叢 悅 ，李 莉，關(guān)佳莉 ，拱健婷 ，王大仟 ，張金霞 ，趙藝萌

（北京市臨床藥學(xué)研究所，北京 100035）

中藥黃精為百合科植物黃精PolygonatumsibiricumRed.、多花黃精Polygonatum cyrtonemaHua或滇黃精Polygonatum kingianumColl. 的干燥根莖。味甘，性平，具有補(bǔ)氣養(yǎng)陰、健脾等功效[1-2]。我國黃精品種分布廣泛，三種基原植物有一定地域性。作為藥食兩用品種，近年來黃精市場需求激增，野生資源采伐過度。由于野生資源枯竭導(dǎo)致的種質(zhì)遺失以及人工育苗成本較高等原因，使得黃精種質(zhì)退化、混亂現(xiàn)象較為嚴(yán)重，因此開展黃精種質(zhì)資源研究, 評(píng)估不同地理居群遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu),對(duì)促進(jìn)黃精的資源保護(hù)和可支持發(fā)展十分必要。

葉綠體DNA是單倍型、母系遺傳，具有無等位基因重組、通過種子流交流、非編碼序列多態(tài)性位點(diǎn)豐富的特點(diǎn)，是研究種間較低分類階元和種內(nèi)譜系地理學(xué)較為理想的分子標(biāo)記。一些研究者已利用ISSR[3]、SCoT[4]、核糖體ITS序列[5]等分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)黃精遺傳多樣性、系統(tǒng)發(fā)育、分子鑒定等方面進(jìn)行了研究，但基于葉綠體DNA序列的黃精遺傳分析研究較少。本研究利用具有較快進(jìn)化速率的3個(gè)葉綠體基因序列psbA-trnH、rpl20-rps12和trnL-trnF[6]，對(duì)較多分布于東北及華北地區(qū)內(nèi)的16個(gè)野生和栽培黃精居群，以及我國東南部4個(gè)野生多花黃精居群進(jìn)行研究，旨在了解取樣范圍內(nèi)黃精和多花黃精的遺傳多樣性及其群體遺傳結(jié)構(gòu)，為黃精的資源保護(hù)和遺傳育種等研究提供一定的分子依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

于 2019年 4 月至 10月對(duì)分布于遼寧、河北、山西、陜西、浙江、廣西6省區(qū)黃精和多花黃精居群取樣，每個(gè)居群選取3～10棵植株，植株之間相距30～50 m，每棵植株采集新鮮葉片并立即用硅膠干燥，-80 ℃長期保存。黃精采集12個(gè)野生居群68個(gè)植株和4個(gè)栽培居群26個(gè)植株，多花黃精采集4個(gè)野生居群26個(gè)植株，樣品信息見表1。樣品由北京市中藥研究所李莉研究員鑒定，保存于北京中藥研究所黃精種質(zhì)資源圃。

表1 試驗(yàn)樣品信息和居群單倍型遺傳多樣性組成Tab. 1 The samples information and haplotype diversity of two species populations of Polygonatum

1.2 方法

1.2.1基因組總 DNA提取 、PCR擴(kuò)增及測序取葉片材料0.5 g放入預(yù)冷的研缽中,加液氮充分研磨成細(xì)粉。快速植物基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技公司）進(jìn)行總DNA提取，1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取結(jié)果，分光光度計(jì)測 DNA的濃度和純度。從文獻(xiàn)中描述的常用于居群遺傳分析的葉綠體 DNA 片段中選取10個(gè)片段進(jìn)行篩選，最終得到3個(gè)易于擴(kuò)增、變異位點(diǎn)較多的葉綠體 DNA片段：psbA-trnH、rpl20-rps12和trnL-trnF序列，引物由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成，所用引物序列及擴(kuò)增條件見表2。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)在25 μL 體系中完成,反應(yīng)體系：滅菌 ddH2O 10.2 μL，2 × Ultra HiFi Mix 15 μL，引物各2.5 μmol /L，DNA模板20 ng。擴(kuò)增程序?yàn)椋?94 ℃預(yù)變性5 min； 95 ℃變性10 s，54～56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共 35個(gè)循環(huán)，最后于72 ℃延伸15 min。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)檢測合格后送上海生工生物工程有限公司雙向測序。

表2 PCR反應(yīng)引物擴(kuò)增信息Tab.2 Amplification information of PCR reaction

1.2.2數(shù)據(jù)處理 測序峰圖使用Conting Express軟件進(jìn)行正反比對(duì)并手工進(jìn)行校正，經(jīng)ClustalX ver.1.81比對(duì)排列，去除前后兩端低質(zhì)量區(qū)，將序列中所有插入或缺失片段以單堿基突變處理。DnaSP ver.5.10 軟件統(tǒng)計(jì)變異位點(diǎn)和葉綠體序列單倍型，計(jì)算居群的單倍型數(shù)量、單倍型多樣性和核苷酸多態(tài)性。Permut 軟件計(jì)算居群內(nèi)平均遺傳多樣性HS 、總的遺傳多樣性HT和居群間遺傳分化系數(shù) GST 和 NST值。Arlequinv 3.5軟件對(duì)居群進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)分子變異分析，1 000次排列檢測不同分組變異的差異顯著性，統(tǒng)計(jì)計(jì)算群體內(nèi)及群體間的變異方差分布及群體遺傳分化系數(shù)（Fst）。MEGA ver.5 軟件以Kimura 2-parameter （K2-P）模型計(jì)算群體間的遺傳距離，1 000次重復(fù)自展程序進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)誤檢測，采用鄰接 N-J（Neighbor-Joining）法構(gòu)建基于K2-P距離的群體聚類圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉綠體基因序列差異及單倍型分布

葉 綠 體psbA-trnH、rpl20-rps12和trnL-trnF片段成功測序16個(gè)居群94個(gè)黃精個(gè)體，將3個(gè)序列聯(lián)合分析，比對(duì)后發(fā)現(xiàn)總序列長度變化范圍為1 475～1 480 bp，其中包含1 個(gè)堿基突變位點(diǎn)，1 個(gè)插入缺失位點(diǎn)，2個(gè)變異位點(diǎn)得到3個(gè)單倍型，單個(gè)居群的單倍型多樣性為 0～0.285，核苷酸多態(tài)性為0～0.000 19。15個(gè)黃精居群共享HS1單倍型，BDH1居群（北京大楊山）獨(dú)享HS3單倍型，STH2居群（陜西西安）中2株樣品為HS2單倍型，其余樣品為HS1單倍型。 多花黃精居群3個(gè)片段總序列長度變化范圍為1 539～1 564 bp，其中包含12個(gè)堿基突變位點(diǎn)，4個(gè)插入缺失位點(diǎn)，得到6個(gè)單倍型，單個(gè)居群的單倍型多樣性為 0～0.833，核苷酸多態(tài)性為0～0.005 91。ZHD居群（浙江杭州）單倍型多樣性最高（Hd =0.833），共有HC2、HC5、HC6 3種單倍型；其次是GHD（廣西桂林）和LXD（遼寧岫巖）居群，各有2種單倍型（Hd = 0.476 / 0.429）。HLD（遼寧瓦房店）和LXD居群共享HC3單倍型，LXD和ZHD居群共享HC2單倍型，見表1和表3。

表3 3個(gè)葉綠體DNA片段的單倍型多態(tài)性位點(diǎn)Tab. 3 Variable sites of three chloroplast DNA sequences haplotypes

2.2 居群遺傳結(jié)構(gòu)分析

對(duì)黃精3種單倍型進(jìn)行Permut計(jì)算結(jié)果表明，黃精居群總的遺傳多樣性為0.142，居群內(nèi)平均遺傳多樣性為0.108，說明黃精具有較低的遺傳多樣性；居群間遺傳分化系數(shù) GST為0.874， 略小于NST =0.875，表明在整個(gè)分布區(qū)不存在明顯的分子譜系地理學(xué)結(jié)構(gòu)。分子變異分析顯示黃精的種群變異主要源于居群間，居群間的遺傳變異為69.83%，顯著高于居群內(nèi)的遺傳變異30.17%，具有較高的遺傳分化系數(shù)Fst = 0.698 3。多花黃精居群總的遺傳多樣性為0.857，居群內(nèi)平均遺傳多樣性為0.435，說明多花黃精具有中低度水平的遺傳多樣性； 居群間遺傳分化系數(shù) GST為0.493，大于NST =0.450，表明在多花黃精分布區(qū)不存在分子譜系地理學(xué)結(jié)構(gòu)。分子變異分析顯示多花黃精的種群變異主要源于居群間，居群間的遺傳變異為59.33%，而居群內(nèi)的遺傳變異為40.67%，遺傳分化系數(shù)Fst = 0.593 3，見表4和表5。

表4 居群遺傳結(jié)構(gòu)參數(shù)Tab. 4 Genetic structural parameters of two species populations of Polygonatum

表5 居群葉綠體基因單倍型分子方差分析Tab. 5 Analysis of molecular variance for cpDNA haplotypes

2.3 居群聚類分析

依據(jù)遺傳距離采用鄰接法對(duì)16個(gè)黃精居群和4個(gè)多花黃精居群進(jìn)行聚類分析。16個(gè)黃精居群和廣西桂林多花黃精居群 （GHD）聚為一支，其它3個(gè)多花黃精居群聚成另一支，見圖1。遼寧岫巖（LXD）和遼寧瓦房店（LHD）聚為一支后再與浙江杭州（ZHD）匯成一支。

圖1 基于群體間遺傳距離構(gòu)建的16個(gè)黃精居群和4個(gè)多花黃精居群NJ 系統(tǒng)樹Fig.1 NJ phylogenetic tree of 16 populations of P. sibiricum Red and 4 populations of P. cyrtonema Hua based on genetic distance of populations

3 討論

遺傳多樣性是決定了物種適應(yīng)外界生長環(huán)境能力的高低。遺傳多樣性越高，進(jìn)化速率越快，說明該居群對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力就越強(qiáng)[7]。本研究測定96個(gè)黃精植株和26株野生多花黃精分析發(fā)現(xiàn)多花黃精總的遺傳多樣性和居群內(nèi)平均遺傳多樣性均高于黃精居群，表現(xiàn)出較高的遺傳多樣性。

物種的遺傳多樣性水平主要受植物的地理分布、繁育系統(tǒng)和有效群體大小的影響，并且普遍認(rèn)為栽培居群的遺傳多樣性要低于野生居群[8]。本研究中，黃精野生居群和栽培居群的遺傳多樣性水平均處于較低水平，二者遺傳多樣性幾乎沒有差異。東北地區(qū)黃精生境破壞嚴(yán)重，導(dǎo)致有效群體嚴(yán)重減小，遺傳漂變概率增加，因此遺傳多樣性降低。同時(shí)，栽培黃精長期無性繁育也導(dǎo)致了引種居群遺傳均質(zhì)化。張恒慶等[9]利用ISSR比較分析大連地區(qū)黃精與多花黃精遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)黃精種群遺傳多樣性明顯低于多花黃精與本研究結(jié)果較為一致。從植物進(jìn)化歷史角度來看，黃精屬植物處在較活躍的分化階段，多花黃精所屬的互葉系相對(duì)黃精所屬的輪葉系是相對(duì)進(jìn)化的類群[10]，因此多花黃精表現(xiàn)出較高的遺傳多樣性。

群體的遺傳結(jié)構(gòu)能夠反映群體在進(jìn)化過程中所經(jīng)歷的突變、重組、遺傳漂變及選擇效應(yīng)等因素。研究中發(fā)現(xiàn)黃精和多花黃精居群都存在較高的遺傳分化（Fst = 0.698 3 / 0.593 3），居群間分化大于居群內(nèi)（69.83% > 30.17% , 59.33% > 40.67%）。造成遺傳分化較高的原因與其生長環(huán)境有關(guān)。黃精和多花黃精一般生長在生林、灌叢和山坡陰處，生境阻隔限制了基因交流，群體不易擴(kuò)散。此外，在自然狀態(tài)下種子成熟所需的時(shí)間較長，繁殖能力低，向外擴(kuò)散的能力有限，因此也造成群體間的基因交流受阻。

基于遺傳距離的居群聚類分析顯示，相對(duì)于其它多花黃精居群，GHD居群遺傳距離與黃精更為接近，與黃精聚為一支。黃精作為多基原藥用植物，由于各類群間性狀交叉，地理分布區(qū)重疊，互生葉系與輪生葉系植物一直存在差異減小的現(xiàn)象[11]，因此處于比較活躍分化期的黃精屬植物存在種間雜交現(xiàn)象。遼寧多花黃精LJD和LXD兩個(gè)居群聚為一支，表現(xiàn)出一定的地理相關(guān)性，但由于居群數(shù)目較少，有待于擴(kuò)大樣本進(jìn)一步分析。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果顯示，在所收集區(qū)域內(nèi)黃精居群序列變異小，具有較低的遺傳多樣性，多花黃精居群序列變異較為豐富，表現(xiàn)出更高的遺傳多樣性。遺傳結(jié)構(gòu)分析顯示，兩個(gè)種群均有較高的遺傳分化系數(shù)，種群變異主要來源于居群間。通過比較群體間遺傳分化系數(shù)發(fā)現(xiàn)，黃精和多花黃精在整個(gè)分布區(qū)不存在明顯的分子譜系地理學(xué)結(jié)構(gòu)。本研究采用葉綠體DNA分子標(biāo)記方法對(duì)黃精和多花黃精進(jìn)行了遺傳多樣性的分析，為闡明其系統(tǒng)分類、資源鑒定和資源保護(hù)措施制定等方面提供了依據(jù)。