顧媛媛，陳 媚，王連芝，張淑香，尚艷琦，梁 慧，周忠光

（黑龍江中醫(yī)藥大學 中醫(yī)藥研究院，黑龍江 哈爾濱 150040）

缺血性心血管疾病是臨床上常見病、多發(fā)病，心肌組織缺血后，會發(fā)生一定程度的損傷甚至死亡，嚴重威脅著人類的健康。隨著對缺血性心血管疾病病因、發(fā)病機制的深入研究，最近的研究數(shù)據(jù)表明自噬在缺血性心血管疾病發(fā)病機制中起重要作用[1]。自噬是近年來生命科學研究的熱點，是一種組成型活躍的、進化保守的生理性自我降解過程[2]，有望成為缺血性心血管疾病中一種新的治療靶點。

關(guān)于益氣活血方或益氣活血法在臨床研究中有很多，多用于慢性心力衰竭、心絞痛、心肌梗死、冠心病等癥的治療[3-5]。本實驗中所用的益氣活血方劑是由當歸、川芎、地龍、三七、紅花、山楂等11味中藥組成，是在腦得生的基礎(chǔ)上進行加減配伍而成，多年臨床實踐表明具有益氣活血、化瘀通絡(luò)等功效[6-7]。本課題組前期實驗發(fā)現(xiàn)其對心肌缺血也有一定的保護作用，但研究尚未深入，作用機制也不清楚，因此，本實驗擬通過建立大鼠急性心肌缺血損傷模型，觀察益氣活血方對心肌缺血損傷的保護作用并探討其自噬相關(guān)作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1藥品與試劑 益氣活血方由川芎、當歸、三七等11 味中藥材經(jīng)提純制得，地奧心血康（批號：1709054，成都地奧制藥集團有限公司）；異丙腎上腺素（美國Sigma-Aldrich公司）；10%水合氯醛（天津市福晨化學試劑廠）；氯化三苯基四氮唑（TTC）（北京索萊寶科技有限公司）；2.5%戊二醛電鏡固定液[北京雷根（Leagene）生物技術(shù)有限公司]；Trizol試劑（北京天根生化科技有限公司）；PCR反應試劑盒（批號：DRR037，大連寶生物公司）；SYBR PrimeScript RTPCR試劑盒（批號：DRR041，大連寶生物公司）。

1.1.2實驗動物 SD健康大鼠60只，雄性，體質(zhì)量為220～250 g。由黑龍江中醫(yī)藥大學藥物安全評價中心提供，許可證號：SCXK（黑）2013-004。

1.1.3主要儀器 902-ULTS型超低溫冰箱（美國Thermo公司）；KDC-160R型高速冰凍離心機（科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司）；HITACHI H-7650型透射電鏡（日本日立公司）；7500型熒光定量PCR（美國ABI公司）。

1.2 方法

1.2.1分組、給藥及模型制備 將60只SD大鼠隨機分成空白組、模型組、地奧心血康組（54 mg/kg）、益氣活血方高、中、低劑量組（2.916、1.458、0.729 g/kg），每組10只，連續(xù)灌胃給藥14 d，1次/d。利用腹腔注射異丙腎上腺素（5 mg/kg，1次/d，連續(xù)3 d）對大鼠進行給藥造模[8-9]。

1.2.2心肌梗死面積的測定 取缺血24 h后的大鼠心臟，用生理鹽水沖洗干凈，用保鮮膜包裹后放入-20 ℃下冷凍1 h。取出后自心尖向心底橫切制作成約1.2 mm的組織切片，浸入1% TTC磷酸鹽緩沖液中，于37 ℃避光孵育15 min。正常心肌組織將呈現(xiàn)紅色，梗死的心肌組織呈現(xiàn)蒼白色[10]。采用數(shù)碼相機拍照采集圖像，用Image ProPlus 6.0軟件分析處理圖像并計算心肌梗死面積。

1.2.3透射電鏡觀察對心肌細胞超微結(jié)構(gòu)影響取大鼠心肌組織，用生理鹽水沖洗干凈，修剪成大小約為1 mm3。置于2.5%戊二醛電鏡固定液中固定，并于4 ℃保存，送哈爾濱醫(yī)科大學電鏡中心行透射電鏡檢查，觀察各組心肌細胞超微結(jié)構(gòu)的變化。

1.2.4Atg5、Beclin1、Caspase-3 mRNA的 表 達

取缺血區(qū)心肌組織，使用Trizol試劑提取組織總RNA，分光光度計法檢測RNA的純度，參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明反轉(zhuǎn)錄成cDNA進行PCR擴增（擴增引物由上海生工公司合成，序列見表1）。PCR反應條件為：預變性95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，共40個循環(huán)，同時在60 ～ 95 ℃進行溶解曲線分析。以GAPDH為內(nèi)參基因，每個樣本重復檢測3個孔，記錄CT值，結(jié)果采用2-ΔΔCT法進行數(shù)據(jù)的相對定量分析。

表1 PCR 引物序列Tab. 1 PCR primer sequence

1.2.5統(tǒng)計學方法 用SPSS 17.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù) ± 標準差（±s）表示，多組間比較采用方差分析。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 對心肌梗死面積的影響

空白組大鼠心肌染色正常，幾乎未見無梗死；與空白組比較，模型組梗死面積增多（P＜0.01），表明心肌梗死程度嚴重；與模型組比較，地奧心血康組，益氣活血方各劑量組均能減少心肌梗死面積（P＜0. 01），減輕心肌梗死程度。提示益氣活血方對大鼠心肌缺血損傷有保護作用，具體見表2。

表2 對急性心肌缺血模型大鼠心肌梗死面積的影響（± s，n ＝ 6）Tab. 2 Effects on the area of myocardial infarction in rats acute myocardial ischemia（± s，n ＝ 6）

表2 對急性心肌缺血模型大鼠心肌梗死面積的影響（± s，n ＝ 6）Tab. 2 Effects on the area of myocardial infarction in rats acute myocardial ischemia（± s，n ＝ 6）

注：與空白組比較，1）P＜0.05，2）P＜0.01；與模型組比較，3）P＜0.05，4）P＜0. 01（下表同）

組別 心肌梗死面積/%空白組 0模型組 46.43 ± 2.632）地奧心血康組 22.96 ±1.744）益氣活血方高劑量組 23.65 ±1.824）益氣活血方中劑量組 28.23 ±1.574）益氣活血方低劑量組 33.27 ±1.634）F 8.571 P 0.000

2.2 透射電鏡觀察對心肌細胞超微結(jié)構(gòu)影響

空白組心肌細胞核及染色質(zhì)分布均勻，肌纖維肌絲排列致密，閏盤結(jié)構(gòu)規(guī)則清晰，線粒體脊清晰可見。模型組心肌細胞凋亡，染色質(zhì)聚集，肌絲疏松斷裂，閏盤開裂，線粒體腫脹，與心肌肌絲之間有空泡，心肌細胞核腫脹。益氣活血方低劑量組線粒體局灶變性，糖原增多，堆積，說明線粒體利用糖原的能力下降；心肌細胞核正常，閏盤、線粒體變形，糖原堆積。益氣活血方中、高劑量組和地奧心血康組心肌超微結(jié)構(gòu)均有不同程度的改善，線粒體排列較為規(guī)則，呈圓形或橢圓形，肌絲疏松，排列整齊，線粒體完好；閏盤較完整，心肌細胞核正常，以益氣活血方高劑量組最為顯著。說明益氣活血方能夠明顯改善心肌超微結(jié)構(gòu)，且高劑量組改善程度最為明顯，具體見圖1。

圖1 各組大鼠心肌組織的超微結(jié)構(gòu)Fig.1 Ultrastructure of myocardial tissue in each group of rats

2.3 PCR法檢測各組大鼠心肌組織中Atg5、Beclin 1、Caspase-3基因表達

結(jié)果表明，與空白組比較，模型組大鼠心肌組織中Atg5、Beclin 1 mRNA的相對表達量均降低（P＜0.01），Caspase-3 mRNA的相對表達量均升高（P＜0.01）；與模型組比較，地奧心血康組和益氣活血方高、中、低劑量組大鼠心肌組織中Atg5、Beclin 1 mRNA的相對表達量均升高（P＜0.01或P＜0.05），Caspase-3 mRNA的相對表達量均降低（P＜0.01或P＜0.05），具體見表3。

表3 各組大鼠心肌組織中Atg5、Beclin1、Caspase-3 mRNA 相對表達量的檢測結(jié)果（± s，n ＝ 6）Tab. 3 The detection results of the relative expression of Atg5, Beclin1 and Caspase-3 mRNA in the myocardial tissue of each group of rats（± s，n ＝ 6）

表3 各組大鼠心肌組織中Atg5、Beclin1、Caspase-3 mRNA 相對表達量的檢測結(jié)果（± s，n ＝ 6）Tab. 3 The detection results of the relative expression of Atg5, Beclin1 and Caspase-3 mRNA in the myocardial tissue of each group of rats（± s，n ＝ 6）

組別 Atg5 Beclin l Caspase-3空白組 4.159 2 ± 0.238 5 0.019 4 ± 0.002 3 0.887 6 ± 0.095 2模型組 0.685 7 ± 0.0892 2） 0.003 3 ± 0.0072） 5.064 6 ± 0.375 92）地奧心血康組3.080 5 ± 0.312 24） 0.016 9 ± 0.002 54） 1.879 6 ± 0.087 64）2.738 1 ± 0.265 44） 0.013 5 ± 0.001 84） 2.650 9 ± 0.214 24）2.027 3 ± 0.311 74） 0.010 8 ± 0.002 24） 3.817 2 ± 0.179 24）1.350 2 ± 0.089 13） 0.007 1 ± 0.001 23） 4.259 1 ± 0.294 2益氣活血方高劑量組益氣活血方中劑量組益氣活血方低劑量組F 11.292 9.136 6.438 P 0.000 0.000 0.002

3 討論

自噬相關(guān)基因參與自噬的調(diào)節(jié)，Atg5是參與細胞自噬性死亡的重要蛋白，與Atg12、Atg16形成復合物，參與自噬體的形成，最終使膜聚集以形成新的自噬體[11-12]。Beclin1是自噬起始階段的關(guān)鍵調(diào)控分子之一[13]，最初是由LIANG X H等[14]在研究致死性Sinbis病毒性腦炎的大鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的，是第一個被鑒定出的哺乳動物自噬相關(guān)基因。Beclin1與PI3KC3結(jié)合，參與自噬體的形成，下調(diào)細胞的自噬活性。而Caspase-3是細胞凋亡過程中的一個關(guān)鍵酶。

本研究通過給大鼠腹腔注射異丙腎上腺素制備急性心肌缺血模型，觀察益氣活血方對心肌缺血模型大鼠的藥效學作用，同時探索益氣活血方在防治心肌缺血可能的作用機制及其靶點。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，地奧心血康組和益氣活血方各劑量組心肌細胞的超微結(jié)構(gòu)以及心肌梗死面積等均有較大的改善，說明益氣活血方對大鼠急性心肌缺血具有一定的防治效果。在確定療效的基礎(chǔ)上，我們對益氣活血方預防大鼠急性心肌缺血的自噬作用機制進行了初步的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)益氣活血方高、中、低劑量組大鼠心肌組織中Atg5、Beclin 1 mRNA的相對表達量均顯著提高，Caspase-3mRNA的相對表達量均顯著降低。說明益氣活血方對心肌缺血引起的心肌損傷具有預防作用，其作用機制可能通過自噬途徑下調(diào)Caspase-3表達有關(guān)。

由于自噬的調(diào)控機制尚未完全闡明，以及自噬與缺血性心血管疾病關(guān)系的復雜多樣，至今關(guān)于自噬在疾病發(fā)生與發(fā)展中的作用及其分子機制的研究尚處于初級研究階段，隨著研究的深入，有望為以自噬為靶標的缺血性心血管疾病的診斷治療和藥物研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究探討益氣活血方對大鼠心肌缺血損傷的保護作用及其作用機制，結(jié)果顯示，益氣活血方能夠明顯減輕心肌缺血模型大鼠心肌梗死程度，改善心肌超微結(jié)構(gòu)。說明益氣活血方對大鼠急性心肌缺血具有一定的保護作用，其作用機制可能是通過自噬途徑實現(xiàn)的。但由于中藥復方成分及作用機制復雜，對于更深入的作用機制有待于進一步探究。