蔡玉,鄧明田,劉孜斐,張國敏,馬鍵宇,安世鈺,王智博,張艷麗,王鋒

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)江蘇省家畜胚胎工程實驗室,江蘇 南京 210095)

精子發(fā)生是雄性生殖期的一個循環(huán)過程,保障了哺乳動物種群的正常繁衍和遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定[1]。哺乳動物精子的發(fā)生在睪丸曲精細管上皮進行,主要由3個階段組成:精原細胞的有絲分裂、精母細胞的減數(shù)分裂和成熟精子的形成[2]。在分裂過程中,精原干細胞分化產(chǎn)生精原細胞,促進精子形成[3],同時保持自我更新能力以維持自身數(shù)量穩(wěn)定和精子發(fā)生[4]。因此,精原干細胞是雄性動物精子發(fā)生和生殖的基礎(chǔ)。

氧化應(yīng)激是體內(nèi)活性氧(reactive oxygen species,ROS)與抗氧化劑之間不平衡的結(jié)果,在精子發(fā)生中起著核心作用。適量ROS的產(chǎn)生對于精子獲能和精卵結(jié)合必不可少,但過量的ROS會導(dǎo)致精子脂質(zhì)膜過氧化、DNA損傷、畸形和過度凋亡[5],引起精子發(fā)生障礙,最終造成雄性不育[6]。研究發(fā)現(xiàn),抗氧化治療可在一定程度上提高精子濃度、活力和精子形態(tài)[7]。對干細胞中ROS的研究已有報道,癌癥干細胞中ROS含量較高,種類復(fù)雜,常引發(fā)惡性腫瘤的發(fā)生[8]。在造血、神經(jīng)和肌肉干細胞中,ROS和氧化還原穩(wěn)態(tài)對于干細胞功能維持及其組織動態(tài)平衡至關(guān)重要[9]。隨著人類胚胎干細胞(embryonic stem cells,ESC)的分化,線粒體DNA含量增多,ROS水平升高,過氧化氫酶(catalase,CAT)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)表達量下降[10]。而在成骨分化后,人類間充質(zhì)干細胞中線粒體質(zhì)量和耗氧量顯著增加,抗氧化酶SOD和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GPx)的表達上調(diào),阻斷了細胞內(nèi)ROS的積累[11]。上述結(jié)果說明,干細胞中ROS代謝導(dǎo)致抗氧化酶基因發(fā)生變化,改變干細胞的命運。

果蠅zeste基因增強子人類同源物2(enhancer of zeste homolog 2,EZH2)是polycomb抑制復(fù)合物2(polycomb repressive complex 2,PRC2)中的成員,具有組蛋白H3K27甲基轉(zhuǎn)移酶活性,能夠作為轉(zhuǎn)錄沉默染色質(zhì)的標記,并維持干細胞特性[12]。氧濃度能夠調(diào)控染色質(zhì)修飾基因的轉(zhuǎn)錄水平[13],ROS激活也與表觀遺傳的改變息息相關(guān)[14]。有研究報道,采用EZH2抑制劑3-去氮腺嘌呤A(3-deazaneplanocin A,DZNep)或者小干擾RNA(small interference RNA,siRNA)抑制EZH2在小鼠腎缺血/再灌注損傷模型中的表達后,ROS含量下降,并在體內(nèi)阻斷氧化應(yīng)激激活和凋亡[15],表明EZH2是氧化應(yīng)激的關(guān)鍵調(diào)控因子。與體內(nèi)環(huán)境相比,體外培養(yǎng)是一個靜態(tài)的高氧壓條件,易誘發(fā)精原干細胞中ROS濃度升高,影響其自我更新[16]。然而,EZH2對奶山羊精原干細胞抗氧化能力的影響尚不清楚。本研究通過siRNA技術(shù),進一步借助實時定量PCR(quantitative real time PCR,qPCR)、Western blot和ELISA等試驗方法探究EZH2在奶山羊精原干細胞抗氧化中的作用,為探索精子發(fā)生機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

奶山羊永生化精原細胞系(goat male germline stem cells,mGSC,以下簡稱奶山羊精原干細胞)由陜西省干細胞工程技術(shù)研究中心華進聯(lián)老師課題組分離純化后惠贈[17];奶山羊精原干細胞培養(yǎng)所需的DMEM/F12 glutaMAXTM培養(yǎng)基、0.05 g·L-1胰酶、磷酸緩沖鹽溶液(PBS)、Lipofectamine 3000和Trizol試劑(Invitrogen,USA)均購自美國Thermo Scientific公司;胎牛血清(FBS)購自美國Zeta-Life公司。

定量酶AceQ qPCR SYBR Green Master Mix(Q111-02/03)購自南京諾唯贊公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa(大連)生物公司;相關(guān)引物由南京擎科生物科技公司合成;BCA蛋白濃度檢測試劑盒和免疫熒光試劑盒購自碧云天公司(Beyotime);CAT、SOD2、ACTB單克隆抗體及辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標記的二抗均購自美國Cell Signaling Technology(CST)公司;熒光標記的山羊抗兔二抗購于Boster公司;ECL試劑盒購自南京建成生物有限公司;山羊過氧化氫酶(catalase,CAT)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GPx)活性和丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量檢測的ELISA試劑盒購自南京金益柏生物科技有限公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。NanoDrop 2000分光光度計、全波長酶標儀購自美國Thermo Fisher公司;倒置熒光顯微鏡購自日本Nikon公司;發(fā)光成像系統(tǒng)Image Quant LAS 400購自日本Fiji film公司。

1.2 細胞培養(yǎng)及處理

奶山羊精原干細胞在37 ℃、5% CO2條件下,采用細胞專用培養(yǎng)瓶培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的DMEM/F12 glutaMAXTM培養(yǎng)基中。

采用siRNA技術(shù)干擾EZH2在奶山羊精原干細胞中的表達。EZH2siRNA(簡寫為siEZH2)及陰性對照siRNA(negative control,NC)由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司純化合成。序列對如下:正義鏈5′-GCAGCUUUCUGUUCAACUUTT-3′,反義鏈 5′-AAGUUGAACAGAAAGCUGCTT-3′。將奶山羊精原干細胞傳代至 6孔板中培養(yǎng),待其生長至60%～70%匯合度時,根據(jù)Lipofectamine 3000說明書分別將含有NC和siEZH2的脂質(zhì)體復(fù)合物充分混勻后,室溫靜置15 min,緩慢添加至細胞培養(yǎng)液中,培養(yǎng)48 h后,收集細胞進行后續(xù)試驗。

1.3 qPCR檢測抗氧化相關(guān)基因的表達水平

采用Trizol試劑提取轉(zhuǎn)染48 h后奶山羊精原干細胞的RNA。用NanoDrop 2000分光光度計測定RNA濃度后,用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,隨后用AceQ qPCR SYBR Green Master Mix進行qPCR(Applied Biosystems 7500)檢測抗氧化相關(guān)基因mRNA表達水平,再通過2-ΔΔCT方法進行定量。以管家基因β肌動蛋白基因(β-actin)作為內(nèi)參,每個試驗均獨立重復(fù)3次。用于qPCR的特異性引物序列見表1。

表1 熒光定量PCR中的特異性引物Table 1 Details of primer sequences used for quantitative real-time PCR

1.4 ELISA檢測抗氧化指標的酶活性或含量

細胞轉(zhuǎn)染48 h后,收集上清液,利用ELISA試劑盒檢測CAT、SOD和GPx活性,同時也檢測精原干細胞中脂質(zhì)氧化終產(chǎn)物MDA的含量。批內(nèi)變異系數(shù)均小于10%,批間變異系數(shù)均小于15%。

1.5 免疫熒光檢測EZH2的干擾效率

將奶山羊精原干細胞接種于內(nèi)含爬片的12孔板中,當細胞匯合度達到60%～70%時,固定于4%多聚甲醛中1 h,用0.2% Triton X-100通透1 h;用PBS清洗3次,每次10 min;隨后用50 g·L-1BSA室溫封閉 2 h,加一抗(兔抗EZH2抗體,1∶250稀釋)4 ℃孵育過夜,再次清洗后加熒光標記的抗兔二抗(1∶1 000)避光孵育2 h;然后采用DAPI(4′,6-diamidino-2-phenylindole)染細胞核15 min,PBS清洗3次后,加抗熒光淬滅劑后封片,在激光共聚焦顯微鏡(Carl Zeiss,Germany)下鏡檢并拍照。

1.6 Western blot(WB)檢測抗氧化相關(guān)蛋白的表達水平

收集轉(zhuǎn)染72 h后的細胞樣品,加入含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑(1∶100)的RIPA溶液,置于1.5 mL離心管中,冰上充分裂解30 min后,12 000 r·min-1離心10 min。取上清液采用BCA試劑盒測定蛋白濃度后,將蛋白與上樣緩沖液充分混勻,70 ℃煮沸10 min使蛋白變性,-20 ℃保存?zhèn)溆?。隨后取10 μg(10 μL)樣品進行SDS-PAGE(200 V,40 min),結(jié)束后1.5 V轉(zhuǎn)膜15 min,在50 g·L-1脫脂奶粉中封閉2 h。加一抗,4 ℃孵育過夜,TBST溶液洗滌3次,加HRP標記的山羊抗兔二抗,室溫孵育1 h。一抗和二抗的稀釋比例見表2。隨后滴加ECL超敏發(fā)光液在發(fā)光成像系統(tǒng)Image Quant LAS 400進行曝光,以Actin為內(nèi)參,采用Image J軟件分析條帶灰度值后檢測蛋白相對表達量。

表2 Western blot所用一抗稀釋比例Table 2 The dilution ratio of specific primary antibody for Western blot used in the study

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 奶山羊精原干細胞中EZH2干擾效率的驗證

qPCR和Western blot結(jié)果如圖1所示:與對照組相比,干擾EZH2(siEZH2)極顯著降低了(P<0.01)奶山羊精原干細胞中EZH2的mRNA和蛋白表達水平。此外,免疫熒光檢測結(jié)果顯示:干擾EZH2后,與對照組相比,EZH2的熒光強度極顯著下降(P<0.01),與上述結(jié)果一致,說明siEZH2成功干擾了奶山羊精原干細胞中EZH2的表達,能夠進行后續(xù)試驗。

圖1 奶山羊精原干細胞(mGSC)中EZH2干擾效率的驗證Fig.1 Verification of siEZH2 efficiency of mGSC A. mGSC轉(zhuǎn)染NC和siEZH2后EZH2 mRNA的表達;B. mGSC轉(zhuǎn)染NC和siEZH2后EZH2蛋白的表達;C. 免疫熒光檢測在mGSC轉(zhuǎn)染NC和siEZH2后EZH2蛋白的表達。A. mRNA expression of EZH2 after transfected with NC and siEZH2 in mGSC;B. Protein expression of EZH2 after transfected with NC and siEZH2 in mGSC;C. EZH2 protein expression in EZH2 knockdown mGSC as reflected by immunofluorescence.1)NC:對照組Control group;siEZH2:EZH2 siRNA;2) **表示與對照組相比差異極顯著(P<0.01)。下同。 ** means significant differences at 0.01 level. The same below.

2.2 干擾EZH2對奶山羊精原干細胞抗氧化物水平的影響

采用ELISA檢測細胞培養(yǎng)液中CAT、SOD、GPx活性和MDA含量。如圖2所示:與對照組相比,干擾EZH2后,奶山羊精原干細胞中CAT、SOD和GPx活性極顯著升高(P<0.01),而MDA含量極顯著下降(P<0.01),說明干擾EZH2后提高了精原干細胞的抗氧化能力。

圖2 干擾EZH2對奶山羊mGSC中CAT、SOD、GPx活性和丙二醛(MDA)含量的影響Fig.2 Effects of siEZH2 on the activities of catalase(CAT),superoxide dismutase(SOD),glutathione peroxidase(GPx)and the content of malondialdehyde(MDA)in mGSC

2.3 干擾EZH2對奶山羊精原干細胞抗氧化相關(guān)基因和蛋白表達的影響

采用qPCR、Western blot檢測干擾EZH2后,奶山羊精原干細胞中CAT、SOD2和GPx的mRNA和蛋白相對表達量。如圖3所示:與對照組相比,在奶山羊精原干細胞中干擾EZH2后,CAT、SOD2和GPxmRNA表達量極顯著上升(P<0.01),CAT和SOD2蛋白的表達水平極顯著升高(P<0.01),進一步說明EZH2通過激活抗氧化基因的表達影響奶山羊精原干細胞的抗氧化水平。

圖3 干擾EZH2對奶山羊mGSC中CAT、SOD2和GPx的mRNA(A)和蛋白(B)相對表達水平的影響Fig.3 Effect of siEZH2 on the relative expression level of CAT,SOD2 and GPx mRNA(A) and protein(B)in mGSC

3 討論

氧化應(yīng)激會導(dǎo)致睪丸產(chǎn)生病理損傷,進而造成生精受阻,誘發(fā)雄性不育[18]。精原干細胞的損傷不可逆轉(zhuǎn),最終會導(dǎo)致精子發(fā)生障礙。與其他干細胞類似,精原干細胞具有多向分化和自我更新的能力,使其不斷增殖,防止衰老。ROS信號傳導(dǎo)對于干細胞群體的調(diào)控至關(guān)重要,影響了干細胞穩(wěn)態(tài)和譜系傳承,在干細胞老化過程中具有重要作用[19]。近期研究表明,干細胞對氧化應(yīng)激較為敏感,低氧是線粒體氧化的抑制劑[20],能夠調(diào)節(jié)干細胞命運[21]。此外,ROS既能維持胚胎干細胞的干性和未分化狀態(tài)[22],也能調(diào)節(jié)成體干細胞自我更新和分化之間的平衡[16]。精原干細胞是精子發(fā)生的源頭,雖然在正常狀態(tài)下會產(chǎn)生氧自由基,但是過量的ROS則會導(dǎo)致細胞內(nèi)氧化及抗氧化系統(tǒng)失衡。因此,提高精原干細胞的抗氧化能力是改善生精的重要機制之一。

EZH2是PRC2復(fù)合物的核心組分,屬于組蛋白-賴氨酸-甲基轉(zhuǎn)移酶家族、Ez亞家族,包含SET結(jié)構(gòu)域,是轉(zhuǎn)錄沉默染色質(zhì)的標記,在維持干細胞命運[23]和基因組印跡中具有重要作用[24]。EZH2在人和小鼠的睪丸組織中高表達[25],影響小鼠精原細胞的分化和凋亡[26]。敲除EZH2后導(dǎo)致人類胚胎干細胞的自我更新和分化特性受損[27]。本研究采用siRNA技術(shù)干擾EZH2的表達,探索EZH2在奶山羊精原干細胞抗氧化能力中的作用。經(jīng)過Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染后,qPCR、Western blot和免疫熒光結(jié)果均表明,轉(zhuǎn)染siEZH2能夠極顯著降低奶山羊精原干細胞中EZH2的表達水平,證明采用siEZH2干擾是有效的,能夠進行后續(xù)試驗。在氧化損傷和炎癥過程中,激酶激活與表觀遺傳的改變密切相關(guān)[14],機體可能通過調(diào)節(jié)DNA和組蛋白甲基化等表觀遺傳修飾來清除ROS[28]。有研究表明,低氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)由線粒體ROS產(chǎn)生,與EZH2直接相關(guān),HIF-1α是乳腺癌中PRC2和EZH2功能的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑[29]。EZH2在維持干細胞分化中發(fā)揮關(guān)鍵作用,EZH2表達的增加激活了細胞存活途徑[30]。因此,本試驗在干擾EZH2后,首先檢測了奶山羊精原干細胞中氧化應(yīng)激相關(guān)指標。研究發(fā)現(xiàn),與對照組相比,SOD活性顯著提高,而MDA含量呈現(xiàn)下降趨勢,這與在心肌缺血再灌注模型中的結(jié)果類似[31],說明干擾EZH2后,細胞中的氧化及抗氧化系統(tǒng)發(fā)生障礙,降低了氧自由基對細胞的損傷,其作用機制可能與抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、維持細胞內(nèi)氧化及抗氧化系統(tǒng)的平衡有關(guān)。

在進化過程中,機體不斷完善自身的抗氧化防御系統(tǒng),其中一些靶基因在機體抵抗氧化應(yīng)激中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在小鼠胚胎干細胞中,20%氧氣處理組EZH2的轉(zhuǎn)錄水平降低,說明氧氣濃度的高低影響EZH2的轉(zhuǎn)錄水平[13]。有研究通過NaHS處理腸上皮細胞后,GPx活性顯著提高,暗示其增強了細胞的氧化應(yīng)激水平[32]。在牛精液冷凍過程中,添加適量包埋膽固醇的甲基-β-環(huán)糊精顯著增加了CAT、GPx和SOD基因的表達量,提高了凍融牛精子的抗氧化能力[33]。此外,在成骨分化后,人類間充質(zhì)干細胞中SOD和GPx的表達量上調(diào),阻斷了細胞內(nèi)ROS積累[11]。本研究通過qPCR、Western blot檢測發(fā)現(xiàn)干擾EZH2后,CAT、SOD2的mRNA和蛋白水平顯著提高,同時GPx的mRNA表達量顯著上升,與上述結(jié)果一致,說明干擾EZH2能夠避免奶山羊精原干細胞受到氧化損傷,提高細胞的抗氧化性能。細胞防御自身免受氧化應(yīng)激等損傷的“抗氧化應(yīng)答”機制與細胞糖代謝有關(guān),小分子以可逆的方式靶向糖酵解途徑激活抗氧化反應(yīng)[34]。在高糖處理的腎小管上皮細胞中,敲除EZH2阻斷了ROS的積累[35]。本試驗結(jié)果表明EZH2通過調(diào)控奶山羊精原干細胞中相關(guān)基因的表達影響其正常的氧化能力,干擾EZH2可能通過降低ROS水平進而提高精原干細胞的抗氧化能力,但其是否與糖代謝機制相關(guān)仍需進一步驗證。

綜上所述,干擾EZH2可提高奶山羊精原干細胞內(nèi)CAT、GPx和SOD酶活性,降低MDA含量,可能通過調(diào)控CAT、GPx和SOD2基因的表達水平來提高精原干細胞抗氧化能力,但具體分子機制有待深入研究,以上研究結(jié)果將為探索精子發(fā)生相關(guān)機制提供理論參考。

致謝:江蘇省家畜胚胎工程實驗室所有成員和南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生物信息學(xué)中心高性能計算平臺在樣品收集和試驗技術(shù)等方面給予了指導(dǎo)和幫助,謹致謝意。