陳 敢 周姍姍 關(guān)昌杰 劉日光 秦曙光

廣州市第一人民醫(yī)院腎內(nèi)科 (廣州 510180)

慢性腎衰竭(CRF)是各種慢性腎臟疾病發(fā)展的最終階段，腎小管間質(zhì)纖維化在慢性腎臟疾病進(jìn)展中起重要作用[1]。越來(lái)越多的研究表明[2]，導(dǎo)致腎臟纖維化的腎小管上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)伴隨著上皮細(xì)胞間連接(tight junction)的破壞和失去粘附能力。尿酸是人類嘌呤代謝的終產(chǎn)物，有研究表明，高尿酸通過(guò)影響腎小管上皮細(xì)胞功能紊亂從而導(dǎo)致高血壓和腎間質(zhì)損害，最終形成惡性循環(huán)導(dǎo)致腎功能衰竭[3]。草酸鈣晶體液刺激MDCK細(xì)胞，引起MDCK細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)分化，緊密連接蛋白表達(dá)及功能下調(diào)，其有增強(qiáng)腎間質(zhì)小管損傷，提示緊密連接可能是草酸鈣晶體液誘導(dǎo)腎間質(zhì)EMT的啟動(dòng)環(huán)節(jié)[4]。而有關(guān)高尿酸血癥誘導(dǎo)腎間質(zhì)纖維化小管上皮細(xì)胞緊密連接蛋白表達(dá)關(guān)系的研究甚少。緊密連接蛋白中最重要的是跨膜蛋白o(hù)ccludin與胞質(zhì)附著蛋白ZO家族及細(xì)胞內(nèi)與其相連的細(xì)胞骨架蛋白，occludin與ZO-1的表達(dá)和分布與上皮細(xì)胞通透性密切相關(guān)[5]。故本實(shí)驗(yàn)我們利用高尿酸血癥誘導(dǎo)大鼠腎間質(zhì)纖維化模型觀察高尿酸血癥腎損害及腎間質(zhì)纖維化發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中，緊密連接蛋白o(hù)ccludin與ZO-1的表達(dá)變化以及它與高尿酸血癥誘導(dǎo)腎間質(zhì)纖維化間的關(guān)系，并應(yīng)用降尿酸藥物非布司他觀察其對(duì)大鼠高尿酸血癥所致緊密連接蛋白表達(dá)異常及與腎間質(zhì)纖維化的關(guān)系。為尋找腎間質(zhì)纖維化發(fā)生、發(fā)展中的治療靶點(diǎn)，為CKD進(jìn)行性發(fā)展的防治提供重要的理論依據(jù)和新的思路。

1 材料與方法

1.1 選用SPF級(jí)健康雄性SD大鼠30只(購(gòu)自廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心),隨機(jī)分為正常對(duì)照組—正常組；高尿酸血癥模型組—模型組；非布司他干預(yù)組—干預(yù)組(n=10)。飼養(yǎng)于中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室，所有對(duì)大鼠操作均符合動(dòng)物倫理委員會(huì)的要求。

1.2 主要試劑

非布司他(江蘇萬(wàn)邦生物醫(yī)藥有限公司)，氧嗪酸、尿酸(購(gòu)自美國(guó)Sigma化學(xué)公司)，Trizol總RNA抽提試劑盒、SYBR Green1染料(購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司)。

1.3 方法

1.3.1 分組與造模：氧嗪酸(oxonic acid,OA)和非布司他配無(wú)菌蒸餾水溶解,尿酸用自來(lái)水溶解，均配置成所需濃度。模型組和干預(yù)組喂飼氧嗪酸,每日3次,同時(shí)給予尿酸水每日飲用[6]；干預(yù)組則于建立模型的同時(shí)給予非布司他灌胃,每日1次〔7〕；正常組給予等量的蒸餾水灌胃，自來(lái)水飲用，各組均連續(xù)給藥6周。水合氯醛腹腔注射麻藥，取各組大鼠腎臟組織，分別做免疫組化和熒光定量PCR。

1.3.2 腎臟組織學(xué)分析 將腎組織經(jīng)10%的中性甲醛溶液中固定過(guò)夜，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，切片(4 μm厚度)后，進(jìn)行馬松三色(Masson)染色分析。

1.3.2.1 腎臟免疫組化 石蠟切片常規(guī)脫蠟水化后，3%H2O2室溫孵育10 min，高壓處理修復(fù)抗原，小牛血清封閉非特異性抗原，分別加入兔抗大鼠ZO-1、occludin多克隆抗體(美國(guó)Zymed 1:100)，4 ℃孵育過(guò)夜，顯微鏡下觀察，蘇木素襯染，脫水、封片。

1.3.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè) ZO-1、occludin mRNA表達(dá)水平，降Trizol試劑盒提取腎臟組織總mRNA，隨后取3 mL RNA模板做逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，按實(shí)際說(shuō)明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,按SYBR Green 試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列見(jiàn)表1，以GAPDH作為內(nèi)參使每個(gè)樣品的目標(biāo)基因標(biāo)準(zhǔn)化。

表1 PCR引物序列

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 各組生化指標(biāo)的變化

第6周時(shí)模型組和干預(yù)組血尿酸均增高(均P<0.01)。血肌酐和血尿素氮在模型組和干預(yù)組高于正常組(均P<0.01)。而干預(yù)組較模型組低(P<0.05)；見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠第6周血生化指標(biāo)變化

2.2 腎臟組織Masson染色觀察

比較三組大鼠腎臟組織RIF指數(shù)[8]，與正常組相比，模型組、干預(yù)組RIF指數(shù)均增高(均P<0.05)，干預(yù)組RIF指數(shù)低于模型組，高于正常組(均P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 三組大鼠6周時(shí)腎臟組織RIF指數(shù)

2.3 ZO-1、occludin免疫組化表達(dá)結(jié)果 與正常組相比，模型組、干預(yù)組ZO-1、occludin蛋白表達(dá)量顯著減少(均P<0.05)，干預(yù)組ZO-1、occludin表達(dá)量高于模型組，低于正常組(均P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 各組大鼠腎臟組織6周ZO-1、occludin蛋白表達(dá)光密度值(IOD)變化變化

2.4 ZO-1 、occludin mRNA的表達(dá)情況

實(shí)驗(yàn)6周時(shí)與正常組織比較，模型組ZO-1 mRNA表達(dá)是正常組的0.118倍(P<0.05)，干預(yù)組ZO-1 mRNA表達(dá)是正常組的0.510倍(P<0.05)；模型組occludin mRNA表達(dá)是正常組的0.128倍(P<0.05)，干預(yù)組occludin mRNA表達(dá)是正常組的0.385倍(P<0.05)。見(jiàn)表5、圖1。

表5 各組大鼠腎臟組織6周ZO-1、occludin mRNA(相對(duì)定量數(shù)值(2—△△Ct))表達(dá)的變化

圖1 ZO-1和occludin RT-PCR產(chǎn)物電泳

3 討 論

跨膜蛋白o(hù)ccludin與胞質(zhì)附著蛋白ZO-1是緊密連接蛋白中最重要的細(xì)胞骨架蛋白，在人體各組織器官中均有表達(dá),目前研究表明，上皮細(xì)胞緊密連接蛋白參與機(jī)體多種生理過(guò)程，同時(shí)也參與了多種病理機(jī)制過(guò)程。許多腎臟病理狀態(tài)下伴隨著上皮細(xì)胞緊密連接蛋白結(jié)構(gòu)和功能的改變，腎小管上皮細(xì)胞緊密連接的改變可影響腎小管上皮屏障功能并改變內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，從而啟動(dòng)慢性腎小管間質(zhì)纖維化[9]，而高尿酸血癥致慢性腎小管間質(zhì)纖維化中對(duì)緊密連接蛋白影響的研究很少，本研究通過(guò)氧嗪酸聯(lián)合尿酸方法復(fù)制大鼠高尿酸血癥模型[7]，實(shí)驗(yàn)表現(xiàn)為血尿酸顯著升高且腎功能顯著下降。實(shí)驗(yàn)選取非布司他作為腎臟保護(hù)的陽(yáng)性對(duì)照組。非布司他是近年來(lái)一種新型的降尿酸藥物，它是非嘌呤類黃嘌呤氧化酶抑制劑，可以高度選擇性的抑制黃嘌呤氧化酶，不受氧化或還原狀態(tài)的影響，抑制尿酸的生成,延緩腎間質(zhì)纖維化，延緩腎功能衰竭[10]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示高尿酸血癥成模后6周及非布司他干預(yù)組大鼠RIF指數(shù)明顯增加,兩組相比干預(yù)組較低(P<0.05)但高于正常組(P<0.05)，說(shuō)明大鼠腎間質(zhì)纖維化明顯增加。模型組、干預(yù)組大鼠腎臟組織ZO-1 、occludin mRNA表達(dá)量較正常組明顯降低(均P<0.01)，但干預(yù)組較模型組增高(P<0.05)，Peerapen P[4]等研究發(fā)現(xiàn),在草酸鈣晶體液刺激MDCK細(xì)胞，通過(guò)免疫熒光發(fā)現(xiàn)緊密連接蛋白表達(dá)量減少，Zeisber[11]等研究表明ZO-1在EMT過(guò)程中受到抑制，表達(dá)相應(yīng)減少，而移植腎缺血再灌注之后，緊密連接蛋白ZO-1與粘附連接蛋白的表達(dá)均降低，在細(xì)胞內(nèi)的分布發(fā)生改變[12]。這與我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ZO-1、occludin的表達(dá)與高尿酸血癥引起的腎間質(zhì)纖維化呈負(fù)相關(guān)(r=- 0.996,P<0.01)。由于ZO-1、occludin的表達(dá)減少時(shí)已出現(xiàn)腎間質(zhì)纖維化，故緊密連接蛋白的表達(dá)減少是高尿酸血癥腎間質(zhì)纖維化的原因還是結(jié)果，尚無(wú)法定論。而本實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用非布司他干預(yù)血尿酸濃度，能顯著改善ZO-1、occludin的表達(dá)，推測(cè)血尿酸濃度高低可能影響緊密連接蛋白的表達(dá)，至于是否通過(guò)其他因子影響緊密連接蛋白的表達(dá)尚有待進(jìn)一步研究。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)，非布司他對(duì)大鼠腎功能的保護(hù)作用具有顯著性意義。

由于腎間質(zhì)纖維化早期階段EMT是可逆的，所以盡早干預(yù)有可能誘導(dǎo)已發(fā)生的EMT的腎小管上皮細(xì)胞恢復(fù)正常，維持腎臟正常的組織結(jié)構(gòu)和功能[13]。通過(guò)本研究，明確了高尿酸血癥能下調(diào)ZO-1和occludin的表達(dá)，且低表達(dá)的ZO-1和occludin能有效促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生EMT，這不僅加深了對(duì)EMT及高尿酸血癥腎間質(zhì)纖維化的認(rèn)識(shí)，還提示增加ZO-1和occludin的表達(dá)和功能可作為一個(gè)新的高尿酸血癥腎病治療靶點(diǎn)。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)，在高尿酸血癥大鼠腎間質(zhì)纖維化發(fā)展過(guò)程中，隨著大鼠腎間質(zhì)EMT的發(fā)展，緊密連接蛋白的表達(dá)下調(diào)，非布司他具有減輕緊密連接蛋白表達(dá)下調(diào)的作用，說(shuō)明非布司他對(duì)大鼠腎功能的保護(hù)作用具有顯著性意義，為CKD進(jìn)行性發(fā)展的防治提供重要試驗(yàn)依據(jù)和新的思路。