(shù)滯后等問(wèn)題。目前干熱河谷區(qū)余甘子主要作為藥材或者食品的初級(jí)加工原料,大多停留在初級(jí)產(chǎn)品、粗提階段。余甘子富含鞣質(zhì)、黃酮、多酚、多糖等多種活性物質(zhì)[10-12],其酚酸類物質(zhì)是主要的活性成分,其中沒(méi)食子酸具有抗菌、抗氧化、消炎、降糖、抗癌、降脂等生物活性功能[17-18]。同時(shí)余甘子富含多種礦質(zhì)元素,礦質(zhì)元素在植物的生理活動(dòng)中發(fā)揮著極其重要的作用,不僅影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育,還會(huì)影響有效活性成分含量的累積[22-23]。因此,探索余甘子中礦質(zhì)元素如何影響其有效活性成分的積累,對(duì)于干熱河谷區(qū)余甘子植物資源的開發(fā)利用及質(zhì)量控制具有一定的意義。

本研究發(fā)現(xiàn)利用乙腈+0.2%磷酸水(5∶95)進(jìn)行等度洗脫時(shí)余甘子中沒(méi)食子酸峰具有較高的理論塔板數(shù)，分離度好，出峰快，重現(xiàn)性好,說(shuō)明乙腈具有更好的分離效果。沒(méi)食子酸對(duì)照品在0.030～2.00 mg/mL濃度范圍內(nèi)與峰面積具有良好的線性關(guān)系,檢出限為0.17614 mg/kg,定量限為0.58938 mg/kg,因此本試驗(yàn)方法的靈敏度較高。對(duì)沒(méi)食子酸進(jìn)行精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性考察,分別得到?jīng)]食子酸峰面積的RSD為0.21%、1.01%、0.79%,說(shuō)明儀器的精密度較高，供試品溶液的穩(wěn)定性好，本方法的重復(fù)性良好。加標(biāo)回收試驗(yàn)顯示,余甘子中沒(méi)食子酸在0.5～5.0 mg/kg3個(gè)添加水平下,平均回收率在92.2%～98.7%,RSD為2.12%～5.63%,表明此方法具有較好的回收率且加標(biāo)回收結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

表5 18種余甘子中礦質(zhì)元素含量的比較 mg/kg

樣品CdSePNaSiMgMoNiCoPbYM01NDND1025.83±26.9669.17±7.6511.67±1.445076.67±1.44ND2.50±0.02NDNDYM02NDND772.50±11.6624.17±2.895.00±1.505075.00±5.00ND0.00±0.00NDNDYM03NDND920.00±6.6119.17±3.042.50±0.504953.33±44.74ND2.50±0.50NDNDYM04NDND1052.50±10.0024.17±1.2915.00±0.205074.17±1.44ND2.50±0.02NDNDYM05NDND911.67±11.2746.67±3.8228.33±2.895067.50±4.33ND10.00±1.50NDNDYMJYNDND1067.50±2.5034.17±3.8210.00±0.104869.17±6.29ND2.50±0.10NDNDYMYYNDND1140.00±25.0012.50±0.507.50±4.334557.50±2.50ND2.50±0.05NDNDYJ01NDND850.83±6.2915.83±1.297.50±0.055075.00±5.00ND2.50±0.50NDNDYJ02NDND927.50±20.4623.33±2.202.50±0.025080.00±10.21ND0.00±0.00NDNDYJ03NDND1160.83±6.2925.83±2.894.17±0.445065.83±14.22ND0.00±0.00NDNDYJ04NDND736.67±3.8222.50±1.505.83±0.894377.50±20.50ND1.67±0.44NDNDYJ05NDND580.00±15.0020.00±4.332.50±0.305077.50±12.46ND2.50±0.10NDNDYJ06NDND804.17±9.4617.50±2.618.33±0.445077.50±20.32ND2.50±0.20NDNDYJ07NDND749.17±3.8210.83±0.6412.50±2.505075.00±30.14ND2.50±0.05NDNDYJ08NDND600.00±2.5021.67±3.775.00±0.205070.00±14.33ND2.50±0.10NDNDBCJYNDND1045.83±11.279.17±0.4420.83±1.203980.00±2.50ND2.50±0.20NDNDBCYYNDND950.83±28.9821.67±1.4415.00±0.505046.67±35.03ND5.00±0.40NDNDBCYSNDND802.50±9.0126.67±1.4410.00±2.505080.00±10.20ND9.17±3.82NDND變異系數(shù)/%0.000.0018.8661.8672.576.140.0092.830.000.00

表6 18種余甘子中礦質(zhì)元素含量間的相關(guān)系數(shù)

18種余甘子中沒(méi)食子酸的含量差異顯著,其中BCYY的沒(méi)食子酸含量最高,BCYS的含量最低；YMYY的沒(méi)食子酸含量略低于BCYY的，但高于其他種質(zhì)的。這可能是因?yàn)锽CYY和YMYY為“盈玉”新品種,YMYY種植于元謀,BCYY種植于賓川,是選育出的新品種,其單果果形較大,單果均重38.43 g[27],因是人工種植的品種,外部施加化肥和水分較為充足，可能導(dǎo)致沒(méi)食子酸的含量較高。而BCYS中沒(méi)食子酸含量最低,可能是因?yàn)槠湓谝巴馍L(zhǎng)，加之賓川地區(qū)氣溫較高、干旱缺水、缺肥，導(dǎo)致其沒(méi)食子酸的含量較低。方差分析結(jié)果表明：YM02和BCJY中沒(méi)食子酸含量無(wú)顯著性差異；YMJY和YJ01、YJ06、YJ03、YJ08中沒(méi)食子酸含量無(wú)顯著性差異；在其余種質(zhì)間沒(méi)食子酸的含量均具有顯著性差異。這可能是因?yàn)榇紊x產(chǎn)物的合成與積累除了受遺傳特性的影響外,還可能與環(huán)境因子、土壤、人工種植與否、采摘時(shí)間等因素有關(guān)[26,28]。

圖4 18種余甘子中礦質(zhì)元素含量的聚類分析樹狀圖

表7 18種余甘子中沒(méi)食子酸含量與礦質(zhì)元素含量間的相關(guān)系數(shù)

余甘子除了富含鞣質(zhì)、多酚、黃酮、多糖等多種有效化學(xué)成分外,還含有對(duì)人體健康極其重要的微量元素,其在機(jī)體中起著非常重要的作用,與機(jī)體正常代謝等生理功能息息相關(guān)[29]，例如：骨骼的發(fā)育功能不僅與礦質(zhì)元素Ca有關(guān),還與微量元素Fe、Mn、Zn有關(guān);Mg具有預(yù)防心臟動(dòng)脈硬化、降低“三高”發(fā)生幾率的功效;Cu會(huì)對(duì)機(jī)體的毛發(fā)色素、自由基解毒、造血機(jī)能、神經(jīng)遞質(zhì)分泌和血液凝固等方面有影響[29]。本研究分析了18種余甘子中20種礦質(zhì)元素含量的差異性,發(fā)現(xiàn)K、Mg元素的含量較高,而Ni、Cr元素的含量較低；余甘子富含人體必需的微量元素Fe、Cu、Si、Zn、Ni、B和Mn,同時(shí)含有人體必需的礦質(zhì)元素Ca、Mg、P和Na,而有害元素Pb、Cd未檢出。在不同余甘子種質(zhì)間個(gè)別礦質(zhì)元素的含量差異顯著,例如YM05中Fe元素的含量是YJ05的7.6倍。這可能是因?yàn)橛喔首又械V質(zhì)元素含量與其生長(zhǎng)土壤所含的礦質(zhì)元素含量有一定關(guān)系[30]。

礦質(zhì)元素之間存在著復(fù)雜的相互作用機(jī)制,既有協(xié)同、拮抗,又有替換、補(bǔ)充等關(guān)系[31]。相關(guān)分析結(jié)果顯示：18種余甘子中Fe元素與Al、B、Cr、Ni、Ca、Na、Si元素之間存在極顯著的正相關(guān)關(guān)系；Cu與P呈極顯著負(fù)相關(guān)。利用系統(tǒng)聚類法對(duì)18種余甘子中的礦質(zhì)元素含量進(jìn)行聚類分析,最終將18種余甘子樣品分為3個(gè)類群：YM02、YM03、YMJY、YJ05、YJ06、YJ07、YJ08、BCYY、BCYS為Ⅰ類群;YM01、YM04、YM05、YJ01、YJ02、YJ03為Ⅱ類群;YMYY、YJ04、BCJY為Ⅲ類群。

本研究對(duì)18種余甘子中的沒(méi)食子酸含量和礦質(zhì)元素含量進(jìn)行了雙變量相關(guān)性分析,發(fā)現(xiàn)沒(méi)食子酸含量與Ca元素含量存在極顯著的負(fù)相關(guān),與Na元素含量存在顯著的負(fù)相關(guān),說(shuō)明余甘子中的沒(méi)食子酸與Ca、Na元素存在拮抗作用。因此,研究余甘子有效活性成分與礦質(zhì)元素之間的相關(guān)性，以及不同生態(tài)環(huán)境條件對(duì)余甘子次生代謝產(chǎn)物含量的影響,對(duì)于其良種培育、養(yǎng)分管理、現(xiàn)代化栽培生產(chǎn)具有重要意義[32]。