鞏 雪，常 江，李丹婷，孫智慧

（1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)輕工學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150028；2.哈爾濱商業(yè)大學(xué)教務(wù)處，黑龍江 哈爾濱 150028）

扇貝是扇貝屬雙殼類軟體動(dòng)物的代稱，是我國(guó)沿海主要養(yǎng)殖貝類之一[1]，據(jù)統(tǒng)計(jì)，中國(guó)貝類產(chǎn)量為1 447.36萬(wàn) t，其中扇貝產(chǎn)量為186.05萬(wàn) t[2]。扇貝的貝殼和珍珠層具有很高的利用價(jià)值，而扇貝的貝肉特別是閉殼肌（瑤柱）味道鮮美，富含多種人體所需的氨基酸、微量元素（鈣、鋅、硒和碘等）、蛋白質(zhì)、?；撬岷投喾N不飽和脂肪酸，特別是ω-3多不飽和脂肪酸（主要是二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸）含量相當(dāng)高[3-4]，可以使肝臟中的載脂蛋白B和甘油三酯合成膽固醇的效率降低，改善人體的脂質(zhì)代謝[5]，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和保健功效[6-7]，故與海參、鮑魚齊名，被列為海味中的珍品[8]。隨著人們生活水平的提高，扇貝也受到越來(lái)越多消費(fèi)者的青睞[9]，作為中國(guó)重要的海洋經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖貝類，扇貝主要以活品形式流通，部分以閉殼肌為主的即食與干制加工品形式流通[10]；因此脫殼工藝在生產(chǎn)過(guò)程中顯得尤為重要。然而，當(dāng)前我國(guó)貝類脫殼加工仍以手工操作為主，效率低下，衛(wèi)生亦不達(dá)標(biāo)；歐美等發(fā)達(dá)國(guó)家應(yīng)用較多的超高壓脫殼技術(shù)表現(xiàn)出良好的優(yōu)越性，因而備受關(guān)注。但超高壓脫殼技術(shù)依然存在脫殼效率穩(wěn)定性低、貝肉品質(zhì)均一性差等問(wèn)題，且該技術(shù)的脫殼機(jī)理至今尚未明確，因此，展開超高壓作用對(duì)扇貝界面閉殼肌（貝殼與閉殼肌接觸面以上2 mm厚度的閉殼肌段）結(jié)構(gòu)的影響及脫殼機(jī)理的研究與探討是極為必要的。

1 材料與方法

1.1 材料

以遼寧沿海盛產(chǎn)的海灣扇貝為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，扇貝購(gòu)買于遼寧省錦州市渤海大學(xué)海鮮市場(chǎng)，由于超高壓腔室入口直徑的限制，不宜選擇體積過(guò)大扇貝，但需盡量挑選大小相近的個(gè)體，扇貝質(zhì)量為（48±5）g，最長(zhǎng)軸直徑為（97±5）mm。

1.2 儀器與設(shè)備

HPP.L2-600超高壓處理設(shè)備 天津華泰森淼生物工程技術(shù)股份有限公司；S-4800場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡 日本日立公司；LabRAM HR Evolution拉曼光譜分析儀 法國(guó)HORIBA Jobin Yvon公司；ALPHA1-2LD plus冷凍干燥機(jī) 德國(guó)Martin Christ公司；H1850高速離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；PL602-L分析天平 瑞士Mettler Toledo公司。

1.3 方法

1.3.1 試樣處理

將所購(gòu)買的扇貝表面清洗干凈，在聚乙烯包裝袋（200 mm×150 mm）內(nèi)注入50 mL 3 g/100 mL NaCl溶液后，放入1 個(gè)扇貝并封口，再將密封好的扇貝置入超高壓處理設(shè)備，分別以100、200 MPa和300 MPa的實(shí)驗(yàn)壓力進(jìn)行處理（每個(gè)處理30 個(gè)扇貝），保持2 min后取出，分離扇貝貝殼與閉殼肌后，測(cè)定脫殼率和界面閉殼肌結(jié)構(gòu)，每次測(cè)定進(jìn)行3 次平行實(shí)驗(yàn)，并取平均值。

1.3.2 脫殼率測(cè)定

對(duì)經(jīng)過(guò)超高壓處理（100、200、300、400 MPa處理不同時(shí)間）的扇貝進(jìn)行開殼，記錄完全脫殼（貝殼與貝肉完整剝離，貝殼上無(wú)殘留貝肉）的扇貝數(shù)，并按下式計(jì)算脫殼率。

1.3.3 拉曼光譜分析

取分離后的閉殼肌，并將界面閉殼肌沿縱軸切下，并分切成0.5 cm×0.5 cm×0.2 cm小塊，利用拉曼光譜分析儀進(jìn)行分析，拉曼光譜分析儀分析參數(shù)：激發(fā)波長(zhǎng)515.4 nm、狹縫寬度200 μm、功率129 mW、曝光時(shí)間60 s、掃描3 次、檢測(cè)的波長(zhǎng)范圍400～4 000 cm－1。最后取3 次結(jié)果的平均值繪制拉曼光譜圖，得到的數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)Labspec 5.0軟件處理后，利用Alix軟件進(jìn)行曲線擬合并計(jì)算出蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的相對(duì)含量[11-12]。

1.3.4 掃描電子顯微鏡觀察

取界面閉殼肌樣品（2 mm×2 mm×0.5 mm），用體積分?jǐn)?shù)為2.5%戊二醛溶液固定24 h，取出后用0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液漂洗3 次，每次10 min，然后分別用體積分?jǐn)?shù)50%、60%、70%、80%、90%和100%的乙醇梯度洗脫，每次10 min，再用冷凍干燥機(jī)干燥。干燥后的樣品進(jìn)行離子漸射鍍金，在場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡下進(jìn)行觀察、拍照。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

實(shí)驗(yàn)均設(shè)3 組平行，用Excel軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)算出平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，用Origin 8.5軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 超高壓處理對(duì)扇貝脫殼率的影響

脫殼是扇貝加工生產(chǎn)中不可或缺的重要工序，脫殼率和脫殼效果影響扇貝加工生產(chǎn)效率和產(chǎn)品品質(zhì)。扇貝在100 MPa壓力下進(jìn)行短時(shí)間處理，貝殼與貝肉無(wú)法實(shí)現(xiàn)完全剝離，由圖1可見，當(dāng)保壓時(shí)間延長(zhǎng)至240 s時(shí)，脫殼率提高到90%，當(dāng)壓力升高到300 MPa，瞬時(shí)就可以使脫殼率接近100%，但是，當(dāng)壓力升高到400 MPa時(shí)，雖然貝肉可以完整地從扇貝上剝離下來(lái)，但貝殼會(huì)在一定程度上產(chǎn)生破損，因此，采用較低壓力保持較長(zhǎng)時(shí)間或者300 MPa左右的超高壓壓力瞬時(shí)處理都可以達(dá)到完整脫殼的目的。根據(jù)脫殼率結(jié)果，確定后續(xù)實(shí)驗(yàn)壓力為100～300 MPa。

圖1 超高壓處理對(duì)扇貝脫殼率的影響Fig. 1 Shelling efficiency of UHP-treated scallops as a function of pressure

超高壓設(shè)備增壓過(guò)程時(shí)間比較短，扇貝在處理過(guò)程中，壓力升高至100、200 MPa和300 MPa的過(guò)程對(duì)試樣影響比較小，主要作用集中在壓力穩(wěn)定后保持的過(guò)程中，因此，后續(xù)的實(shí)驗(yàn)未考慮增壓過(guò)程對(duì)試樣的影響。

2.2 超高壓處理對(duì)扇貝界面閉殼肌結(jié)構(gòu)的影響

實(shí)驗(yàn)所使用的扇貝閉殼肌厚度為20～30 mm，但是閉殼肌與貝殼的接觸面只有上下兩端，中間段閉殼肌并未與扇貝貝殼接觸，在研究脫殼機(jī)理之前，針對(duì)接觸面位置閉殼肌和非接觸面位置閉殼肌在超高壓處理時(shí)的結(jié)構(gòu)變化情況進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，接觸面位置的扇貝閉殼肌對(duì)超高壓壓力的敏感度要遠(yuǎn)大于非接觸面的閉殼肌，因此，在研究扇貝脫殼機(jī)理時(shí)，與貝殼接觸位置的閉殼肌才具有一定的研究意義。將貝殼與閉殼肌接觸面以上2 mm厚度的閉殼肌段定義為界面閉殼肌，并以界面閉殼肌為研究對(duì)象，利用拉曼光譜和掃描電子顯微鏡等分析手段對(duì)施加不同超高壓條件的扇貝界面閉殼肌進(jìn)行測(cè)定，通過(guò)對(duì)蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)和微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，得出閉殼肌結(jié)構(gòu)變化對(duì)閉殼肌纖維蛋白力學(xué)性能的影響。

2.2.1 不同壓力對(duì)扇貝界面閉殼肌拉曼光譜的影響

由圖2可知，界面閉殼肌的拉曼光譜圖特征峰主要集中在兩個(gè)波段，一段集中在500～1 800 cm－1，這個(gè)范圍通常被認(rèn)為是指紋圖譜區(qū)，主要體現(xiàn)的是扇貝界面閉殼肌中氨基酸殘基的微環(huán)境和蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象；另外一個(gè)波段集中出現(xiàn)在2 800～3 050 cm－1，為—CH伸縮振動(dòng)區(qū)[13-16]。經(jīng)過(guò)不同壓力保持2 min的處理，閉殼肌的各特征峰位置保持不變，但峰強(qiáng)度發(fā)生了比較明顯的變化，特別是在壓力為200 MPa和300 MPa時(shí)，相對(duì)于未處理組和100 MPa處理組，其峰型突然變得非常陡峭，且與未處理的扇貝界面閉殼肌相比，表征界面閉殼肌主鏈的酰胺III帶（1 333 cm－1）和酰胺I帶（1 657 cm－1）特征峰的強(qiáng)度明顯增強(qiáng)[17-19]，這主要是由于在壓力的作用下，蛋白質(zhì)分子間的作用力發(fā)生了變化，比較低的壓力可以促進(jìn)氫鍵的形成，使蛋白質(zhì)在酰胺III帶和酰胺I帶特征峰強(qiáng)度增大，但隨著壓力的增加，氫鍵的形成更加困難，并且還有部分氫鍵在壓力的作用下被打開，所以隨著壓力的升高，峰強(qiáng)度逐漸減弱；在942 cm－1處的C＝C伸縮振動(dòng)特征峰強(qiáng)度隨著壓力的升高而出現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，但相比于未處理的扇貝界面閉殼肌，超高壓處理組的特征峰強(qiáng)度明顯增大，該位置屬于α-螺旋結(jié)構(gòu)的特征峰，這說(shuō)明在剛剛產(chǎn)生壓力的時(shí)候，壓力促進(jìn)了α-螺旋結(jié)構(gòu)的形成而使其含量增大，但隨著壓力的增加，分子間作用力被破壞，氫鍵很難保持原有的結(jié)構(gòu)而被打開，此時(shí)，α-螺旋結(jié)構(gòu)的含量有所降低[20-24]。

圖2 不同壓力處理的扇貝界面閉殼肌拉曼光譜圖Fig. 2 Raman spectra of scallop adductor muscle treated at different pressures

2.2.2 不同壓力處理對(duì)扇貝界面閉殼肌蛋白質(zhì)主鏈構(gòu)象及二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

在拉曼光譜中，1 600～1 700 cm－1是酰胺I帶的特征譜帶，在這一個(gè)區(qū)域內(nèi)提供了蛋白質(zhì)分子之間C＝O的伸縮振動(dòng)、肽鏈內(nèi)部的C—N伸縮振動(dòng)、C—N以及N—H的面內(nèi)彎曲振動(dòng)等關(guān)于蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的信息[25-26]，而二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化會(huì)對(duì)扇貝的脫殼產(chǎn)生比較重要的影響。拉曼光譜在酰胺I帶區(qū)域的譜帶信息能用于定量蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)和反映主鏈構(gòu)象，在超高壓壓力的作用下，多肽分子間氫鍵發(fā)生改變的難易程度會(huì)影響蛋白質(zhì)分子構(gòu)象，也會(huì)影響酰胺I帶的拉曼光譜圖譜信息[27]；因此，利用拉曼光譜圖譜對(duì)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，對(duì)研究蛋白質(zhì)的構(gòu)象和扇貝脫殼機(jī)理有非常重要的作用。

利用拉曼光譜分析儀自帶的Labspec 5.0軟件對(duì)所得到的光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行去除基線、扣除熒光背景等處理，以并不受蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)影響的苯丙氨酸環(huán)（1 004 cm－1）作為內(nèi)標(biāo)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理，處理后的數(shù)據(jù)利用Alix軟件進(jìn)行去卷積、二階求導(dǎo)及曲線擬合，對(duì)拉曼光譜進(jìn)行分峰處理，得到分峰和迭代擬合曲線如圖3所示。

圖3 不同超高壓壓力下扇貝界面閉殼肌蛋白質(zhì)酰胺I帶分峰和迭代擬合曲線Fig. 3 Protein amide I band peaks and iterative fitting curves of scallop adductor muscle treated at different pressures

通過(guò)計(jì)算圖3中蛋白質(zhì)α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲所對(duì)應(yīng)的峰面積比例，得到貝殼界面位置閉殼肌蛋白質(zhì)各二級(jí)結(jié)構(gòu)的相對(duì)含量，結(jié)果如表1所示。隨著壓力的升高，α-螺旋結(jié)構(gòu)相對(duì)含量降低、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)的相對(duì)含量均逐漸增大。與未處理組α-螺旋結(jié)構(gòu)相對(duì)含量（74.69%）相比，100 MPa處理組α-螺旋結(jié)構(gòu)的相對(duì)含量降低了8.64%，當(dāng)壓力升高至300 MPa時(shí)，α-螺旋結(jié)構(gòu)的相對(duì)含量?jī)H為52.61%，比未處理的扇貝界面閉殼肌減少了29.56%，說(shuō)明在2 min的處理時(shí)間下，多肽鏈間的氫鍵穩(wěn)定性受壓力的影響比較大，在壓力升高的過(guò)程中，穩(wěn)定性逐漸變差。當(dāng)壓力為100 MPa時(shí)，β-折疊結(jié)構(gòu)的相對(duì)含量為8.94%，與未處理組相比提高了96.92%，而當(dāng)壓力升高至300 MPa時(shí)，β-折疊結(jié)構(gòu)的相對(duì)含量提高至21.45%，與未處理扇貝界面閉殼肌相比提高了3.72 倍，說(shuō)明第n個(gè)氨基酸殘基的?；c多肽鏈C端方向的第n＋4個(gè)氨基酸殘基的羰基碳之間形成的氫鍵在超高壓實(shí)驗(yàn)條件下被破壞，同時(shí)相鄰肽鏈主鏈的N—H和C＝O之間形成了有規(guī)律的氫鍵，使α-螺旋結(jié)構(gòu)被伸展為β-折疊結(jié)構(gòu)，因此，β-折疊結(jié)構(gòu)的相對(duì)含量有所增加。與未處理組相比，100、300 MPa處理組的β-轉(zhuǎn)角相對(duì)含量分別提高了6.34%和28.40%，β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)是肽鏈第一個(gè)殘基的C＝O與第4個(gè)殘基的N—H氫鍵形成的一個(gè)緊密的環(huán)，因此β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性比較好，并且降低了多肽鏈方向的阻力，隨著壓力的升高，β-轉(zhuǎn)角相對(duì)含量逐漸增大，說(shuō)明更多的多肽鏈形成了穩(wěn)定的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，多肽鏈的穩(wěn)定性得到提高。隨處理壓力的提高，扇貝界面閉殼肌蛋白質(zhì)中的無(wú)規(guī)卷曲相對(duì)含量雖然有所增加，但增加的幅度比較小，當(dāng)壓力為300 MPa時(shí)，無(wú)規(guī)卷曲的相對(duì)含量最高（10.43%），與未處理組相比僅提高了14.87%。綜上所述，壓力的提高使扇貝界面閉殼肌蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了比較明顯的變化，但變性程度并不高，因?yàn)闊o(wú)序松散肽鏈（無(wú)規(guī)卷曲）相對(duì)含量并沒(méi)有發(fā)生較大的變化。

表1 超高壓壓力對(duì)扇貝界面閉殼肌蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響Table 1 Effect of UHP on protein secondary structure in scallop adductor muscle

2.2.3 不同壓力對(duì)扇貝界面閉殼肌蛋白質(zhì)側(cè)鏈結(jié)構(gòu)的影響

2.2.3.1 超高壓壓力對(duì)酪氨酸殘基的影響

在拉曼光譜圖的830 cm－1和850 cm－1附近出現(xiàn)的費(fèi)米共振雙峰體現(xiàn)的是扇貝界面位置閉殼肌蛋白質(zhì)側(cè)鏈的氨基酸殘基圖譜，它反映了酪氨酸殘基苯環(huán)的取代基振動(dòng)狀態(tài)，通?？梢杂?50、830 cm－1處峰強(qiáng)度的比值（I850cm－1/I830cm－1）來(lái)反映酪氨酸殘基的狀態(tài)，當(dāng)I850cm－1/I830cm－1≥1時(shí)，表示酪氨酸殘基處于暴露狀態(tài)，當(dāng)比值小于1時(shí)則表示酪氨酸殘基處于包埋狀態(tài)[28]。

由圖4可以看出，不同壓力處理?xiàng)l件下的扇貝界面閉殼肌蛋白質(zhì)酪氨酸殘基對(duì)應(yīng)的拉曼光譜圖具有比較大的差別，在830 cm－1和850 cm－1處的費(fèi)米共振雙峰的強(qiáng)度在壓力作用下變化比較明顯，當(dāng)壓力為100 MPa時(shí)，830 cm－1和850 cm－1處的費(fèi)米共振雙峰強(qiáng)度明顯增大，而當(dāng)壓力繼續(xù)升高時(shí)，這兩處的吸收峰強(qiáng)度又逐漸減弱，這說(shuō)明在壓力為100 MPa時(shí)，兩處的振動(dòng)強(qiáng)度最大，酪氨酸殘基苯環(huán)的取代基振動(dòng)也最為明顯。未處理組和100、200、300 MPa處理組的I850cm－1/I830cm－1分別為1.032、1.080、1.080、1.071，說(shuō)明所有組的酪氨酸殘基均處于暴露狀態(tài)，且經(jīng)超高壓處理后暴露的程度要比未處理時(shí)的更明顯，但300 MPa處理組的I850cm－1/I830cm－1比100、200 MPa處理組小，說(shuō)明從200 MPa增加到300 MPa的過(guò)程中，酪氨酸殘基暴露程度降低。因此在壓力不超過(guò)200 MPa時(shí)，扇貝界面閉殼肌的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生了轉(zhuǎn)變，使更多的酪氨酸殘基在多肽鏈的表面暴露出來(lái)，閉殼肌樣品的I850cm－1/I830cm－1增大；當(dāng)壓力超過(guò)200 MPa時(shí)，酪氨酸殘基苯環(huán)上—OH的氧原子由氫鍵的供體逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)槭荏w，I850 cm－1/I830 cm－1減小。

圖4 扇貝界面閉殼肌酪氨酸、色氨酸殘基拉曼光譜圖Fig. 4 Raman spectra of tyrosine and tryptophan residues in scallop adductor muscle protein

2.2.3.2 超高壓壓力對(duì)色氨酸殘基的影響

在拉曼光譜中，755 cm－1附近的區(qū)域通常表征的是蛋白質(zhì)色氨酸所處的微環(huán)境，若該處所對(duì)應(yīng)的峰強(qiáng)度下降，則表示色氨酸殘基趨于暴露，反之則表示色氨酸殘基趨于包埋。由圖4可以看出，壓力升高會(huì)使色氨酸殘基拉曼圖譜所對(duì)應(yīng)的峰強(qiáng)度出現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，當(dāng)壓力為200 MPa時(shí)，755 cm－1處所對(duì)應(yīng)的峰強(qiáng)度最大，而后隨著實(shí)驗(yàn)壓力的增大，峰強(qiáng)度逐漸減小，說(shuō)明壓力在0～200 MPa增加時(shí)，色氨酸殘基在疏水性環(huán)境中包埋程度增加，當(dāng)壓力超過(guò)200 MPa以后，色氨酸殘基逐漸由包埋狀態(tài)向極性環(huán)境中暴露。

2.2.4 不同壓力對(duì)蛋白質(zhì)C—H鍵振動(dòng)作用的影響

拉曼光譜圖2 900 cm－1附近的譜帶表征蛋白質(zhì)芳香族氨基酸、蛋白質(zhì)和多肽中C—H的伸縮振動(dòng)信息。由圖5可知，在不同壓力條件下得到的扇貝界面閉殼肌蛋白質(zhì)的拉曼光譜圖在2 945 cm－1處均出現(xiàn)了一個(gè)非常強(qiáng)烈的尖峰，該特征峰表征的是—CH2—的非對(duì)稱伸縮振動(dòng)或者—CH3的對(duì)稱伸縮振動(dòng)，經(jīng)過(guò)分析還發(fā)現(xiàn)在2 876 cm－1附近出現(xiàn)了一個(gè)次峰，這個(gè)次峰則表征—CH2—的非對(duì)稱伸縮振動(dòng)。關(guān)于拉曼光譜C—H鍵振動(dòng)研究的結(jié)果表明，芳香族氨基酸在蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)中的α-螺旋被伸展時(shí)增強(qiáng)了芳香氨基酸的C—H間的疏水作用，增加了羥基在極性的微環(huán)境中的暴露程度，引起表征C—H伸縮振動(dòng)所對(duì)應(yīng)的拉曼光譜特征峰的強(qiáng)度增大[29]。

由圖5可知，在超高壓壓力的作用下，相比于未處理的扇貝界面閉殼肌，芳香族氨基酸在2 876 cm－1和2 945 cm－1處的峰強(qiáng)度明顯增加，說(shuō)明在不同壓力的超高壓作用下，蛋白質(zhì)均發(fā)生了不同程度的變性，隨著壓力的增加，這兩處特征峰強(qiáng)度出現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，當(dāng)實(shí)驗(yàn)壓力為300 MPa時(shí)，峰強(qiáng)度減弱的程度較小，說(shuō)明在超高壓壓力的作用下，α-螺旋結(jié)構(gòu)的伸展程度比較大，使較多的芳香族氨基酸側(cè)鏈暴露于極性環(huán)境中，從而形成了較強(qiáng)的疏水作用，引起了蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化，導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，從而失去了原有的功能特性。

圖5 扇貝界面閉殼肌蛋白質(zhì)芳香族氨基酸拉曼光譜圖Fig. 5 Raman spectra of aromatic amino acid residues in scallop adductor muscle protein

2.2.5 不同壓力對(duì)扇貝界面位置閉殼肌蛋白質(zhì)二硫鍵構(gòu)型的影響

二硫鍵在穩(wěn)定某些蛋白的三維結(jié)構(gòu)上起著重要的作用。在拉曼光譜中，二硫鍵的振動(dòng)體現(xiàn)出不同的特征，一般來(lái)說(shuō)，二硫鍵的特征譜帶通常出現(xiàn)在500～550 cm－1附近，且在拉曼峰中可以體現(xiàn)出分子內(nèi)部或分子間巰基與二硫鍵之間的轉(zhuǎn)化關(guān)系。

由圖6可以看出，與未處理組相比，扇貝界面閉殼肌蛋白質(zhì)中二硫鍵所對(duì)應(yīng)的拉曼光譜特征峰發(fā)生了比較明顯的偏移。當(dāng)二硫鍵的特征峰在515～525 cm－1之間時(shí)，表征二硫鍵的g-g-t構(gòu)象，當(dāng)二硫鍵的特征峰在535～545 cm－1之間時(shí)，表征二硫鍵的t-g-t構(gòu)象。因此，當(dāng)壓力為200 MPa時(shí)，蛋白質(zhì)二硫鍵的構(gòu)象發(fā)生了轉(zhuǎn)變，由原本的g-g-t構(gòu)象變成了t-g-t構(gòu)象；當(dāng)壓力為300 MPa時(shí)，二硫鍵的拉曼特征峰又向低頻方向移動(dòng)了8 cm－1，位于527 cm－1附近區(qū)域，這說(shuō)明二硫鍵又出現(xiàn)重新形成g-g-t構(gòu)象的趨勢(shì)，綜上所述，在保壓時(shí)間為2 min的條件下，200 MPa的壓力能夠引起二硫鍵構(gòu)象的轉(zhuǎn)變，但當(dāng)壓力超過(guò)200 MPa時(shí)，這種轉(zhuǎn)變又產(chǎn)生了可逆的變化，蛋白質(zhì)二硫鍵構(gòu)象被還原。

圖6 扇貝界面閉殼肌蛋白質(zhì)二硫鍵拉曼光譜圖Fig. 6 Raman spectra of disulfide bond in scallop adductor muscle protein

2.3 超高壓處理對(duì)扇貝界面位置閉殼肌微觀結(jié)構(gòu)的影響

由圖7可以看出，未經(jīng)過(guò)處理的扇貝界面閉殼肌呈現(xiàn)出比較連續(xù)完整、均勻分散的纖維，且纖維之間基本保持互相平行分布，形態(tài)具有一定的規(guī)律性。超高壓處理后，閉殼肌纖維發(fā)生了較明顯的變化，當(dāng)壓力為100 MPa時(shí)，閉殼肌纖維變得粗細(xì)不均，并在纖維表面出現(xiàn)了少量的松散結(jié)構(gòu)，這說(shuō)明在超高壓壓力作用下，蛋白質(zhì)原有的規(guī)律性結(jié)構(gòu)被破壞，這與蛋白質(zhì)多肽鏈間氫鍵的變化和蛋白質(zhì)變性有很大的關(guān)系；當(dāng)壓力為200 MPa和300 MPa時(shí)，非纖維性蛋白結(jié)構(gòu)的數(shù)量明顯增多，這可能是由于蛋白質(zhì)中的α-螺旋結(jié)構(gòu)間的氫鍵在實(shí)驗(yàn)壓力的作用下遭到破壞，使得蛋白質(zhì)中的氨基酸側(cè)鏈暴露在多肽鏈的表面。

圖7 不同超高壓壓力下扇貝界面閉殼肌掃描電子顯微鏡圖Fig. 7 SEM images of scallop adductor muscle treated at different pressures

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)針對(duì)超高壓處理對(duì)扇貝界面閉殼肌蛋白質(zhì)主鏈二級(jí)結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)側(cè)鏈結(jié)構(gòu)及二硫鍵的構(gòu)型影響進(jìn)行了研究，借助拉曼光譜儀和掃描電子顯微鏡等儀器對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及性能的變化進(jìn)行了分析。通過(guò)分析結(jié)果可知，蛋白質(zhì)的主鏈結(jié)構(gòu)對(duì)實(shí)驗(yàn)壓力比較敏感，隨處理壓力（100～300 MPa）增加，蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)中的α-螺旋相對(duì)含量降低，β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲相對(duì)含量均升高；酪氨酸殘基均處于暴露狀態(tài)，但在300 MP處理組的暴露程度相對(duì)較低；色氨酸殘基的包埋程度先增加后降低，在200 MPa時(shí)的包埋程度最高。與未處理組相比，200 MPa的壓力能引起二硫鍵構(gòu)象的改變。綜上所述，在超高壓壓力的作用下，蛋白質(zhì)主鏈和側(cè)鏈的結(jié)構(gòu)及空間構(gòu)象都有了比較明顯的變化，這些結(jié)構(gòu)的變化和狀態(tài)的轉(zhuǎn)變對(duì)閉殼肌的力學(xué)特性、與貝殼之間的結(jié)合強(qiáng)度及蛋白質(zhì)的水溶性都有非常顯著的影響，這些力學(xué)及生物特性的變化也會(huì)影響扇貝超高壓脫殼的效果。