李龍妹，甘紫胭，楊小兵，河文峰，廖桂雅，李秋萍，吳萬垠

（廣州中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510370）

扶正抗癌方是廣東省名中醫(yī)吳萬垠教授總結的經驗方，該方遵循中醫(yī)整體觀和辨證論治理念，目前已作為顆粒制劑廣泛用于臨床治療。前期臨床研究中，扶正抗癌方聯合吉非替尼可延長非小細胞肺癌患者中位疾病無進展生存時間以及中位生存時間[1]；基礎研究中，扶正抗癌方可通過AMPKα-IGFBP1-FOXO3α和SAPK/JNK-Sp1通路抑制細胞增殖[2-3]，協同吉非替尼通過Akt-p65-MUC1通路抑制細胞增殖[4]，逆轉EMT抑制NSCLC細胞轉移[5-7]，激活Caspase-3、Bax誘導NSCLC細胞凋亡[8]，通過cMet通路逆轉NSCLC細胞對吉非替尼的耐藥[9]。但扶正抗癌方是否可通過阻滯細胞周期抑制增殖未見文獻報道。因此，本研究以H460人大細胞肺癌細胞為研究對象，檢測扶正抗癌方對細胞增殖和周期的影響，并進一步探討了扶正抗癌方對miR221-3p、細胞周期依賴性激酶抑制物p27Kip1、細胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、細胞周期蛋白E（Cyclin E）、細胞周期依賴性激酶2（CDK2）和細胞周期依賴性激酶4（CDK4）的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞 H460人大細胞肺癌細胞（中國科學院細胞庫）。細胞培養(yǎng)：37 ℃、5% CO2，RPMI-1640培養(yǎng)基+10% 胎牛血清+100 U/mL的青霉素與100 mg/mL的鏈霉素。細胞傳代：棄舊培養(yǎng)基，PBS沖洗，胰酶消化后，吹打至單細胞懸液，按1∶3傳代至新培養(yǎng)皿或按照實驗要求進行細胞處理。

1.1.2藥物和試劑 扶正抗癌方顆粒（批號：J1708002），廣東一方制藥有限公司制備，具體方藥及藥物配制詳見文獻[8]。GAPDH（D16H11）XP? Rabbit mAb（ 批 號：5174）、CDK2 （E8J9T）XP? Rabbit mAb （批 號：18048）、CDK4 （D9G3E）Rabbit mAb（ 批 號：12790）、Cyclin D1 （E3P5S）XP? Rabbit mAb（批號：55506）、Cyclin E （D7T3U）Rabbit mAb（批號：20808）、p27Kip1（D69C12） XP?Rabbit mAb（批號：3686）均購于美國CST公司；RPMI-1640培養(yǎng)基（批號：8119305）、胎牛血清（批號：10270-106）、胰酶（批號：25200-072）均購于美國Gibco公司；2×mRNA Universal SYBR? qPCR Master Mix（批 號：MQ101-01）、miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit （by stem-loop）（批號：MR101-02）均購于南京諾唯贊生物科技有限公司；riboFECT CP Transfection Kit（333T）（批號：c10511-1）購于廣州銳博生物科技公司；miR221的引物及內參U6引物、miR221 inhibitor 及對應的陰性對照由上海吉瑪公司設計并合成。

1.1.3主要儀器 ChemiDoc XRS+型化學發(fā)光成像系統、1658033型垂直電泳系統及1703940型半干轉膜系統（美國Bio-Rad公司）；Cytomics FC500型流式細胞儀（美國貝克曼公司）；CountStar型全自動細胞計數儀（美國Inno-Aliance Biotech公司）；Eon.C型多功能酶標儀（美國BioTEK公司）；5430R型冷凍離心機（德國Eppendorf公司）；ABI7500型熒光定量PCR儀（美國Applied Biosystems公司）。

1.2 方法

1.2.1CCK8檢測細胞存活率 取對數生長的H460細胞，培育24 h，分別加入0.1 mL濃度為0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/mL的扶正抗癌方藥液，分別培養(yǎng)24、48 h，加入100 μL CCK8試劑，1 h后酶標儀（450 nm波長）檢測光密度值。細胞存活率 =給藥組光密度值/對照組光密度值×100%。

1.2.2流式細胞術檢測細胞周期的變化 取對數生長的H460細胞，培育24 h，分別加入2 mL濃度為0、1.5、2.0、2.5 mg/mL的扶正抗癌方藥液，24 h后，胰酶消化，以培養(yǎng)基重懸細胞，1 000 r/min離心5 min，輕彈管壁，使沉淀重懸于殘液中，加入1 mL室溫下的PBS緩沖液。將細胞緩慢加入至提前-20 ℃預冷的3 mL無水乙醇中，邊加入邊高速攪拌，過夜。第二天，將固定的細胞離心，棄乙醇，輕彈管壁使沉淀松散，加入室溫下PBS緩沖液，放置15 min使細胞水化，離心，棄上清。加入1 mL DNA staining solution，渦旋震蕩5 ～ 10 s。室溫避光孵育30 min，流式機上樣。

1.2.3Real-time PCR檢 測miR221-3p及p27Kip1mRNA的表達 收集樣品，Trizol法試劑提取細胞總RNA，將其逆轉錄成cDNA，反轉錄過程采用miRNA特異性引物構建反轉錄體系，條件按試劑盒說明書執(zhí)行。擴增時miRNA以U6位內參照基因，mRNA以GAPDH位內參照基因，結果利用2-△△Ct計算?；蛞镄蛄腥绫?所示。

表1 引物序列Tab. 1 The primer sequence

1.2.4Western blot檢 測 p27Kip1、Cyclin D1、Cyclin E、CDK2、CDK4蛋白的表達 取對數生長的H460細胞，細胞培養(yǎng)和給藥同“1.2.2”；ripa裂解細胞，提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度；蛋白樣品上樣、電泳、轉膜、封閉，加入一抗搖床孵育2 h，4 ℃過夜，加入二抗搖床孵育1 h；ECL化學發(fā)光法在凝膠成像系統中成像，Image Lab分析數據。

1.2.5瞬時轉染 利用化學脂質體轉染法，采用lipo3000和 riboFECT CP兩種轉染試劑，其中，轉染miR221-3p的mimic和inhibitor采用riboFECT CP轉染試劑，其它的采用lipo3000轉染試劑，按照說明書進行操作。

1.2.6熒光素酶報告基因檢測miR221-3p是否與p27Kip13’UTR的預測結合位點結合 將樣品按照Luc-Pair Duo-Luciferase HS Assay Kit試劑盒說明書進行操作，對細胞提取物中的熒光素酶活性進行分析。

1.2.7統計學方法 用SPSS 22.0軟件進行數據分析。計量資料用均數 ± 標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗。以P< 0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 扶正抗癌方對H460細胞增殖的影響

與空白對照組比較，扶正抗癌方組（1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/mL）中H460細胞的存活率下降，差異具有統計學意義（P< 0.01），且隨著給藥濃度的增加，細胞存活率呈下降趨勢；同時，隨著給藥時間的延長，細胞存活率也呈下降趨勢，見表2。結果表明，扶正抗癌方能夠抑制H460細胞的增殖，且呈濃度和時間依賴性。

表2 扶正抗癌方對H460細胞存活率的影響（± s, n = 3）Tab. 2 Effects of Fuzheng Kang-Ai Decoction on cell viability in H460 cells（± s, n = 3）

表2 扶正抗癌方對H460細胞存活率的影響（± s, n = 3）Tab. 2 Effects of Fuzheng Kang-Ai Decoction on cell viability in H460 cells（± s, n = 3）

注：與空白對照組比較，**P < 0.01

組別 濃度/（mg/mL） 24 h存活率/% 48 h存活率/%空白對照組 - 100.00 ± 0.00 100.00 ± 0.00扶正抗癌方組 0.5 94.73 ± 3.80 82.96 ± 2.64**1.0 87.87 ± 2.42** 77.11 ± 1.48**1.5 67.60 ± 3.99** 61.31 ± 9.25**2.0 59.25 ± 6.40** 57.01 ± 3.27**2.5 53.64 ± 4.96** 48.29 ± 2.95**3.0 44.69 ± 4.58** 38.11 ± 6.06**F 80.252 64.023 P＜0.001 ＜0.001

2.2 扶正抗癌方對H460細胞周期的影響

與空白對照組比較，扶正抗癌方組（1.5、2.0、2.5 mg/mL）中G0/G1期的細胞增加，差異具有統計學意義（P< 0.05），S期的細胞減少，差異具有統計學意義（P< 0.05），G2/M期的細胞無顯著變化；且隨著給藥濃度的增加，G0/G1期的細胞逐漸增加，S期的細胞逐漸減少，見如圖1、表3。結果表明，扶正抗癌方能夠將H460細胞阻滯在G0/G1期以抑制腫瘤細胞生長，且呈濃度依賴性。

圖1 扶正抗癌方對H460細胞周期的影響（± s, n = 3）Fig.1 Effects of Fuzheng Kang-Ai Decoction on cell cycle in H460 cells（± s, n = 3）

表3 扶正抗癌方對H460細胞周期的影響（± s, n = 3）Tab. 3 Effects of Fuzheng Kang-Ai Decoction on cell cycle in H460 cells（± s, n = 3）

表3 扶正抗癌方對H460細胞周期的影響（± s, n = 3）Tab. 3 Effects of Fuzheng Kang-Ai Decoction on cell cycle in H460 cells（± s, n = 3）

注：與空白對照組比較，*P < 0.05，**P < 0.01

細胞數量/個G0/G1 S G2/M空白對照組 - 52.00 ± 1.00 26.33 ± 1.53 21.67 ± 0.58扶正抗癌方組 1.5 55.00 ± 1.00* 23.33 ± 1.15* 21.67 ± 0.58 2.0 60.67 ± 1.53** 16.67 ± 0.58** 22.67 ± 1.15 2.5 64.33 ± 1.53** 13.67 ± 1.15** 22.00 ± 1.00 F 55.333 76.833 0.889 P＜0.001 ＜0.001 0.487組別 濃度/（mg/mL）

2.3 扶正抗癌方對Cyclin D1、Cyclin E、CDK2、CDK4蛋白表達的影響

與空白對照組比較， 扶正抗癌方組 （2.0、 2.5 mg/mL）中Cyclin D1、Cyclin E、CDK2和CDK4蛋白的表達降低，差異具有統計學意義（P< 0.05），且隨著給藥濃度的增加，上述蛋白的表達呈下降趨勢，見圖2、表4。結果表明，扶正抗癌方能夠下調Cyclin D1、Cyclin E、CDK2和CDK4蛋白的表達，且呈濃度依賴性。

表4 扶正抗癌方對Cyclin D1、Cyclin E、CDK2、CDK4蛋白表達的影響（± s, n = 3）Tab. 4 Effects of Fuzheng Kang-Ai Decoction on the protein expression of Cyclin D1, Cyclin E, CDK2 and CDK4（± s, n = 3）

表4 扶正抗癌方對Cyclin D1、Cyclin E、CDK2、CDK4蛋白表達的影響（± s, n = 3）Tab. 4 Effects of Fuzheng Kang-Ai Decoction on the protein expression of Cyclin D1, Cyclin E, CDK2 and CDK4（± s, n = 3）

注：與空白對照組比較，*P < 0.05，**P < 0.01

組別 濃度/（ mg/mL） Cyclin D1/% Cyclin E/% CDK2/% CDK4/%空白對照組 - 100.00 ± 0.00 100.00 ± 0.00 100.00 ± 0.00 100.00 ± 0.00扶正抗癌方組 1.5 80.46 ± 15.32 91.45 ± 9.99 63.97 ± 17.37* 77.22 ± 18.29 2.0 58.72 ± 18.10* 60.19 ± 17.34* 59.26 ± 15.07** 67.35 ± 8.48**2.5 45.61 ± 5.48** 48.72 ± 10.03** 50.62 ± 7.51** 49.69 ± 5.99**F 11.654 14.414 9.685 11.940 P 0.003 0.001 0.005 0.003

圖2 扶正抗癌方對Cyclin D1、Cyclin E、CDK2、CDK4蛋白表達的影響（± s, n = 3）Fig.2 Effects of Fuzheng Kang-Ai Decoction on the protein expression of Cyclin D1, Cyclin E, CDK2 and CDK4（± s, n = 3）

2.4 扶正抗癌方對p27Kip1 mRNA及蛋白表達的影響

與空白對照組比較，扶正抗癌方組（2.0 mg/mL）中p27Kip1的mRNA表達增加，差異具有統計學意義（P< 0.05）；扶正抗癌方組（1.5、2.0、2.5 mg/mL）中p27Kip1蛋白表達增加，差異具有統計學意義（P< 0.05），且隨著給藥濃度的增加，p27Kip1蛋白表達呈上升趨勢，見圖3、表5。結果表明，扶正抗癌方能夠在基因及蛋白質水平上調p27Kip1的表達，且呈濃度依賴性。

表5 扶正抗癌方對p27Kip1 mRNA及蛋白表達的影響（± s, n = 3）Tab. 5 Effects of Fuzheng Kang-Ai Decoction on the mRNA and protein expression of p27Kip1（± s, n = 3）

表5 扶正抗癌方對p27Kip1 mRNA及蛋白表達的影響（± s, n = 3）Tab. 5 Effects of Fuzheng Kang-Ai Decoction on the mRNA and protein expression of p27Kip1（± s, n = 3）

注：與空白對照組比較，*P < 0.05，**P < 0.01；“-”表示沒有做相關實驗

組別 濃度/（ mg/mL） p27Kip1 mRNA/% p27Kip1 /%空白對照組 - 100.00 ± 0.00 100.00 ± 0.00扶正抗癌方組 1.5 - 128.62 ± 19.01*2.0 242.69 ± 40.09** 178.98 ± 13.05**2.5 - 262.79 ± 18.81**F/t 6.165 69.040 P 0.004 ＜0.001

圖3 扶正抗癌方對p27Kip1蛋白表達的影響（± s, n = 3）Fig.3 Effects of Fuzheng Kang-Ai Decoction on the expression of p27Kip1（± s, n = 3）

2.5 扶正抗癌方對miR221-3p表達的影響

與空白對照組比較，扶正抗癌方組（2.0 mg/mL）中miR221-3p的表達降低，差異具有統計學意義（P< 0.01），見表6。結果表明，扶正抗癌方能夠抑制miR221-3p的表達。

表6 扶正抗癌方對miR221-3p表達的影響（± s, n = 3）Tab. 6 Effects of Fuzheng Kang-Ai Decoction on the expression of miR221-3p（± s, n = 3）

表6 扶正抗癌方對miR221-3p表達的影響（± s, n = 3）Tab. 6 Effects of Fuzheng Kang-Ai Decoction on the expression of miR221-3p（± s, n = 3）

組別 濃度/（ mg/mL） miR221-3p/%空白對照組 - 100.00 ± 0.00扶正抗癌方組 2.0 59.76 ± 2.03 t 34.401 P＜0.001

2.6 miR221-3p對p27Kip1 mRNA表達的影響

將miR221-3p mimics及相應的陰性對照組轉染至H460細胞，48 h后發(fā)現，與陰性對照組比較，miR221-3p mimics組中miR221-3p的表達提高約400倍，p27Kip1mRNA的表達降低，差異具有統計學意義（P< 0.01）。將miR221-3p inhibitor及相應的陰性對照（nc-inhibitor組）轉染至H460細胞株，48 h后發(fā)現，與nc-inhibitor組比較，miR221-3p mimics組中miR221-3p的表達降低，差異具有統計學意義（P< 0.01），p27Kip1mRNA的表達增加，差異具有統計學意義（P< 0.01），見表7。結果表明，miR221-3p能夠靶向抑制p27Kip1mRNA的表達。

表7 miR221-3p對p27Kip1 mRNA表達的影響（± s, n = 3）Tab. 7 Effects of miR221-3p on the expression of p27Kip1 mRNA（± s, n = 3）

表7 miR221-3p對p27Kip1 mRNA表達的影響（± s, n = 3）Tab. 7 Effects of miR221-3p on the expression of p27Kip1 mRNA（± s, n = 3）

注：與陰性對照組比較，**P < 0.01；與nc-inhibitor組比較，#P < 0.05，##P < 0.01

組別 miR221-3p/% p27Kip1 mRNA/%陰性對照組 370.34 ± 147.55 100.00 ± 0.00 miR221-3p mimics組 144 800.00 ± 7 318.47** 50.08 ± 12.86**nc-inhibitor組 334.01 ± 90.72 100.00 ± 0.00 miR221-3p inhibitor組 84.84 ± 38.46# 369.95 ± 59.13##F 1169.458 69.113 P＜0.001 ＜0.001

2.7 miR221-3p與p27Kip1的結合位點驗證

為進一步驗證miR221-3p與p27Kip1的關系，根據軟件預測的結合位點序列構建了p27Kip1野生型和突變型含雙熒光素酶報告基因的質粒，分別檢測過表達miR221-3p對轉染了p27Kip1野生型和突變型報告基因熒光素酶活性的影響。與陰性對照組比較，經miR221-3p mimic處理后，轉染野生型報告基因質粒的細胞熒光素酶活性降低，差異具有統計學意義（P< 0.01），轉染突變型報告基因質粒的細胞熒光素酶活性無顯著變化，見圖4、表8。結果表明，野生型p27Kip1存在與miR221-3p結合的點位，miR221-3p與p27Kip1結合后可靶向抑制p27Kip1的表達。

圖4 miR221-3p與p27Kip1野生型、突變型結合點位的示意圖Fig.4 Schematic diagram of the binding site between miR221-3p and p27Kip1 wild-type or mutant

表8 miR221-3p對p27Kip1野生型報告基因和突變型報告基因熒光素酶活性的影響（± s, n = 3）Tab. 8 Effects of miR221-3p on the luciferase activity of p27Kip1 in the wild-type and mutant（± s, n = 3）

表8 miR221-3p對p27Kip1野生型報告基因和突變型報告基因熒光素酶活性的影響（± s, n = 3）Tab. 8 Effects of miR221-3p on the luciferase activity of p27Kip1 in the wild-type and mutant（± s, n = 3）

p27Kip1 3UTR Mut luciferase activity/%陰性對照組 100.00 ± 0.00 100.00 ± 0.00 miR221-3p mimics組 58.99 ± 8.97 94.16 ± 5.87 t 7.914 1.722 P 0.001 0.160組別 p27Kip1 3UTR Wt luciferase activity/%

3 討論

細胞周期的調控點分別是由G1期進入S期的G1/S檢測點和由G2期進入M期的G2/M檢測點。在腫瘤細胞中，調控點功能異常，細胞周期無法停滯，從而導致細胞無限增殖。本研究發(fā)現，扶正抗癌方能夠以濃度和時間依賴性抑制H460細胞的增殖，且可提高G1期細胞數量，降低S期細胞數量，推斷其可調控G1/S檢測點阻滯細胞分裂由G1期進入S期，進而抑制細胞增殖。

參與細胞周期調控的分子有細胞周期蛋白（Cyclin）、細胞周期依賴性激酶（CDKs）和細胞周期依賴性激酶抑制物（CDKIs）。Cyclin D1和Cyclin E可分別與CDK4和CDK2結合，形成復合物，促使細胞分裂由G1期進入S期[10]。Cyclin D1、Cyclin E、CDK4和CDK2在多種腫瘤細胞中高表達，是預后不良的重要指標[11]。本研究發(fā)現，扶正抗癌方能夠以濃度依賴性下調Cyclin D1、Cyclin E、CDK2和CDK4的表達。p27Kip1屬于CDKIs，是一種細胞周期負性調節(jié)因子，可與CyclinD1-CDK4和Cyclin E-CDK2復合物結合，阻斷復合物和ATP結合，阻滯細胞分裂由G1期進入S期[12]。格列衛(wèi)就是將p27Kip1作為一個重要的靶點，通過阻滯細胞周期，抑制腫瘤細胞增殖[13]。本研究發(fā)現，扶正抗癌方能夠以濃度依賴性上調p27Kip1mRNA及蛋白表達。

miRNAs可通過調控細胞周期相關蛋白影響細胞周期。miR320a可通過FoxM1-p27Kip1調控胃癌增殖[14]，miR221可通過抑制p27Kip1促進K562細胞增殖[15]。本研究利用軟件預測H460細胞中p27Kip1的上游miRNAs為miR221-3p，且扶正抗癌方能夠抑制miR221-3p的表達。進一步過表達或沉默miR221-3p表達時，發(fā)現p27Kip1mRNA的表達降低或增加，表明miR221-3p能夠靶向抑制p27Kip1mRNA的表達。同時，構建p27Kip1野生型和突變型含雙熒光素酶報告基因的質粒，發(fā)現過表達miR221-3p后，轉染野生型報告基因質粒的細胞熒光素酶活性降低，而突變型熒光素酶活性無顯著變化，表明野生型p27Kip1存在與miR221-3p結合的點位。

4 結論

扶正抗癌方可通過下調miR221-3p的表達，靶向上調p27Kip1基因和蛋白質的表達，并進一步調控下游Cyclin D1、Cyclin E、CDK2和CDK4蛋白的表達，使H460細胞周期阻滯在G0/G1期而抑制細胞增殖。本研究對進一步探明扶正抗癌方治療腫瘤的作用機制具有重要意義。