孫志軍，吳 丹，張俊婷，鄭 琴，張群林*

（1. 安徽醫(yī)科大學 藥學院，安徽 合肥 230032；2. 江西中醫(yī)藥大學 現(xiàn)代中藥制劑教育部重點實驗室，江西 南昌 330004）

冰片包括天然冰片和合成冰片，天然冰片由樟科植物樟Cinnamomum camphora(L.) presl的新鮮枝、葉經(jīng)提取加工制成。冰片在古籍中多以“龍腦香”“龍腦”為正名。宋代《本草衍義》記載：“此物大通，利關膈熱塞，其清香為百藥之先”。明代《本草綱目》記載：“龍腦香，釋名片香、羯婆羅香。辛、苦，微寒，無毒。療腦痛，通諸竅，散郁火”。研究表明冰片可通過鎮(zhèn)痛[1]、抗炎[2]、抗氧化[3]和抗癲癇[4]等機制發(fā)揮神經(jīng)保護作用，從而改善局灶性腦缺血[5]、阿爾茨海默癥[6]等神經(jīng)系統(tǒng)疾病導致的神經(jīng)功能損傷。PC12細胞是一種可顯示多種神經(jīng)元特性的神經(jīng)細胞株，已被廣泛應用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的體外研究[7-9]。6-OHDA是一種常見的用于實驗模擬黑質(zhì)變性的神經(jīng)毒素[10]。本實驗將建立6-OHDA誘導的PC12細胞損傷模型，用于研究天然冰片是否對PC12細胞具有保護作用，分別利用MTT法、倒置顯微鏡和流式細胞儀來檢測細胞存活率、觀察細胞形態(tài)以及檢測細胞凋亡情況。

1 材料與方法

1.1 試藥與儀器

天然冰片（批號：20170112）購于吉安市聚鵬天然香料油有限公司；6-OHDA（批號：18834）購于美國MCE生物科技公司；Annexin V-FITC/PI試劑盒購于上海貝博生物科技有限公司；DMEM高糖培養(yǎng)基購于上海源培生物科技股份有限公司；胎牛血清、青霉素-鏈霉素溶液（100 ×）、胰酶購于中國碧云天生物有限公司；噻唑藍（MTT）購于西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司；二甲基亞砜（DMSO）購于國藥化學試劑有限公司；TH4-200型倒置顯微鏡（日本奧林巴斯株式會社）；FACSVerse型流式細胞儀（美國碧迪公司）；Synergy HTX型酶標儀（美國伯騰儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1天然冰片溶液的配制 精密稱取天然冰片粉末適量，用DMSO溶解配成濃度為200 mg/mL的儲備液，4°C保存，使用時用細胞培養(yǎng)液稀釋至所需濃度。

1.2.2細胞培養(yǎng) PC12細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清中，青霉素100 U/mL，鏈霉素100 U/mL的DMEM高糖培養(yǎng)液，37℃，5% CO2。取對數(shù)生長期細胞傳代，用胰酶消化，倒置顯微鏡下觀察，計數(shù)并進行后續(xù)實驗。

1.2.3天然冰片對正常PC12細胞毒性實驗 將PC12細胞分為對照組和天然冰片濃度分別為20、40、60、80、100、120、140、160、180、200 μg/mL的實驗組。首先，將PC12細胞接種到96孔板中培養(yǎng)24 h。然后，對照組加入100 μL細胞培養(yǎng)液；實驗組加入100 μL不同濃度的天然冰片溶液。每個濃度設置4個復孔，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后棄去孔內(nèi)培養(yǎng)液，用PBS沖洗3次。接著，在每孔中加入20 μL MTT（5 mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO溶液。最后，將96孔板置于37℃搖床上震蕩10 min至顆粒充分溶解，在酶標儀上測定490 nm處的吸光度值，計算細胞存活率。

1.2.4細胞存活率實驗 將PC12細胞分為對照組、模型組和天然冰片濃度分別為7.5、15、30、60、120 μg/mL的實驗組。首先，將PC12細胞接種到96孔板中培養(yǎng)24 h。然后，對照組加入100 μL細胞培養(yǎng)液；模型組加入100 μL 100 μmol/L的6-OHDA溶液；實驗組提前24 h加入100 μL不同濃度天然冰片溶液培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h后棄去孔內(nèi)天然冰片溶液，PBS沖洗3次，加入100 μL 100 μmol/L的6-OHDA溶液。6-OHDA作用24 h后用MTT法檢測細胞存活率。（MTT實驗方法同“1.2.3”）

1.2.5細胞形態(tài)學實驗 將PC12細胞分為對照組、模型組和天然冰片濃度分別為7.5、15、30 μg/mL的實驗組。首先，將PC12細胞接種到6孔板中培養(yǎng)24 h；然后，對照組加入2 mL細胞培養(yǎng)液；模型組加入2 mL 100 μmol/L的6-OHDA溶液；實驗組提前24 h加入2 mL不同濃度天然冰片溶液培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h后棄去孔內(nèi)天然冰片溶液，PBS沖洗3次，加入2 mL 100 μmol/L的6-OHDA溶液。6-OHDA作用24 h后置倒置顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.6細胞凋亡率實驗 PC12細胞分組及給藥方法同“1.2.5”。按照Annexin V-FITC/PI試劑盒操作說明，胰酶消化并收集各組細胞于15 mL離心管中，在4℃、1 500 r/min條件下離心5 min，棄上清；用PBS沖洗2次后再次離心5 min，棄上清，收集細胞，用400 μL Annexin V結(jié)合液重懸細胞，轉(zhuǎn)至流式管中，在細胞懸液中加入Annexin V-FITC染色液5 μL，輕輕混勻后，置于冰上避光孵育15 min，然后加入10 μL PI染色液，輕輕混勻后于冰上避光孵育5 min后即可用流式細胞儀檢測，檢測波長為488 nm。

1.2.7統(tǒng)計學方法 用SPSS 22.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料用均數(shù) ± 標準差（±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。以P＜ 0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 天然冰片對正常PC12細胞毒性實驗結(jié)果

實驗結(jié)果顯示，天然冰片濃度在0 ～ 200 μg/mL范圍內(nèi)時，PC12細胞存活率大于85%；當天然冰片濃度低于140 μg/mL時，PC12細胞存活率高于對照組細胞存活率，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），說明該濃度范圍的天然冰片對正常PC12細胞具有增殖作用；當天然冰片濃度高于160 μg/mL時，PC12細胞存活率低于對照組細胞存活率，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），說明該濃度范圍的天然冰片對正常PC12細胞有一定的毒性作用，結(jié)果見表1。

表1 天然冰片對正常PC12細胞存活率的影響（±s, n = 6）Tab. 1 Effect of natural borneol on the cell viability of normal PC12 cells（±s, n = 6）

表1 天然冰片對正常PC12細胞存活率的影響（±s, n = 6）Tab. 1 Effect of natural borneol on the cell viability of normal PC12 cells（±s, n = 6）

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別 細胞存活率/%對照組 100.0 ± 0.5天然冰片組（20 μg/mL） 158.2 ± 2.6**天然冰片組（40 μg/mL） 156.3 ± 2.1**天然冰片組（60 μg/mL） 152.1 ± 1.4**天然冰片組（80 μg/mL） 149.6 ± 0.6**天然冰片組（100 μg/mL） 146.2 ± 1.1**天然冰片組（120 μg/mL） 117.4 ± 1.0**天然冰片組（140 μg/mL） 112.6 ± 2.3**天然冰片組（160 μg/mL） 97.6 ± 1.5*天然冰片組（180 μg/mL） 94.3 ± 2.1*天然冰片組（200 μg/mL） 86.3 ± 1.5**F 1 447.318 P 0.000

2.2 天然冰片對6-OHDA誘導損傷的PC12細胞存活率的影響

實驗結(jié)果顯示，對照組細胞存活率為（100 ±1.2）%，模型組細胞存活率為（71.5 ± 2.3）%，模型組細胞存活率低于對照組細胞存活率，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），該結(jié)果表明6-OHDA對PC12細胞具有損傷作用，提示建模成功；實驗組細胞存活率高于模型組細胞存活率，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），天然冰片濃度為15 μg/mL時，PC12細胞存活率最高，為（96.7 ± 2.6）%，結(jié)果見表2。以上結(jié)果表明，天然冰片可提高6-OHDA誘導損傷的PC12細胞的存活率。

表2 天然冰片對6-OHDA誘導損傷的PC12細胞存活率的影響 （±s, n = 6）Tab. 2 Effect of natural borneol on the cell viability of PC12 cells injured by 6-OHDA （±s, n = 6）

表2 天然冰片對6-OHDA誘導損傷的PC12細胞存活率的影響 （±s, n = 6）Tab. 2 Effect of natural borneol on the cell viability of PC12 cells injured by 6-OHDA （±s, n = 6）

注：與對照組比較，**P＜0.01；與模型組比，#P＜0.05，##P＜0.01

組別 細胞存活率/%對照組 100.0 ± 1.2模型組 71.5 ± 2.3**天然冰片組（7.5 μg/mL） 83.5 ± 1.9##天然冰片組（15 μg/mL） 96.7 ± 2.6##天然冰片組（30 μg/mL） 87.4 ± 3.9##天然冰片組（60 μg/mL） 80.7 ± 4.5##天然冰片組（120 μg/mL） 77.6 ± 5.1#F 47.167 P 0.000

2.3 天然冰片對6-OHDA誘導損傷的PC12細胞形態(tài)學的影響

倒置顯微鏡下觀察各組細胞形態(tài)，可見對照組PC12細胞呈梭形，胞體飽滿，密度大，折光性較強（圖1A）；與對照組相比，模型組PC12細胞體型變小，部分細胞損傷成圓形，密度減小，折光性減弱（圖1B）；與模型組相比，實驗組PC12細胞體型變大，密度增大，折光性增強，天然冰片濃度為15 μg/mL時效果最好（圖1C、D、E）。以上結(jié)果表明，天然冰片對6-OHDA誘導損傷的PC12細胞有形態(tài)保護作用。

圖1 天然冰片對6-OHDA誘導損傷的PC12細胞形態(tài)學的影響Fig.1 Effect of natural borneol on the cell morphology of PC12 cells injured by 6-OHDA

2.4 天然冰片對6-OHDA誘導損傷的PC12細胞凋亡的影響

實驗結(jié)果顯示，6-OHDA主要誘導PC12細胞早期凋亡，見圖2。對照組細胞凋亡率為 （0.6 ± 0.02） %，模型組細胞凋亡率為（28.7 ± 0.6）%，模型組細胞凋亡率高于對照組細胞凋亡率，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），該結(jié)果表明6-OHDA對PC12細胞具有損傷作用，提示建模成功。實驗組細胞凋亡率低于模型組細胞凋亡率，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），天然冰片濃度為15 μg/mL時，PC12細胞凋亡率最低，為（7.3 ± 0.4）%，結(jié)果見表3。以上結(jié)果表明，天然冰片對6-OHDA誘導損傷的PC12細胞凋亡有抑制作用。

圖2 天然冰片對6-OHDA誘導損傷的PC12細胞凋亡的影響 （±s, n = 6）Fig.2 Effect of natural borneol on the apoptosis of PC12 cells injured by 6-OHDA （±s, n = 6）

表3 天然冰片對6-OHDA誘導損傷的PC12細胞凋亡率的影響（±s, n = 6）Tab. 3 Effect of natural borneol on the apoptotic rate of PC12 cells injured by 6-OHDA （±s, n = 6）

表3 天然冰片對6-OHDA誘導損傷的PC12細胞凋亡率的影響（±s, n = 6）Tab. 3 Effect of natural borneol on the apoptotic rate of PC12 cells injured by 6-OHDA （±s, n = 6）

注：與對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01

組別 細胞凋亡率/%對照組 0.6 ± 0.02模型組 28.7 ± 0.6**天然冰片組（7.5 μg/mL） 20.4 ± 0.4##天然冰片組（15 μg/mL） 7.3 ± 0.4##天然冰片組（30 μg/mL） 11.7 ± 0.4##F 2 019.042 P 0.000

3 討論

有文獻報道芳香開竅藥對神經(jīng)細胞有很好的保護作用，蘇合香揮發(fā)油可保護大鼠皮層神經(jīng)細胞免受糖氧剝奪/再復氧（OGD/R）的損傷[11]；麝香可保護局灶性腦缺血大鼠神經(jīng)元[12]。但這類中藥大部分成分復雜，藥效成分不明確，生物靶點多，這就導致其發(fā)揮神經(jīng)保護作用的藥效成分很難確定。天然冰片為小分子化合物，2020年版《中國藥典》規(guī)定天然冰片含右旋龍腦不得少于96.0%，其具有藥效成分單一、明確、純度高的優(yōu)點。本研究以6-OHDA誘導損傷的PC12細胞為實驗對象，對天然冰片的神經(jīng)保護作用進行了研究。結(jié)果顯示，天然冰片可以保護PC12細胞免受神經(jīng)毒素6-OHDA的損傷，但天然冰片保護PC12細胞的機制尚不明確。芳香開竅藥石菖蒲的藥效成分β-細辛醚可通過抑制TNF-α、IL-1β的分泌，下調(diào)水通道蛋白4（AQP4）的表達來保護星形膠質(zhì)細胞，發(fā)揮神經(jīng)保護作用[13]，天然冰片可能通過相似的機制發(fā)揮對PC12細胞的保護作用，課題組后期將對其機制進行研究。

有文獻報道天然冰片可通過抑制腦海馬體CA1、CA3區(qū)中瞬時受體電位錨蛋白1（TRPA1）和瞬時感受器電位香草酸受體Ⅰ型蛋白（TRPV1）的表達以及增加神經(jīng)遞質(zhì)γ-氨基丁酸（GABA）的釋放，對癲癇持續(xù)狀態(tài)模型小鼠發(fā)揮抗驚厥作用[14]；天然冰片可通過增加B淋巴細胞瘤-2（Bcl-2）基因表達量，降低Bcl-2相關蛋白的表達來實現(xiàn)對阿爾茲海默癥的治療作用[6]。已有研究表明天然冰片對神經(jīng)損傷有治療作用。本研究不足之處在于未對天然冰片對6-OHDA誘導損傷的PC12細胞的治療作用進行研究，后期將進行考察。

4 結(jié)論

本研究表明芳香開竅藥天然冰片可以保護6-OHDA誘導損傷的PC12細胞，具有神經(jīng)保護作用。但天然冰片發(fā)揮神經(jīng)保護作用具體的機制有待進一步研究。本研究為芳香開竅藥天然冰片的神經(jīng)保護作用提供了理論依據(jù)和實驗支持，為天然冰片應用到神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療提供了理論基礎。