王菲菲，張雪松，白彥萍

（1.北京中醫(yī)醫(yī)院順義醫(yī)院，北京 101300；2.中日友好醫(yī)院，北京 100029）

銀屑病，中醫(yī)稱之為“白疕”，臨床主要特征為紅斑、鱗屑，且伴有不同程度的瘙癢[1]。目前，銀屑病被認(rèn)為是一種免疫細(xì)胞功能異常所引起的炎癥性皮膚病。免疫細(xì)胞尤其是CD4+T 淋巴細(xì)胞功能異常在銀屑病發(fā)病過(guò)程中起到重要作用[2]。TIGIT 是一種免疫毒性顯著低于CTLA-4、PD-1 等的共抑制分子[3]?？赏ㄟ^(guò)激活CD4+T 細(xì)胞上TIGIT 信號(hào)通路，抑制CD4+T細(xì)胞增殖及功能[4-5]。臨床上針對(duì)免疫靶點(diǎn)的探索已成為治療銀屑病的研究重點(diǎn)。清熱涼血方是白彥萍教授在多年臨床經(jīng)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，研制出針對(duì)血熱型銀屑病的方藥。課題組前期研究中發(fā)現(xiàn)清熱涼血方可改善銀屑病患者CD4+T 細(xì)胞功能[6]。因此，探究清熱涼血方是否可通過(guò)干預(yù)TIGIT 表達(dá)調(diào)節(jié)銀屑病患者外周血CD4+T 細(xì)胞增殖及其功能，將為銀屑病的治療提供新方法和新思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇中日友好醫(yī)院皮膚科門(mén)診及病房血熱型銀屑病患者28 例，男14 例，女14 例，平均年齡（45.77±16.79）歲；平均病程（13.63±11.21）年，PASI評(píng)分（10.43±6.35）分。健康對(duì)照組14 例，為北京中醫(yī)藥大學(xué)體檢健康的大學(xué)生及中日友好醫(yī)院體檢健康的醫(yī)護(hù)工作人員，男6 例，女8 例，年齡（43.54±15.62）歲。在血熱型銀屑病組中選取PASI評(píng)分＞10 分的8 例患者與健康對(duì)照組中的8 例進(jìn)行外周血細(xì)胞因子的比較，并對(duì)此8 例患者進(jìn)行治療干預(yù)以及前后對(duì)比。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 西醫(yī)診斷符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)皮膚性病分會(huì)銀屑病學(xué)組制定的《中國(guó)銀屑病治療專家共識(shí)（2014 版）》。中醫(yī)辨證診斷符合《尋常型銀屑病中醫(yī)外治特色療法專家共識(shí)（2017 年）》中“血熱證”的診斷標(biāo)準(zhǔn)，主癥：瘙癢，鱗屑，紅斑；次癥：心煩易怒，口干口渴，大便燥結(jié)，小便黃；舌脈：舌質(zhì)紅或絳，苔黃，脈滑或弦數(shù)。

1.2.2 病情嚴(yán)重程度判斷 依據(jù)國(guó)際通用的銀屑病面積和嚴(yán)重程度指數(shù)（psoriasis area and severity index,PASI）標(biāo)準(zhǔn)，包括皮損面積評(píng)分和皮損嚴(yán)重程度評(píng)分。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn) 1）18～65 周歲確診為血熱型銀屑病患者；2）初發(fā)未經(jīng)治療者；3）4 周內(nèi)未接受系統(tǒng)治療者；4）簽署知情同意書(shū)者。

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn) 1）嚴(yán)重感染、創(chuàng)傷等應(yīng)激狀態(tài)者；2）妊娠期及哺乳期患者；3）合并有自身免疫性疾病、循環(huán)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)和造血系統(tǒng)等嚴(yán)重原發(fā)性疾病、常規(guī)用藥無(wú)法控制病情的患者，合并腫瘤的患者，合并精神系統(tǒng)疾病且不能配合的患者。標(biāo)本采集均在征得患者知情的前提下進(jìn)行，并簽署知情同意書(shū)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后將實(shí)驗(yàn)結(jié)果告知患者。

1.5 治療方法

1.5.1 給藥劑量和頻率 清熱涼血方方藥組成：生地黃15 g，牡丹皮15 g，紫草15 g，赤芍15 g，蛇莓10 g，白英15 g，土茯苓15 g，白花蛇舌草15 g。水煎400 mL，每日1 劑，分2 次服用。上述各藥物由中日友好醫(yī)院制劑室調(diào)配，煎煮至400 mL并分裝，每日2次，每次200 mL 口服。每次復(fù)診時(shí)將藥袋回收。

1.5.2 治療和隨訪周期 治療周期為2 個(gè)月，每2 周復(fù)診1 次，在第2 個(gè)月對(duì)患者進(jìn)行指標(biāo)檢測(cè)。

1.6 臨床療效評(píng)價(jià) 療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)以銀屑病PASI評(píng)分為根據(jù)，由2 名未參與研究的副主任醫(yī)師及以上的盲態(tài)醫(yī)生對(duì)2 組治療前后分別予以PASI評(píng)分。

1.7 血漿細(xì)胞因子檢測(cè) 采用CBA 法檢測(cè)患者治療前后外周血中IFN-g、IL-17、IL-10 含量，比較治療前后外周血中IFN-g、IL-17、IL-10 含量變化。具體檢測(cè)步驟嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行（CBA Human Soluble Protein Flex Set，美國(guó)BD 公司）。

1.8 流式細(xì)胞儀檢測(cè)TIGIT 表達(dá) 使用Focill 密度梯度離心法獲取外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs）標(biāo)本，將1×106PBMCs 細(xì)胞懸液定容至100 uL。分別加入3 μL Alexa Fluor?488-CD3，3 μL APC-CD4，25 μL PE-TIGIT抗體，室溫避光孵育30 min；孵育結(jié)束后，在流式管中加入1 mL PBS，常溫離心，1 500 r/min，5 min；每管用300 μL PBS 重懸；將重懸的細(xì)胞過(guò)濾后，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)PBMCs 中TIGIT+CD4+T 細(xì)胞的表達(dá)頻率。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Excel 和SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。組內(nèi)治療前后比較采用Wilcoxon配對(duì)檢驗(yàn)；P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2 組外周血TIGIT 表達(dá)比較 TIGIT+CD4+T 細(xì)胞在銀屑病患者中表達(dá)頻率為（10.88±0.54）%，顯著低于健康對(duì)照組的（17.29±1.11）%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

2.2 2組外周血IFN-g、IL-10、IL-17A表達(dá)比較 見(jiàn)表1。

表1 2 組外周血IFN-g、IL-10、IL-17A 表達(dá)比較（，n =8） （pg/mL）

表1 2 組外周血IFN-g、IL-10、IL-17A 表達(dá)比較（，n =8） （pg/mL）

注：與健康對(duì)照組比較，# P ＜0.05，## P ＜0.01

2.3 血熱型銀屑病組治療前后PASI評(píng)分情況 患者經(jīng)治療后PASI評(píng)分為（10.62±0.40）分，較治療前的（16.99±0.76）分顯著下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。

2.4 血熱型銀屑病組治療前后外周血TIGIT 表達(dá)情況 患者經(jīng)治療后TIGIT+CD4+T 細(xì)胞表達(dá)頻數(shù)為（17.35±0.76）%，較治療前的（12.41±0.83）%顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

2.5 血熱型銀屑病組治療前后血漿IFN-g、IL-10、IL-17A 表達(dá)比較 見(jiàn)表2

表2 血熱型銀屑病組治療前后血漿IFN-g、IL-10、IL-17A表達(dá)比較（，n =8） （pg/mL）

表2 血熱型銀屑病組治療前后血漿IFN-g、IL-10、IL-17A表達(dá)比較（，n =8） （pg/mL）

注：與治療前比較，## P ＜0.01

3 討論

銀屑病發(fā)病率逐年升高，目前全球患病人數(shù)將近1.25 億，為全球性重大疑難病[7-8]。其發(fā)病機(jī)制比較公認(rèn)是在多基因遺傳背景下，受到環(huán)境因素的影響，有多種免疫細(xì)胞及炎癥性細(xì)胞因子參與其中[9-10]。大量證據(jù)顯示，免疫細(xì)胞尤其是T 淋巴細(xì)胞功能失調(diào)在本病發(fā)病過(guò)程中起到重要作用[11]。淋巴細(xì)胞和上皮細(xì)胞之間的交互作用促發(fā)并維持了銀屑病的“炎癥微環(huán)境”[12]?；罨牧馨图?xì)胞浸潤(rùn)至皮膚并釋放多種細(xì)胞因子和趨化因子，如Th1 和Th17 細(xì)胞釋放的IFN-g 和IL-17，可促進(jìn)免疫細(xì)胞的募集、刺激角質(zhì)形成細(xì)胞增殖及產(chǎn)生炎癥因子，促使了銀屑病特征性皮損的發(fā)生發(fā)展[13-14]。在淋巴細(xì)胞活化過(guò)程中除需要MHC-肽-TCR復(fù)合體給予第一信號(hào)外，第二信號(hào)即共刺激信號(hào)在后續(xù)活化及功能維持方面起重要作用[15]。共刺激分子在多種疾病如免疫性疾病、腫瘤等的發(fā)病過(guò)程中，通過(guò)影響淋巴細(xì)胞功能參與疾病的發(fā)生發(fā)展。共刺激分子根據(jù)其主要功能可分為正性共刺激分子和負(fù)性共刺激分子兩類，分別對(duì)T 細(xì)胞產(chǎn)生刺激性及抑制性作用，其中抑制性分子的受體又稱免疫檢查點(diǎn)，可以通過(guò)與其配體特異性結(jié)合抑制T 細(xì)胞過(guò)度活化及增殖，在維持免疫穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。

TIGIT 是T 細(xì)胞活化和增殖過(guò)程中具有重要作用的共抑制信號(hào)[16]。在某些自身免疫性疾病中激活T 細(xì)胞TIGIT 信號(hào)通路，能夠顯著影響T 細(xì)胞的功能和增殖分化[17-18]。TIGIT 可以通過(guò)3 種不同方式直接或間接調(diào)節(jié)Th1/Th17 對(duì)自身抗原及前炎性因子反應(yīng)發(fā)揮免疫抑制作用：1）TIGIT 可以通過(guò)直接抑制T 細(xì)胞的活化發(fā)揮作用；2）Treg 細(xì)胞表面的TIGIT 通過(guò)與APCs上的CD155 結(jié)合，誘導(dǎo)耐受性APCs 釋放IL-10，從而發(fā)揮抑制作用；3）TIGIT 通過(guò)促進(jìn)Treg 細(xì)胞釋放IL-10，F(xiàn)gl2，選擇性地抑制Th1/Th17 功能[19]。研究[20]進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，TIGIT+Treg 細(xì)胞與TIGIT-Treg 細(xì)胞相比，TIGIT+Treg細(xì)胞顯示了其對(duì)Th1/Th17特有的抑制作用。研究[21]表明銀屑病患者存在Treg/Th17 比例失衡，引起IL-17、IFN-g 等細(xì)胞因子釋放增加，導(dǎo)致疾病的發(fā)生發(fā)展。因此，我們推測(cè)通過(guò)使銀屑病患者CD4+T 細(xì)胞TIGIT 表達(dá)增高，可能在銀屑病的治療中具有一定的潛在價(jià)值。

銀屑病發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，且病程易反復(fù)[22-23]，屬于中醫(yī)藥治療的優(yōu)勢(shì)病種。中醫(yī)倡導(dǎo)整體觀念、重視臟腑氣血辨證，“外治必本諸于內(nèi)”是中醫(yī)治療皮膚病的基本原則。“血分辨證”是目前在臨床上應(yīng)用較為廣泛也普遍被眾多醫(yī)家接受的銀屑病辨證論治方法[24]。血分辨證主要分為血熱證、血瘀證、血燥證、血虛證等。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，“血熱證”在所有證型中發(fā)病率最高。清熱涼血方是白彥萍教授根據(jù)臨床工作中所診治的血熱型銀屑病發(fā)病特點(diǎn)和中藥藥理學(xué)研究進(jìn)展的自擬方。本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)，清熱涼血方可以通過(guò)影響多個(gè)信號(hào)通路發(fā)揮治療作用，但處于銀屑病發(fā)病機(jī)制“上游”的TIGIT 信號(hào)通路在銀屑病中的研究較少。因此，課題組從免疫學(xué)角度出發(fā)，探索TIGIT 在銀屑病發(fā)病過(guò)程中的作用，結(jié)果顯示TIGIT在血熱型銀屑病患者外周血CD4+T 細(xì)胞中呈低表達(dá)狀態(tài)，并且清熱涼血方在上調(diào)血熱型銀屑病患者CD4+T細(xì)胞表面TIGIT 表達(dá)的同時(shí)抑制IFN-g 和IL-17A 的分泌，從而發(fā)揮治療作用。