周妮妮,安家慧,?？尚?于棟,萬(wàn)玉萌,李玉峰

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,江蘇 南京 210095)

副豬嗜血桿菌是豬格拉瑟氏病(Gl?sser’s disease)的病原,可引起豬的多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎[1-2],每年給全球養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[3]。副豬嗜血桿菌菌株分為15種標(biāo)準(zhǔn)血清型[4],血清型1、5、10、12、13和14被認(rèn)為是強(qiáng)毒株,能夠?qū)е仑i的高死亡率,血清型2、4、8和15的毒力較弱,而3、6、7、9和11則被認(rèn)為是無(wú)毒力菌株[5]。副豬嗜血桿菌的強(qiáng)毒株通過(guò)黏附和侵入上皮細(xì)胞而定殖并引發(fā)感染,這些過(guò)程也是感染的第一步[6],并且其侵入細(xì)胞與全身性感染有關(guān)[7]。由于不同血清型菌株間的交叉保護(hù)作用很弱,疫苗控制該疾病的效果不明顯。氟苯尼考已被廣泛用于該病的治療,但對(duì)氟苯尼考耐藥的副豬嗜血桿菌菌株已出現(xiàn)[8]。因此,深入探究副豬嗜血桿菌與宿主之間的相互作用關(guān)系,有助于進(jìn)一步揭示副豬嗜血桿菌的致病機(jī)制。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)被定義為長(zhǎng)度大于200 nt的缺乏蛋白質(zhì)編碼潛力的轉(zhuǎn)錄物。雖然lncRNA在大多數(shù)真核細(xì)胞中都有表達(dá),但在不同的細(xì)胞和組織中發(fā)現(xiàn)的特異性lncRNA群體較mRNA的表達(dá)水平低。lncRNA在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后和表觀遺傳學(xué)水平上調(diào)編碼基因的表達(dá),且在真核細(xì)胞的分化和胚胎發(fā)育中發(fā)揮著重要作用[9-10]。大量數(shù)據(jù)表明,lncRNA可調(diào)節(jié)細(xì)菌感染。在被幽門螺桿菌感染的人胃上皮細(xì)胞中,23種lncRNA上調(diào),21種下調(diào)。幽門螺桿菌陽(yáng)性患者的胃黏膜組織中XLOC-004122和XLOC-014388的水平顯著降低[11]。在lncRNA-Aw112010中“隱藏”的新ORF的翻譯對(duì)于細(xì)菌感染和結(jié)腸炎期間的黏膜免疫至關(guān)重要[12]。越來(lái)越多哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的lncRNA被證實(shí)與免疫功能失調(diào)和宿主防御有關(guān)[13-14]。這包括lncRNA NeST,它通過(guò)增強(qiáng)小鼠體內(nèi)局部IFN-γ的產(chǎn)生來(lái)促進(jìn)沙門氏菌的清除[15]。此外,隨著沙門氏菌在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制,核RNA的降解失調(diào),從而促使另外一組不穩(wěn)定lncRNA的積累,其中一些對(duì)于機(jī)體抵抗細(xì)菌的入侵至關(guān)重要[16]。有研究發(fā)現(xiàn),microRNA miR-1通過(guò)降解胞質(zhì)lncRNA Sros1間接穩(wěn)定Stat1信使RNA來(lái)促進(jìn)巨噬細(xì)胞中干擾素γ介導(dǎo)的李斯特菌的清除[17]。

脊椎動(dòng)物的先天性免疫應(yīng)答是機(jī)體抵抗微生物入侵的第一道防線,作為先天性免疫的重要組成部分,巨噬細(xì)胞在宿主防御感染的過(guò)程中起重要作用,它們通過(guò)釋放細(xì)胞因子和趨化因子來(lái)介導(dǎo)微生物的殺滅,以及引發(fā)、維持和解決宿主的炎癥反應(yīng)[18-19]。豬肺泡巨噬細(xì)胞被認(rèn)為是機(jī)體抵御副豬嗜血桿菌感染的重要防線[20]。副豬嗜血桿菌感染豬體后,在豬肺泡巨噬細(xì)胞中鑒定出多個(gè)差異表達(dá)的基因,這些基因主要與炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)、微管聚合、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)[21]。

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)途徑在控制動(dòng)物細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和最終命運(yùn)的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)中占據(jù)中心位置[22]。作為TGF-β家族的成員,TGF-β1調(diào)節(jié)多種生物學(xué)過(guò)程,包括細(xì)胞程序性死亡、纖維化、細(xì)胞分化、血管生成和細(xì)胞免疫。此外,TGF-β1調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)表達(dá)和一些整合素亞單位。例如TGF-β1上調(diào)上皮細(xì)胞中α5整合素和纖連蛋白(Fn)的表達(dá)[23]。整合素是由α和β亞基組成的糖蛋白,是已知的ECM受體,α5β1整合素可作為纖連蛋白的細(xì)胞受體[24]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA-MEG3的靶基因包括TGF-β途徑基因,其結(jié)合位點(diǎn)的全基因圖譜顯示,MEG3通過(guò)與遠(yuǎn)端調(diào)控元件的結(jié)合來(lái)調(diào)節(jié)TGF-β1基因的活性[25]。我們之前曾報(bào)道過(guò)副豬嗜血桿菌的感染增強(qiáng)了PK-15細(xì)胞中TGF-β1的表達(dá)[26],表明TGF-β1在副豬嗜血桿菌的發(fā)病機(jī)制中起重要作用。

本試驗(yàn)中,我們擬用標(biāo)準(zhǔn)血清型5型副豬嗜血桿菌感染豬肺泡巨噬細(xì)胞3D4/21,用RNA-Seq鑒定差異表達(dá)的lncRNA,探究差異表達(dá)的lncRNA候選基因在副豬嗜血桿菌致病機(jī)制中的潛在作用,為揭示致病菌與其靶標(biāo)間相互作用以及相關(guān)lncRNA的調(diào)控機(jī)制提供一個(gè)新的研究手段。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

Anti-Fibronectin(ab194395)是小鼠單克隆抗體(同種型是IgG1,輕鏈型是K),購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。小鼠抗人CD49e抗體(a5 integrin,555651)購(gòu)自美國(guó)BD Biosciences公司。HRP標(biāo)記的羊抗鼠抗體IgG(H+L)以及鼠抗FLAG標(biāo)簽抗體購(gòu)自南京碧云天生物技術(shù)公司。小干擾RNA(siRNA)轉(zhuǎn)染試劑 Micropoly-transfecterTMCell Reagent 購(gòu)自南通Micropoly公司。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試劑LipoMaxTMReagent購(gòu)自南京SUDGEN公司。熒光定量試劑PowerUpTMSYBRTMGreen Master Mix購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司。RIPA細(xì)胞裂解液購(gòu)自Cell Signaling Technologies公司。Alexa Fluor 488結(jié)合的山羊抗小鼠抗體IgG(H+L)購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司。

1.2 細(xì)菌菌株培養(yǎng)

本試驗(yàn)使用的3種副豬嗜血桿菌的標(biāo)準(zhǔn)血清型菌株(血清型4、5、7,分別稱為Hps4、Hps5和Hps7),菌株編號(hào)依次為SW124、Nagasaki和174。細(xì)菌在37 ℃的胰蛋白酶大豆瓊脂和胰蛋白胨大豆肉湯(以下分別簡(jiǎn)稱為TSA和TSB,購(gòu)自英格蘭OXOID公司)中培養(yǎng),添加有10 g·L-1煙酰胺嘌呤二核苷酸(NAD,南京博全科技有限公司)和5%滅活牛血清(Thermo Fisher)。試驗(yàn)前,將細(xì)菌接種于TSB中,在37 ℃、200 r·min-1條件下培養(yǎng)過(guò)夜,然后用新鮮培養(yǎng)基稀釋,再培養(yǎng)至D600值達(dá)0.6。

1.3 細(xì)胞吞噬副豬嗜血桿菌試驗(yàn)

3D4/21細(xì)胞,源自豬肺泡巨噬細(xì)胞原代細(xì)胞的傳代細(xì)胞系(原代豬肺泡巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)入大T抗原永生化后獲得,ATCC CRL2843)。將細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。所用細(xì)胞培養(yǎng)基RPMI 1640(Gibco)中加入10%滅活胎牛血清(FBS,Gibco)、10 g·L-1青霉素(鏈霉素)和10 g·L-1非必需氨基酸(Sigma)。待細(xì)胞生長(zhǎng)至90%匯合度時(shí),進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

將新鮮培養(yǎng)的副豬嗜血桿菌菌液8 000g離心1 min,然后用無(wú)菌PBS洗滌3次,用RPMI 1640重懸,調(diào)整細(xì)菌密度為2.5×108mL-1,進(jìn)行細(xì)菌感染試驗(yàn),步驟稍作修改[27]。過(guò)夜培養(yǎng)的3D4/21細(xì)胞,在試驗(yàn)前用無(wú)菌PBS洗滌3次,更換為無(wú)抗生素的培養(yǎng)基。將細(xì)胞與不同血清型副豬嗜血桿菌一起孵育,再用紫外線滅活細(xì)菌。將細(xì)胞板800g離心10 min,于溫箱中孵育2 h;用PBS沖洗細(xì)胞5次,加入新鮮的細(xì)胞培養(yǎng)基(包含100 U·mL-1青霉素G和0.25 mg·mL-1慶大霉素);孵育1 h以殺死細(xì)胞外的副豬嗜血桿菌,再用無(wú)菌PBS洗滌細(xì)胞(除去抗生素);向細(xì)胞中加入100 μL的0.25 μg·L-1胰蛋白酶,37 ℃孵育10 min。收集細(xì)胞,12 000g離心10 min,棄上清液,用無(wú)菌PBS重懸細(xì)胞并涂布TSA平板。

1.4 RNA的高通量測(cè)序

共培養(yǎng)6個(gè)T-75細(xì)胞瓶的3D4/21細(xì)胞,其中3個(gè)瓶的細(xì)胞以200 MOI的比例感染細(xì)菌Hps5(命名為Hps5-1、-2和-3),以另外3個(gè)瓶中未感染的細(xì)胞作為對(duì)照(命名為對(duì)照1、2和3)。感染36 h后棄培養(yǎng)基,加無(wú)菌PBS沖洗細(xì)胞3次。從細(xì)胞瓶?jī)?nèi)刮下細(xì)胞,使用Trizol試劑提取細(xì)胞內(nèi)的總RNA。通過(guò) 10 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性,并且使用NanoPhotometer分光光度計(jì)檢查其純度。使用Qubit RNA Assay Kit 和Qubit 2.0 Flurometer測(cè)定RNA濃度。提交RNA樣品至Novogene公司進(jìn)行RNA-seq高通量測(cè)序。獲取的高質(zhì)量數(shù)據(jù)用于后續(xù)分析,包括Q20、Q30和GC含量的計(jì)算。

每個(gè)樣品的映射讀數(shù)是使用Scripture(beta2)[28]和 Cufflinks(v2.1.1)獲取的[29]。利用HTSeq和 SusScrofa 參考基因組(ftp://ftp.bl.org/pub/relea-84/fasta/sus-scrofa/),查找映射基因編碼的蛋白質(zhì)。

1.5 lncRNA和mRNA的鑒定

用Cuffdiff v2.1.1計(jì)算lncRNA和編碼基因的每百萬(wàn)個(gè)圖譜片段(FPKM)和每千堿基外顯子的片段[29]。將每個(gè)基因組中轉(zhuǎn)錄本的FPKM相加來(lái)計(jì)算基因的FPKM。Cuffdiff使用基于負(fù)二項(xiàng)分布的模型為分析數(shù)字轉(zhuǎn)錄本或基因表達(dá)數(shù)據(jù)中的差異表達(dá)提供統(tǒng)計(jì)程序[29]。調(diào)整后P<0.05的轉(zhuǎn)錄本為差異表達(dá)。使用4種分析工具(CNCI v2、CPC v0.9-r2、Pfam-scan v1.3和PhyloCSF v20121028)鑒定新的lncRNA候選基因。只有經(jīng)過(guò)4種工具共同確認(rèn)的lncRNA才能被認(rèn)為是候選者,用轉(zhuǎn)錄本的FPKM檢測(cè)表達(dá)水平,與對(duì)照組表達(dá)水平差異在2.0以上的lncRNA被認(rèn)為表達(dá)差異顯著。

1.6 熒光定量PCR(qPCR)分析差異表達(dá)的lncRNA

參照NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中野豬(Susscrofa)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)的序列,設(shè)計(jì)針對(duì)10個(gè)上調(diào)lncRNA和 TGF-β1 的引物(表1)。持家基因β-actin引物購(gòu)自TaKaRa公司。如上所述,將3D4/21細(xì)胞接種6孔細(xì)胞板并用 5型副豬嗜血桿菌感染。分別在12、24和36 h收集細(xì)胞,提取總RNA,然后用SYBR-Green試劑進(jìn)行qPCR,以β-actin作為內(nèi)參計(jì)算lncRNA的相對(duì)表達(dá)水平。相對(duì)表達(dá)水平的計(jì)算采用2-ΔΔCT法。

表1 本試驗(yàn)所用的引物對(duì)序列Table 1 Primer pairs sequence used in this study

1.7 細(xì)菌感染與lncRNA的表達(dá)

由Biotend Biotechnologies公司設(shè)計(jì)合成靶向LNC_000165(lncRNA 165)的3條小干擾RNA片段(siRNA)(表2)以及1個(gè)非特異性隨機(jī)片段(NC,數(shù)據(jù)未提供)。為優(yōu)化基因沉默的轉(zhuǎn)染條件,接種3D4/21細(xì)胞于24孔細(xì)胞板中,每孔細(xì)胞為1.4×105個(gè)。細(xì)胞生長(zhǎng)至50%的匯合度時(shí),用不同濃度的siRNA片段轉(zhuǎn)染細(xì)胞,然后在不同時(shí)間收集細(xì)胞,測(cè)得靶向lncRNA 165的siRNA片段轉(zhuǎn)染細(xì)胞的最佳劑量為每孔0.06 mol。培養(yǎng)60 h后,以MOI為200的比例,用Hps5感染細(xì)胞。細(xì)菌感染試驗(yàn)具體過(guò)程如1.3所述。收集細(xì)胞,提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行qPCR試驗(yàn)。

表2 靶向lncRNA 165的特異siRNA序列Table 2 SiRNA sequences specific targeting lncRNA 165

利用PCR擴(kuò)增,在lncRNA 165基因序列的N端加上起始密碼子ATG,在C端加上FLAG標(biāo)簽及終止密碼子,并將其克隆到pcDNA 3.1中,構(gòu)建表達(dá)lncRNA 165基因的重組質(zhì)粒。以每孔1.3×105個(gè)細(xì)胞的密度在24孔細(xì)胞板中接種細(xì)胞。細(xì)胞融合度至50%時(shí),轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒(每孔1.0 μg)。孵育24 h后收集細(xì)胞,提取總RNA,用于qPCR試驗(yàn),以計(jì)算lncRNA 165的表達(dá)水平。同時(shí),為了驗(yàn)證lncRNA 165是否正確表達(dá),在冰上將平行樣品置于RIPA緩沖液中裂解,用FLAG抗體進(jìn)行Western blot分析。在24孔細(xì)胞板上接種3D4/21細(xì)胞(每孔1.3×105個(gè))。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到50%匯合度時(shí),用lncRNA 165-FLAG和pcDNA3.1轉(zhuǎn)染細(xì)胞,24 h后,以MOI為200的比例感染Hps5。

1.8 Fn和α 5整合素的表達(dá)

在24孔細(xì)胞板上以每孔1.3×105個(gè)細(xì)胞的密度接種3D4/21細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后,用胰蛋白酶消化細(xì)胞,刮取細(xì)胞到無(wú)菌離心管中,300g離心5 min。用含1% BSA的PBS洗滌細(xì)胞3次,然后分別與纖連蛋白(fibronectin,Fn)和整合素蛋白(α5)抗體(每106個(gè)細(xì)胞加1 μg)在37 ℃孵育30 min。將細(xì)胞洗滌2次后,加入100 μL含1% BSA的PBS重懸,再加入Alexa Fluor 488結(jié)合的山羊抗小鼠抗體IgG(H+L,1∶100稀釋),37 ℃避光孵育30 min。洗滌細(xì)胞后將其重懸于200 μL含1% BSA的PBS中,然后使用流式細(xì)胞儀分析Fn和α5的表達(dá)。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

圖1 CNCI、CPC、Pfam-scan和PhyloCSF 4種分析工具 鑒定3D4/21細(xì)胞中新的lncRNAFig.1 CNCI,CPC,Pfam-scan and PhyloCSF were used to identify novel lncRNA in 3D4/21 cells

2 結(jié)果與分析

2.1 3D4/21細(xì)胞中l(wèi)ncRNA和mRNA的鑒定

利用IlluminaHiSeq 2000平臺(tái)分別對(duì)未感染和感染Hps5的細(xì)胞RNA進(jìn)行高通量測(cè)序分析,產(chǎn)生的對(duì)照1、2、3和Hps5-1、Hps5-2、Hps5-3的清潔讀數(shù)分別為10 616 284、 92 270 238、100 291 152和 103 948 420、105 623 050、10 383 024。Q20(%)值為96.45%～97.52%,大多數(shù)(66.5%)的映射基因編碼蛋白質(zhì)。對(duì)轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行分類并鑒定lncRNA,共有25 512個(gè)mRNA和2 654個(gè)lncRNA,其中1 163個(gè)為有注釋的lncRNA,1 491 個(gè)為新發(fā)現(xiàn)的lncRNA(圖1)。剔除56個(gè)miscRNA和加工轉(zhuǎn)錄本后,2 439 個(gè)為大的基因間非編碼RNA(lincRNA),159個(gè)為反義lncRNA(anti-sense lncRNA),沒(méi)有發(fā)現(xiàn)內(nèi)含子 lncRNA。lncRNA的2種亞型在基因結(jié)構(gòu)和表達(dá)水平上存在較大差異,lincRNA比反義 lncRNA長(zhǎng),中位長(zhǎng)度分別為1.929和1.699 kb(圖2-a)。外顯子的數(shù)量也不同,lincRNA和反義lncRNA的外顯子數(shù)量中值分別是2.6和3.0(圖2-b)。根據(jù)FPKM值,lincRNA的表達(dá)水平高于反義 lncRNA,中位值為8.7和3.9(圖2-c)。

圖2 2種lncRNA亞型轉(zhuǎn)錄長(zhǎng)度(a)、外顯子數(shù)量(b)和表達(dá)水平(c)的比較Fig.2 Comparasion of transcript length(a),number of exons(b)and expression level(c)for two lncRNA subtypes

分析結(jié)果(圖3)顯示:在感染后36 h,與未感染細(xì)胞相比,受感染細(xì)胞中有110個(gè)lncRNA表達(dá)上調(diào),216個(gè)lncRNA表達(dá)下調(diào);同時(shí),分別有1 586和1 039個(gè)mRNA表達(dá)上調(diào)和下調(diào)(圖3-a、c)。分層聚類分析表明,這些轉(zhuǎn)變?cè)诟腥窘M和對(duì)照組中是可重復(fù)的(圖3-b、d)。

圖3 差異表達(dá)的lncRNA和mRNA的分類Fig.3 Classification of differentially expressed lncRNA and mRNA a、c.如果lncRNA的表達(dá)水平(感染/未感染)的log2大于或小于2,并且-lg q超過(guò)1.3,則定義為差異表達(dá);b.分層聚類顯示不同樣品中l(wèi)ncRNA表達(dá)水平的可重復(fù)性;d. mRNA的層次聚類分析,使用lg(FPKM+1)進(jìn)行層次聚類分析,紅色表示高表達(dá)的基因,藍(lán)色表示低表達(dá)的基因。a,c. lncRNA was defined as differentially expressed if log2 of its expression level(infected/uninfected)was greater than or less than 2,and -lg q exceeded 1.3;b. Hierarchical clustering showing the reproducibility of lncRNA expression levels in different samples;. d. Hierarchical clustering analysis for mRNA,lg(FPKM+1)was used to perform hierarchical clustering analysis. Highly expressed genes were indicated in red,and blue indicated genes with lower expression.

2.2 qPCR分析差異表達(dá)的lncRNA

為了驗(yàn)證RNA-seq檢測(cè)到的轉(zhuǎn)錄組差異,選取10個(gè)在感染細(xì)胞中表達(dá)水平顯著上調(diào)的 lncRNA,用于qPCR分析。盡管表達(dá)方式不同,但與對(duì)照相比,在感染后36 h內(nèi),10個(gè)lncRNA在感染細(xì)胞中的表達(dá)水平均提高(圖4)。特別是,lncRNA 165和3304表現(xiàn)出更強(qiáng)的時(shí)間依賴性表達(dá),在36 h時(shí)達(dá)到最高值。而lncRNA 166、9129、6491、644、893和345表達(dá)水平較低,且在36 h時(shí)未出現(xiàn)表達(dá)水平明顯上升的現(xiàn)象。

圖4 lncRNA表達(dá)基因的qPCR驗(yàn)證Fig.4 Validation of gene expression by qPCR

2.3 細(xì)菌侵入對(duì)lncRNA表達(dá)的影響

為探索細(xì)菌侵入與吸附對(duì)lncRNA表達(dá)的影響是否存在差異,我們用紫外滅活和未滅活的Hps5感染細(xì)胞,比較細(xì)胞中的4種lncRNA的表達(dá)。未滅活的Hps5感染細(xì)胞后,lncRNA的表達(dá)水平顯著升高(圖5),特別是lncRNA 165和3304,其表達(dá)水平分別是對(duì)照組細(xì)胞的8.2和5.6倍(P<0.01)。

圖5 副豬嗜血桿菌的吸附與侵入對(duì)lncRNA表達(dá)的影響Fig.5 The effect of adherence and invasion of H.parasuis on the expression of lncRNAUV-Hps5:紫外線滅活的Hps5 Ultro-violet inactivated Hps5. *P<0.05, **P<0.01. The same as follows.

2.4 細(xì)菌毒力對(duì)lncRNA表達(dá)的影響

將3D4/21細(xì)胞用弱毒力(Hps4)、強(qiáng)毒力(Hps5)和無(wú)毒力(Hps7)標(biāo)準(zhǔn)血清型的副豬嗜血桿菌進(jìn)行感染,分別在12、24和36 h時(shí)收集細(xì)胞進(jìn)行qPCR分析。qPCR結(jié)果(圖6)顯示:Hps4、 Hps5和Hps7感染組中,lncRNA 165和3304在24和36 h時(shí)的表達(dá)水平都高于lncRNA 1125和3472。在24 h時(shí),被Hps5感染細(xì)胞中l(wèi)ncRNA 3304的表達(dá)水平高于其他lncRNA,但在12和36 h時(shí),其表達(dá)水平?jīng)]有顯著差異,而 lncRNA 165在副豬嗜血桿菌感染的細(xì)胞中穩(wěn)定上調(diào)。

圖6 不同毒力菌株對(duì)lncRNA表達(dá)水平的影響Fig.6 Effects of different virulent strains on the expression level of lncRNA

2.5 lncRNA 165的表達(dá)對(duì)細(xì)菌侵入的影響

細(xì)菌毒力與lncRNA表達(dá)關(guān)系的研究表明,lncRNA 165的表達(dá)可能與副豬嗜血桿菌的感染密切相關(guān)。為了驗(yàn)證這一假設(shè),我們用靶向lncRNA 165的siRNA片段和非特異性隨機(jī)片段(NC)轉(zhuǎn)染3D4/21細(xì)胞,然后用qPCR檢測(cè)lncRNA 165的表達(dá)情況。結(jié)果表明,RNA干擾可將lncRNA 165的表達(dá)降低約20%(圖7-a)。轉(zhuǎn)染后,細(xì)胞感染Hps5,然后計(jì)數(shù)侵入細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌數(shù)。siRNA片段處理細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌數(shù)顯著少于對(duì)照組(P<0.05),減少約60%(圖7-b)。

培養(yǎng)3D4/21細(xì)胞,轉(zhuǎn)染質(zhì)粒lncRNA 165-FLAG、pcAGGS-FLAG和pcDNA3.1,24 h后收集細(xì)胞,制備蛋白樣品進(jìn)行Western blot。結(jié)果顯示:lncRNA 165無(wú)法翻譯成蛋白質(zhì),這表明lncRNA 165是以lncRNA形式表達(dá)的(圖7-c)。同時(shí),與對(duì)照組細(xì)胞相比,轉(zhuǎn)染了lncRNA 165-FLAG的細(xì)胞,其lncRNA 165的表達(dá)水平提高了90.5倍(圖7-d)。同上,用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染3D4/21細(xì)胞,24 h時(shí)后用Hps5感染細(xì)胞,lncRNA 165-FLAG處理細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌數(shù)量顯著增加(P<0.05),為對(duì)照組的2.6倍(圖7-e)。

圖7 副豬嗜血桿菌侵入對(duì)lncRNA表達(dá)的影響Fig.7 Influence of invasion of H.parasuis on the expression of lncRNA a. siRNA干擾后lncRNA 165的表達(dá);b. 轉(zhuǎn)染siRNA后細(xì)菌對(duì)細(xì)胞的侵入;c. 表達(dá)lncRNA 165重組質(zhì)粒表達(dá)的鑒定;d. 轉(zhuǎn)染lncRNA 165重組質(zhì)粒后lncRNA 165的表達(dá);e. 過(guò)表達(dá)lncRNA 165后細(xì)菌對(duì)細(xì)胞的侵入。NC. 無(wú)關(guān)RNA干擾片段。a. The expression of lncRNA 165 interfered using siRNA fragments;b. The number of invasion of bacterium after interfering by siRNA fragments;c. The identification of recombinant plasmid expression lncRNA 165;d. The expression of lncRNA 165 in cells after transfection with recombinant plasmid expressing lncRNA 165;e. The number of invasion bacterium after overexpression of lncRNA 165. NC. Scamble RNA frogment.

2.6 lncRNA 165表達(dá)與TGF-β1表達(dá)的分析

用靶向lncRNA 165的siRNA片段和非特異性隨機(jī)片段(NC)轉(zhuǎn)染3D4/21細(xì)胞,收集樣品,qPCR檢測(cè)TGF-β1mRNA的表達(dá)。結(jié)果(圖8-a)顯示,降低lncRNA 165表達(dá)水平時(shí),TGF-β1mRNA表達(dá)水平降低6.3%。

用重組TGF-β1預(yù)處理3D4/21細(xì)胞24 h后,使用qPCR分析lncRNA 165的表達(dá)。結(jié)果(圖8-b)表明,用TGF-β1預(yù)處理細(xì)胞可以促進(jìn)lncRNA 165的表達(dá),表達(dá)水平升高4.1倍。

圖8 TGF-β1 mRNA表達(dá)與lncRNA之間的關(guān)系Fig.8 Association between lncRNA expression and TGF-β1 mRNA expression a. 下調(diào)lncRNA 165的表達(dá)對(duì)TGF-β1 mRNA表達(dá)的影響;b. TGF-β1處理對(duì)lncRNA 165表達(dá)的影響。a. The down-regulation of lncRNA 165 affects the expression of TGF-β1 mRNA;b. The expression of lncRNA 165 was affected by the incubation of TGF-β1.

2.7 RNA干擾對(duì)3D4/21細(xì)胞中Fn和α5表達(dá)的影響

用特異性靶向lncRNA 165的siRNA片段以及非特異性隨機(jī)片段(NC)轉(zhuǎn)染3D4/21細(xì)胞,60 h后收集細(xì)胞,與抗纖連蛋白(Fn)和整合素蛋白(α5)抗體一起孵育,然后進(jìn)行流式細(xì)胞分析。結(jié)果(圖9)顯示:與對(duì)照相比,siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞的α5(56.69% VS 76.94%)和Fn(2.51% VS 4.21%)表達(dá)量顯著降低(P<0.05)。

圖9 RNA干擾對(duì)3D4/21細(xì)胞中Fn和α5表達(dá)的影響Fig.9 Effect of RNA interference on the expression of Fn and α5 in 3D4/21 cells

3 討論

豬格拉瑟氏病造成世界范圍養(yǎng)豬行業(yè)的巨大損失,免疫接種對(duì)15種已知標(biāo)準(zhǔn)血清型副豬嗜血桿菌的保護(hù)效果很差,或是僅對(duì)血清型中的一部分菌株有保護(hù)作用[8]。目前對(duì)該菌致病機(jī)制的研究主要集中在毒力因子方面[30]。關(guān)于副豬嗜血桿菌與宿主間相互作用機(jī)制的研究很少。眾所周知,lncRNA能夠參與病原與宿主間的相互作用[31]。而巨噬細(xì)胞作為抵御病原體侵入機(jī)體的第一道防線也有著重要作用[20]。

試驗(yàn)中,我們用副豬嗜血桿菌標(biāo)準(zhǔn)血清5型感染豬肺泡巨噬細(xì)胞3D4/21細(xì)胞系,然后用RNA-Seq篩選差異表達(dá)的lncRNA,發(fā)現(xiàn)Hps5的感染明顯影響了lncRNA在3D4/21細(xì)胞中的表達(dá),這說(shuō)明lncRNA在副豬嗜血桿菌感染過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。

我們采用qPCR技術(shù)對(duì)RNA-seq篩選出的感染細(xì)胞中較為豐富的10個(gè)lncRNA表達(dá)情況進(jìn)行分析,證明了副豬嗜血桿菌的侵襲對(duì)lncRNA的表達(dá)具有更大的影響。同時(shí),我們還確定了lncRNA 165和3304的高效表達(dá)與細(xì)菌毒力之間缺少相關(guān)性。但是,我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)細(xì)菌感染細(xì)胞36 h時(shí),lncRNA 165的表達(dá)水平顯著上調(diào),這表明lncRNA 165有作為檢測(cè)副豬嗜血桿菌感染宿主的分子標(biāo)記的可能。siRNA干擾試驗(yàn)支持lncRNA 165參與調(diào)節(jié)副豬嗜血桿菌侵入的假設(shè)。

TGF-β的表達(dá)與多種疾病和繼發(fā)感染有關(guān)。甲型流感病毒感染細(xì)胞后會(huì)引起細(xì)胞TGF-β1的表達(dá)水平升高,同時(shí)Fn和α5的表達(dá)水平也隨之增加,從而導(dǎo)致嚴(yán)重的細(xì)菌繼發(fā)感染[32]。在被Group A Streptococcus(GAS)感染的上皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)其誘導(dǎo)TGF-β1的產(chǎn)生,而且TGF-β1上調(diào)Fn和整合素α5可增強(qiáng)GAS對(duì)上皮細(xì)胞的侵入[23]。我們之前曾報(bào)道過(guò)副豬嗜血桿菌感染增強(qiáng)了PK-15細(xì)胞中TGF-β1的表達(dá)[26]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),干擾lncRNA 165的表達(dá)會(huì)顯著調(diào)控TGF-β1的表達(dá)水平,同時(shí)Fn和整合素蛋白α5的表達(dá)水平也隨之變化,證明lncRNA 165的表達(dá)與TGF-β1的表達(dá)密切相關(guān)。同時(shí),發(fā)現(xiàn)lncRNA 165的表達(dá)水平與副豬嗜血桿菌對(duì)3D4/21細(xì)胞的侵入呈正相關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)副豬嗜血桿菌感染可調(diào)節(jié)多種lncRNA的表達(dá),尤其是lncRNA 165在細(xì)胞中通過(guò)TGF-β信號(hào)通路調(diào)控對(duì)副豬嗜血桿菌的吞噬。因此,我們得出結(jié)論,lncRNA是副豬嗜血桿菌和宿主相互作用過(guò)程中的重要組成部分。

對(duì)于本試驗(yàn)篩選出的lncRNA 165,除了需要了解其在副豬嗜血桿菌和宿主相互作用過(guò)程中的功能外,還需要進(jìn)行更廣泛的功能研究,包括其相關(guān)蛋白的研究,探索其作為檢測(cè)副豬嗜血桿菌感染宿主靶標(biāo)的可能性,為開(kāi)發(fā)新的診斷和治療方法提供新思路。