楊若琪，趙貴萍，王川東，王 靜*

（1. 山東中醫(yī)藥大學 藥學院，山東 濟南 250355；2. 云南中醫(yī)藥大學 中藥學院，云南 昆明 650500；3. 山東大學 微生物技術研究院，山東 青島 266237）

局部應用化學預防藥物（如洗必泰）是目前預防齲齒的主要策略之一[1]。很多市售的口腔護理產品都含有洗必泰，但是抗菌藥物的過度使用可能會破壞微生物群落間的生態(tài)平衡[2-3]。近年來，個別天然藥物能顯著增強洗必泰的抗齲活性，降低洗必泰發(fā)揮作用的有效濃度，天然藥物與常規(guī)抗菌藥物的聯(lián)用在齲病防治領域具有潛在的應用前景[4]。

苦參Sophora flavescensAlt.是豆科、槐屬草本或亞灌木植物?？鄥⒖倝A是苦參中所有生物堿的統(tǒng)稱，其主要成分有苦參堿、氧化苦參堿、槐果堿、槐定堿、槐胺堿、氧化槐果堿等多種生物堿。在本研究中，以苦參總堿中的4種主要生物堿為研究對象，評估對變形鏈球菌浮游細胞和生物被膜細胞的體外抗菌活性影響。同時分析這4種生物堿與洗必泰對變形鏈球菌的協(xié)同抑制作用。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

DNM-9602型酶標儀（北京普朗新技術有限公司）；苦參堿（批號：S31035）、氧化苦參堿（批號：S31408）、槐果堿（批號：S31400）、槐定堿（批號：S25721）均購于上海源葉生物科技有限公司；變形鏈球菌（S. mutans）UA159由山東中醫(yī)藥大學微生物教研室提供；BHI培養(yǎng)基（批號：B8130）購于北京索萊寶生物科技有限公司；MTT （批號：KGT5251）購于江蘇凱基生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1藥液以及菌液的制備 試驗組藥物苦參堿、氧化苦參堿、槐果堿、槐定堿均用100%乙醇作為溶劑配制成200 mg/mL的母液，用BHI培養(yǎng)基進行梯度二倍稀釋。陽性對照組藥物洗必泰用BHI培養(yǎng)基稀釋為2或4 μg/mL，陰性對照組未用藥物處理。用接種環(huán)將變形鏈球菌UA159接種于BHI液體培養(yǎng)基中，37℃過夜厭氧培養(yǎng)。

1.2.2浮游細胞的代謝活性 MTT法：使用MTT法測定浮游狀態(tài)下細菌的代謝活性[5]。將培育至指數生長期的變形鏈球菌與不同濃度的試驗藥物于37℃下厭氧孵育24 h。隨后通過離心去除上清液，并用BHI培養(yǎng)基將細菌沉淀重懸。加入5 mg/mL的MTT溶液于37℃下在黑暗中孵育4 h。孵育結束后，加入100%的DMSO以溶解產生的甲臜。用酶標儀測定490 nm處的吸光度來評估浮游細胞的代謝活性。每個濃度進行三次生物學重復。

1.2.3生物被膜的形成 結晶紫染色法：在96孔板種進行生物被膜形成實驗，通過結晶紫染色進行定量[6]。首先將過夜培養(yǎng)的變形鏈球菌懸液稀釋至1×107cfu/mL，然后接種到含有1%蔗糖的新鮮BHI培養(yǎng)基中。與不同濃度的試驗藥物于37℃下厭氧孵育24 h后棄去96孔板中的上清液，并用無菌PBS清洗2次。隨后將形成的生物被膜用0.4%的結晶紫染色10 min，最后向每個孔中加入33%的冰醋酸溶液。用酶標儀測定595 nm處的吸光度來定量生物被膜的形成。每個濃度進行三次生物學重復。

1.2.4聯(lián)合用藥研究 棋盤法：通過棋盤法分析不同試驗藥物與洗必泰的協(xié)同作用。在96孔板中，試驗藥物縱向加入，洗必泰橫向加入，如前所述分別測定它們對變形鏈球菌浮游細胞和生物被膜細胞的影響，并計算單獨用藥和聯(lián)合用藥的抑制率。利用R軟件包“synergyfinder”中的零相互作用效能模型（ZIP）進一步評估它們的協(xié)同作用[7]。

1.2.5統(tǒng)計學方法 用SPSS 19軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（±s）表示。多組間比較采用方差分析，所有試驗重復3次。以P< 0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 4種生物堿對變形鏈球菌浮游細胞代謝活性的影響

4種生物堿的濃度增大，浮游細胞代謝活性都降低，與陰性對照組相比，當苦參堿和氧化苦參堿濃度達到5 mg/mL、槐果堿濃度達到2.5 mg/mL、槐定堿濃度達到1.25 mg/mL時，浮游細胞代謝活性明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P< 0.05）。10 mg/mL的苦參堿、槐果堿和槐定堿降低細胞代謝活性達到約75%，而同濃度的氧化苦參堿降低約20%。另外，與陰性對照組相比，2 μg/mL的洗必泰降低細胞代謝活性約75%，差異有統(tǒng)計學意義（P< 0.01），具體見圖1。

圖1 4種生物堿對變形鏈球菌浮游細胞代謝活性的影響Fig.1 Effects of four alkaloids on metabolic activity of S. mutans planktonic cells

2.2 4種生物堿對變形鏈球菌生物被膜形成的影響

4種生物堿的濃度增大，生物被膜的形成也有所減少，與陰性對照組相比，當苦參堿、槐果堿和槐定堿濃度達到2.5 mg/mL、氧化苦參堿濃度達到5 mg/mL時，生物被膜形成率明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P< 0.05）。20 mg/mL的苦參堿、槐果堿和槐定堿抑制約85%的生物被膜形成，而同濃度的氧化苦參堿抑制約20%。另外，與陰性對照組相比，4 μg/mL的洗必泰抑制約80%的生物被膜形成，差異有統(tǒng)計學意義（P< 0.01），具體見圖2。

圖2 4種生物堿對變形鏈球菌生物被膜形成的影響Fig.2 Effects of four alkaloids on biofilm formation of S. mutans

2.3 4種生物堿與洗必泰對變形鏈球菌浮游細胞代謝活性的協(xié)同抑制作用

與單獨使用試驗藥物相比，與洗必泰聯(lián)合使用可以在不同程度上降低洗必泰的濃度。具體來說，在濃度為0.5 μg/mL時，洗必泰只能抑制浮游細菌約25%的代謝活性，但是與5 mg/mL的苦參堿聯(lián)合使用時，可以達到約70%的抑制作用。1 μg/mL的洗必泰與槐果堿、槐定堿以及氧化苦參堿聯(lián)合使用時，對浮游細菌代謝活性的抑制作用從40%增加到70%，見圖3。通過零相互作用效能模型（ZIP）進一步分析獲得的數據，我們發(fā)現(xiàn)這4種生物堿與洗必泰對變形鏈球菌浮游細胞代謝活性的協(xié)同抑制作用強弱依次為：苦參堿（平均協(xié)同得分2.5）>槐定堿（平均協(xié)同得分2.2） >槐果堿（平均協(xié)同得分1.5） >氧化苦參堿 （平均協(xié)同得分-2.8），見圖4。

圖3 4種生物堿與洗必泰對變形鏈球菌浮游細胞代謝活性的協(xié)同抑制作用Fig.3 Synergistic inhibitory effects of four alkaloids with chlorhexidine on metabolic activity of S. mutans planktonic cells

圖4 4種生物堿與洗必泰對變形鏈球菌浮游細胞代謝活性的零相互作用效能模型Fig.4 Zero Interaction Potency model of four alkaloids with chlorhexidine on metabolic activity of S. mutans planktonic cells

2.4 4種生物堿與洗必泰對變形鏈球菌的生物被膜形成的協(xié)同抑制作用

和對浮游細菌代謝活性的協(xié)同抑制作用相似，這4種生物堿與洗必泰對變形鏈球菌生物被膜的形成也具有不同程度的協(xié)同抑制作用。具體來說，在濃度為1 μg/mL時，洗必泰只能抑制約10%的生物被膜形成，但是與10 mg/mL的苦參堿或20 mg/mL的氧化苦參堿聯(lián)合使用時，可以達到約80%的抑制作用。2 μg/mL的洗必泰與5 mg/mL的槐果堿或10 mg/mL的槐定堿聯(lián)合使用時，對生物被膜形成的抑制作用從20%增加到70% ～ 80%，見圖5。通過零相互作用效能模型我們發(fā)現(xiàn)它們對變形鏈球菌生物被膜形成的協(xié)同抑制作用強弱依次為：苦參堿（平均協(xié)同得分18）>氧化苦參堿（平均協(xié)同得分12.8）>槐果堿 （平均協(xié)同得分0.8） >槐定堿（平均協(xié)同得分0.5），見圖6。

圖5 4種生物堿與洗必泰對變形鏈球菌生物被膜形成的協(xié)同抑制作用Fig.5 Synergistic inhibitory effects of four alkaloids with chlorhexidine on biofilm formation of S. mutans

圖6 4種生物堿與洗必泰對變形鏈球菌生物被膜形成的零相互作用效能模型Fig.6 Zero Interaction Potency model of four alkaloids with chlorhexidine on biofilm formation of S. mutans

3 討論

研究顯示，細菌不僅能夠以浮游狀態(tài)存在，而且還存在于生物被膜中。生物被膜由胞外多糖，eDNA和多種蛋白質構成，對抗菌藥物起到了擴散屏障的作用，被認為是細菌的一種強大防御機制[8-9]?？鄥⒅械?種主要生物堿對變形鏈球菌浮游細胞的代謝活性以及生物被膜的形成都具有一定的抑制作用，其中氧化苦參堿的抑制作用弱于其它3種生物堿。由于浮游狀態(tài)的細菌比生物被膜中的細菌更容易受到抗菌藥物的影響，因此抑制變形鏈球菌生物被膜的生長比浮游細菌更加困難[10]。在這4種生物堿中，除了槐果堿以外，其它3種生物堿對生物被膜的抑制濃度都高于浮游細菌。

將天然藥物與傳統(tǒng)抗菌藥物聯(lián)合使用是防齲藥物開發(fā)的另一條途徑。在本研究中，苦參中的4種主要生物堿能夠與洗必泰對變形鏈球菌浮游細胞的代謝活性表現(xiàn)出不同程度的協(xié)同抑制作用。亞抑制濃度的苦參堿能夠使洗必泰對變形鏈球菌浮游細胞代謝活性的有效抑制濃度降低兩個梯度（從2 μg/mL降低到0.5 μg/mL），而亞抑制濃度的氧化苦參堿、槐果堿和槐定堿使洗必泰的有效抑制濃度降低一個梯度（降低到1 μg/mL）。對變形鏈球菌生物被膜形成的協(xié)同抑制作用也有類似的趨勢，亞抑制濃度的苦參堿和氧化苦參堿使洗必泰的有效抑制濃度降低兩個梯度（從4 μg/mL降低到1 μg/mL），亞抑制的槐果堿和槐定堿協(xié)同作用稍弱，能夠使洗必泰的有效濃度降到1個梯度（降低到2 μg/mL）。苦參中4種生物堿與洗必泰的聯(lián)合用藥能夠在保持較高抑制活性的同時還降低洗必泰的使用濃度，從而在一定程度上減小了不良反應發(fā)生的風險。

用于協(xié)同研究的零相互作用效能模型進一步比較了這4種生物堿與洗必泰的協(xié)同抑制作用強弱，綜合來看，苦參堿是4種生物堿中與洗必泰協(xié)同作用最強的藥物，對浮游細胞的代謝活性以及生物被膜的形成都表現(xiàn)出了最強的協(xié)同活性。值得注意的是，氧化苦參堿在單獨用藥時與其它三種生物堿相比抑制作用較弱，與洗必泰對浮游細胞代謝活性的協(xié)同作用也比較差，但是對生物被膜的形成卻有很強的協(xié)同活性。

4 結論

苦參中的4種生物堿可以在降低洗必泰使用濃度的情況下，與洗必泰對變形鏈球菌浮游細胞代謝活性以及生物被膜的形成表現(xiàn)出不同程度的協(xié)同作用。本研究為苦參中的生物堿與洗必泰聯(lián)合使用以預防齲齒的新方法提供了一種思路。