周穎,李燕,陶瑜,王建軍,侯喜林,李英

(南京農業(yè)大學作物遺傳與種質創(chuàng)新國家重點實驗室/農業(yè)農村部華東地區(qū)園藝作物生物學與種質創(chuàng)制重點實驗室/園藝作物種質創(chuàng)新與利用教育部工程研究中心/園藝學院,江蘇 南京 210095)

抗壞血酸(AsA)又稱維生素C,是維持動植物生命所必需的抗氧化劑。AsA參與許多基本的生理過程,如氧化應激的防御機制[1]、維生素E的還原狀態(tài)維持、跨膜電子傳輸、細胞分裂和生長調節(jié)等[2]。作為一種重要的抗氧化劑,AsA能有效清除有毒自由基和活性氧(ROS),使植物提高對鹽、臭氧和冷應激處理的耐受性[3-4]。

目前AsA主要合成途徑是肌醇途徑、古洛糖途徑、D-甘露糖/L-半乳糖途徑、半乳糖醛酸途徑[5-8]。除合成途徑外,AsA的代謝途徑對植物體內AsA含量也有一定的影響,該途徑被稱為AsA-GSH循環(huán)途徑[9]。AsA可以從單脫氫抗壞血酸鹽和脫氫抗壞血酸鹽中再生,其中已知的作用酶有:單脫氫抗壞血酸還原酶(MDHAR)、脫氫抗壞血酸還原酶(DHAR)、抗壞血酸氧化酶(AAO)、抗壞血酸過氧化物酶(APX)和谷胱甘肽還原酶(GR)[10-13]。

通過篩選AsA合成代謝相關基因的上游調控因子或與表達區(qū)域結合的蛋白,尋找調控AsA合成途徑的基因表達量的影響因素,從而達到通過育種途徑或栽培措施改變植物中抗壞血酸含量的目的。MDHAR可使AsA由氧化態(tài)轉化為還原態(tài)。研究發(fā)現,由于不結球白菜生長早期AsA分解較少,MDHAR的活性在生長前期很低,長到4葉1心后該酶活性才開始上升,對不結球白菜生長后期維持AsA含量十分關鍵[14]。MDHAR作為抗氧化物酶參與植物生長調控,目前對于該酶的研究大多主要集中在其對脅迫以及激素處理的響應上,如Zhang等[15]發(fā)現在低濃度的ABA處理下,白苜蓿中MDHAR表達量上調;噴施植物激素或生長調節(jié)劑對小麥幼苗中抗氧化酶活性及相關基因表達量起到增強作用[16];Eltayeb等[17]發(fā)現MDHAR過表達轉基因煙草增強了對鹽、臭氧的耐受性;Ren等[18]發(fā)現MDHAR1負調控煙草中的AsA含量;Stevens等[19]發(fā)現番茄果實AsA含量與MDHAR活性有關,進而影響其抗寒能力;Gest等[20]發(fā)現MDHAR3通過光調控來對AsA含量產生影響,MDHAR活性改變后,D-甘露糖/L-半乳糖途徑的基因對光的響應產生變化。但是關于MDHAR表達水平的具體調控機制目前還未見深入研究。

人體內缺少合成AsA的關鍵基因,不能合成AsA,因此只能通過食物攝取,蔬菜是人體AsA的主要來源之一。不結球白菜(Brassicacampestrisssp.chinensis)是中國南方最重要的蔬菜之一。目前,在不結球白菜中已經初步驗證了MDHAR1的功能[18],在轉基因煙草中進行相關基因表達量分析,發(fā)現MDHAR1對煙草中AsA含量負調控。而Sano[21]發(fā)現MDHAR家族的各同源基因呈現出多樣的亞細胞定位和生化特征。因此,探索該家族同源基因的功能有一定的意義。本研究以不結球白菜‘蘇州青’為材料,對MDHAR2進行功能驗證,利用病毒誘導的基因沉默(VIGS)技術[22-23]對葉片中AsA代謝循環(huán)相關基因MDHAR2進行沉默,并對該基因沉默后AsA-GSH循環(huán)途徑相關基因表達量進行分析,同時對沉默后葉片中AsA的含量進行測定,以期探明不結球白菜中MDHAR2基因對AsA含量的影響及其調控機制,為未來更深入研究MDHAR2功能提供一定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為不結球白菜(Brassicacampestrisssp.chinensis)品種‘蘇州青’,由南京農業(yè)大學園藝學院不結球白菜課題組提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 不結球白菜BcMDHAR2基因克隆參照RNA Simple Total RNA Kit[天根生化科技(北京)有限公司]說明書提取不結球白菜‘蘇州青’葉片RNA,使用Prime ScriptTMⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa)反轉錄合成的cDNA作為克隆模板。參照大白菜數據庫中BraMDHAR2(Bra005775)序列,在不結球白菜數據庫(http://nhccbase.njau.edu.cn/website/)中進行BLAST序列比對,取完整的ORF兩端設計引物(表1)。PCR反應體系(20 μL):cDNA模板 1 μL,正、反向引物各1 μL,2×Prime Star Max DNA聚合酶10 μL,ddH2O 7 μL。反應程序:95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 2 min;72 ℃ 10 min;4 ℃保存。PCR產物用12 g·L-1瓊脂凝膠電泳檢測,目的片段用凝膠回收試劑盒(OMEGA)純化回收,連接至PEAZY-Blunt載體,轉化大腸桿菌感受態(tài)Trans-T1,挑取陽性克隆進行測序,獲得目的基因,命名為BcMDHAR2(登錄號:MW539062)。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

1.2.2 BcMDHAR2生物學分析采用Bioxm2.7軟件對所獲得的基因序列進行核酸序列比對以及氨基酸序列分析。不同物種MDHAR2 的氨基酸序列從NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)GenBank數據庫中搜索獲得,通過DNAMAN 6.0進行多重序列比對,進化樹構建用MEGA 6軟件完成?；蚨ㄎ环治鍪褂肞lant-mPLoc(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/)。

1.2.3 亞細胞定位分析利用gateway技術將BcMDHAR2基因序列插入pEarleyGate 103載體上[24]。在基因引物兩端加上attB接頭(表1),使用PCR獲得含接頭的目的片段并將目的片段導入TOPO載體。用限制性內切酶MluⅠ將TOPO-BcMDHAR2質粒進行單酶切,再通過LR反應將目的基因片段與載體相融合。測序后獲得重組質粒pEarleyGate103-BcMDHAR2-GFP。采用液氮凍融法將重組質粒轉入農桿菌GV3101。

將含有目的質粒的GV3101農桿菌接種于含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中,28 ℃、180 r·min-1過夜培養(yǎng),6 000 r·min-1離心5 min,去上清液;加入1 mL緩沖液[10 mmol·L-1MgCl2,10 mmol·L-12-(N-嗎啉)乙磺酸單水物(MES),150 μmol·L-1乙酰丁香酮]清洗1遍,離心,棄上清液;加入相同體積緩沖液,重懸,靜置 4 h,使D600為0.8左右。將菌液注射進1個半月齡的煙草葉片中,60 h后,使用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染料染色,熒光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)光情況,分析亞細胞定位結果。

1.2.4 非生物脅迫以及激素處理將不結球白菜‘蘇州青’種子催芽2～3 d后部分移至32孔穴盤中,置于不結球白菜系統生物學實驗室的氣候室中,光照/黑暗時間為16 h/8 h(晝/夜),溫度為22 ℃,待植株生長至4葉1心時選擇長勢整齊一致的進行處理。

1)外源激素處理。于08:00時,對不結球白菜葉片分別進行以下處理:100 μmol·L-1赤霉素(GA);100 μmol·L-1脫落酸(ABA);1 mmol·L-1茉莉酸甲酯(MeJA)(0.1%二甲基亞砜助溶,對照為0.1%二甲基亞砜溶液),于0、2、4、6、8、10、12、24、48 h取樣,取0.1 g樣品提取RNA,3次重復。

2)低溫處理。于08:00進行4 ℃低溫處理,于0、1、2、3、6、9、12、24、48 h取樣。

3)鹽脅迫和重金屬(Cu2+)處理。待不結球白菜種子萌發(fā)至子葉展開后,放入Hoagland營養(yǎng)液中,待植株生長至4葉1心時,在含100 mmol·L-1NaCl的營養(yǎng)液、75 μmol·L-1CuSO4·5H2O營養(yǎng)液中培養(yǎng)。取樣時間同低溫處理。

4)光周期處理。將長至4葉1心的‘蘇州青’轉移至22 ℃、濕度75%的光照培養(yǎng)箱中,緩苗之后,分別進行16 h/8 h(晝/夜)以及8 h/16 h(晝/夜)長短日照處理,分別在長日照光照0、4、8、12、16 h,黑暗4、8 h,以及短日照光照0、4、8 h,黑暗4、8、12、16 h時取樣。

1.2.5 基因表達量分析參照RNA Simple Total RNA Kit(TianGen)說明書提取‘蘇州青’葉片RNA。按照Hifair Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR(gDNA digester plus)試劑盒(上海翊圣生物科技有限公司)說明書反轉錄成cDNA,按照Hieff qPCR SYBR Green Master Mix(上海翊圣生物科技有限公司)說明書體系進行加樣。使用熒光定量PCR儀,進行PCR擴增,程序為:95 ℃ 5 min,95 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s,40個循環(huán)。采用ΔΔCT法計算基因相對表達量。采用SPSS 22以及Excel 2016軟件分析數據。

1.2.6 病毒誘導基因沉默載體構建及植株接種采用楊學東等[25]方法,選取40 bp序列:5′-ATGAACGTGAAGGCAAATGGCAAAGCTGTGGTTGTTGGTG-3′,另一條鏈反向互補,共80 bp,由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。用SnaBⅠ酶切pTY載體,使用連接酶將合成序列同酶切載體37 ℃過夜連接,轉化大腸桿菌,方法同1.2.1節(jié)。使用無內毒素質粒大提試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]提取pTY-BcMDHAR2質粒。使用金粉包裹質粒,基因槍轟擊3片真葉的‘蘇州青’,使質粒轉入植物體內,并以基因槍轟擊pTY空載的植株和正常生長的‘蘇州青’為對照,15 d后觀察發(fā)病癥狀。取發(fā)病植株葉片提取RNA,熒光定量PCR分析基因表達量,方法同1.2.5節(jié)。

1.2.7 不結球白菜AsA和總AsA(T-AsA)含量測定采用Fontannaz等[26]的方法測定葉片中AsA含量,加入1.5 mL 0.1%草酸,4 ℃、12 000 r·min-1離心20 min,取過濾后的上清液使用超高效液相色譜儀(UltiMate 3000)測定AsA和 T-AsA含量。氧化型抗壞血酸(DHA)含量為T-AsA與AsA含量之差。采用Excel 2016軟件分析處理數據。

1.2.8 不結球白菜超氧化物歧化酶(SOD)活性測定使用總SOD測試盒(南京建成生物科技公司)測定沉默植株中SOD活性,具體參考Li等[27]的方法。

2 結果與分析

2.1 不結球白菜BcMDHAR2基因的克隆

提取不結球白菜‘蘇州青’葉片RNA,反轉錄后進行BcMDHAR2基因PCR擴增,得到1 300 bp左右的目的片段,如圖1所示。經測序,不結球白菜BcMDHAR2基因ORF全長1 308 bp,編碼435個氨基酸。

圖1 BcMDHAR2基因PCR擴增產物Fig.1 PCR amplified product ofBcMDHAR2 gene

2.2 BcMDHAR2同源比對與系統進化分析

序列分析表明:BcMDHAR2與蕪菁的MDHAR2同源性達100%(圖略)。將BcMDHAR2的氨基酸序列與其他8個物種進行同源性分析,結果(圖2)發(fā)現,BcMDHAR2的氨基酸序列與蕪菁和野甘藍相似性達100%,與蘿卜相似性為99%,與擬南芥、亞麻芥、芥菜等相似性達85%以上,與醉蝶花、黃瓜、番茄相似性均在74%以上,表明在進化過程中該基因保守性高,與蕪菁親緣關系最近。

圖2 不結球白菜與其他物種MDHAR2同源氨基酸比對(A)及進化樹分析(B)Fig.2 The alignment of MDHAR2 homologous amino acid(A)and phylogenetic tree analysis(B) in non-heading Chinese cabbage and other plants

2.3 BcMDHAR2蛋白亞細胞定位

使用Plant-mPLoc進行在線預測,結果表明BcMDHAR2定位于細胞質和細胞膜上。將BcMDHAR2在煙草中瞬時表達,結果(圖3)發(fā)現,BcMDHAR2-GFP融合蛋白在細胞核、細胞膜、細胞質上發(fā)光,表現為明顯的綠色熒光,核上的綠色熒光與核染料DAPI藍光重合,這表明BcMDHAR2不僅定位在細胞膜、細胞質上,還在細胞核上表達。

圖3 BcMDHAR2在本氏煙草葉片中亞細胞定位Fig.3 Subcellular localization of BcMDHAR2 in Nicotiana benthamiana

2.4 不同脅迫以及激素處理對‘蘇州青’中BcMDHAR2基因表達量的影響

由圖4-a可見:經過4 ℃低溫處理的‘蘇州青’,BcMDHAR2基因表達量呈先上升后下降的趨勢,在 9 h 時表達量達到最大值,其相對表達量為對照的2倍。由圖4-b、c可見:鹽脅迫和重金屬離子Cu2+處理下,該基因表達量均在處理9 h時達到峰值,隨后基因表達量下降。由圖4-d可見:1 mmol·L-1MeJA處理后BcMDHAR2基因表達量呈先上升后下降波動變化;100 μmol·L-1GA處理后,BcMDHAR2的表達量在4～48 h總體呈先上升再下降的趨勢,10 h時達到最大值;100 μmol·L-1ABA處理后,0～2 h基因表達量升高,之后2～8 h呈下降趨勢,處理24 h時基因表達量達到最低。由圖4-e可見:短日照條件下,BcMDHAR2的表達量變化顯著,在光照下先上升,轉為黑暗后基因表達量急劇下降,黑暗時間延長,變化趨于平穩(wěn);而長日照條件下,0～4 h表達量顯著下降,在光照4～12 h基因表達量呈現上升趨勢,12 h時達到最大值,黑暗后持續(xù)下降。與短日照相比,長日照下BcMDHAR2基因表達量變化趨勢平緩,說明該基因對光照較敏感。

圖4 不同脅迫及激素處理下BcMDHAR2基因表達量Fig.4 Expression level of BcMDHAR2 gene under different stress and hormone treatments a. 4 ℃低溫處理;b.鹽處理;c. 重金屬離子(Cu2+)處理;d. 激素處理(1 mmol·L-1 MeJA,100 μmol·L-1 GA,100 μmol·L-1 ABA);e. 光照處理(短日照和長日照)。a. Low temperature treatment at 4 ℃;b. Salt treatment;c. Heavy metal ion(Cu2+)treatment;d. Hormone treatments(1 mmol·L-1 MeJA,100 μmol·L-1 GA,100 μmol·L-1 ABA);e. Light treatment(short day and long day).

2.5 BcMDHAR2基因沉默對不結球白菜相關基因的影響

由圖5可見:對‘蘇州青’的BcMDHAR2基因進行沉默后,葉片呈發(fā)病狀態(tài),出現嚴重花葉病斑,葉片顏色變淺。由圖6可見:與pTY空載相比,BcMDHAR2基因的表達量明顯下調,證明BcMDHAR2被沉默。對沉默后的植株AsA-GSH循環(huán)途徑相關基因表達量進行分析,發(fā)現基因沉默后,植株中AAO1、AAO2較空載植株表達量下調,其中AAO2表達量約為空載的1/2。DHAR1表達量在基因沉默株系中與空載植株相比上調,而DHAR2呈相反變化,但與野生型相比,表達量均下降。GR1、GR2基因在沉默植株中的表達量較空載植株呈現上調變化,但與野生型相比,表達量下降;APX表達量也呈現類似的趨勢。

圖5 BcMDHAR2基因沉默后的葉片表型Fig.5 Leaf phenotype after BcMDHAR2 gene silencingWT:野生型;PTY:pTY空載;VIGS-1、VIGS-4:BcMDHAR2基因沉默后的植株。下同。WT:Wild type;PTY:pTY empty carrier;VIGS-1,VIGS-4:The plant after BcMDHAR2 gene silencing. The same as follows.

圖6 AsA-GSH循環(huán)相關基因在基因沉默植株中的表達量Fig.6 Expression level of AsA-GSH cycle related genes in gene silenced plants不同字母表示在不同株系中基因表達量差異顯著(P<0.05)。下同。The different letters mean significant difference of gene expression level among different lines(P<0.05). The same below.

2.6 沉默BcMDHAR2對不結球白菜AsA、氧化型抗壞血酸(DHA)含量和SOD活性的影響

由圖7可見:與空載對照相比,沉默BcMDHAR2后的植株中AsA含量下降了70%;DHA含量也呈下降趨勢,證明沉默BcMDHAR2后降低了不結球白菜中AsA含量。沉默BcMDHAR2的植株中SOD活性顯著升高,說明MDHAR2表達量降低后,不結球白菜體內SOD活性被激活,表達上升。

3 討論

不結球白菜中AsA含量豐富,但也存在著較大的品種差異[28]。AsA作為一種抗氧化劑,在體內不停被轉換,這種轉換通過AsA-GSH循環(huán)途徑實現。AsA-GSH循環(huán)對清除植物中的活性氧等有害物質起著關鍵作用,調節(jié)該途徑相關酶的表達量對提高植物抗氧化以及抗逆性十分重要[18-20]。

本研究從不結球白菜中克隆得到BcMDHAR2基因,同源性分析發(fā)現該基因較為保守,尤其是與蕪菁、擬南芥等十字花科植物相似性很高。因此,在擬南芥等植物中該基因的研究具有較高的參考性。在植物細胞中,已報道的一些物種的MDHAR在葉綠體、細胞質、線粒體、過氧化物酶體、質膜等位置表達[21]。本研究亞細胞定位結果表明,BcMDHAR2在煙草中定位除細胞質、細胞膜外,還在細胞核上表達。推測 BcMDHAR2 在植物生長發(fā)育過程中起到一定作用。Ying等[29]和Ren等[30]在洋蔥細胞以及擬南芥定位中也發(fā)現這3個部位均有熒光現象,分析認為在細胞核、細胞質、細胞膜部位表達的基因可能參與植物生長發(fā)育、響應非生物脅迫。

AsA含量和環(huán)境因素有關,當植物受到傷害時,可以通過調節(jié)AsA含量來抵抗逆境下產生的活性氧。Liu等[31]研究表明,OsMDHAR4通過調節(jié)H2O2誘導的水稻氣孔關閉對熱應激耐受性具有負調節(jié)作用。過表達MDHAR煙草增強了對非生物脅迫耐受性[18]。本研究發(fā)現,在低溫、鹽、重金屬離子以及外源ABA、GA、MeJA處理下BcMDHAR2均有一定的響應。在低溫、鹽、Cu2+處理下,基因表達量均呈先上升再下降的趨勢,可能是植物響應非生物脅迫提高了BcMDHAR2表達量從而增強植物的耐受性。外源GA、MeJA處理下,該基因表達量呈現先上升后下降變化,而在外源ABA處理下,基因表達量總體呈現下降趨勢,表明激素信號途徑可能影響該基因表達量進而對活性氧清除產生一定影響。AsA-GSH循環(huán)中各抗氧化物酶共同維持AsA氧化還原比值[1]。本研究中,通過VIGS沉默BcMDHAR2基因,發(fā)現在沉默株系中AsA循環(huán)路徑其他相關基因表達量也發(fā)生了一定變化,AAO與BcMDHAR2表達量均下調;DHAR1、APX與之相反,表達量均上調,GR表達量無顯著性變化。同時,研究發(fā)現沉默株系中的AsA含量降低,即BcMDHAR2對不結球白菜的AsA積累具有正向調控作用。

MDHA在非酶作用下可生成氧化型抗壞血酸(DHA),而這個過程的場所是在胞質中[32],因此猜測位于細胞核、膜和細胞質的BcMDHAR2基因對胞質中DHA的還原起到一定作用。本研究發(fā)現BcMDHAR2基因沉默后,沉默株系中AsA含量降低,而SOD活性升高,說明AsA含量降低可以激活不結球白菜體內SOD活性,來清除活性氧以維持植物生長。

綜上所述,BcMDHAR2響應非生物脅迫以及激素處理;BcMDHAR2基因沉默后,不結球白菜中AsA含量降低,抗氧化物相關酶SOD活性上升,對植物中活性氧清除產生一定影響。推測BcMDHAR2的合成變化可能影響了植物體內AsA的氧化還原比值以及通路中各類酶表達量,當有外界刺激時,使MDHAR協同通路中其他抗氧化物相關酶通過AsA代謝以及其他方式共同將植物體內活性氧等物質清除。關于該基因對AsA含量具體調控機制以及對代謝途徑相關基因作用關系還有待進一步研究。