張竣 張瑩 王樹坤 侯琳 袁增強(qiáng),

(1 青島大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山東 青島 266071； 2 軍事醫(yī)學(xué)研究院軍事認(rèn)知與腦科學(xué)研究所)

隨著社會人口的老齡化，人群缺血性腦白質(zhì)病變(WMIL)發(fā)病率逐漸增高，且WMIL與神經(jīng)退行性疾病密切相關(guān)[1-2]。MIL的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，高血壓、糖尿病、高血脂等常見的老年疾病往往會誘發(fā)MIL，其中慢性腦缺血引發(fā)的WMIL在中老年人MIL中占比極高[3-4]。對血管性癡呆患者隨訪研究發(fā)現(xiàn)，其發(fā)病前腦白質(zhì)就已經(jīng)出現(xiàn)血流量減少的現(xiàn)象[5]。WMIL患者臨床表現(xiàn)為認(rèn)知障礙、情感障礙，患者不僅生活能力顯著下降，而且給家庭帶來沉重的負(fù)擔(dān)[6]。但是，目前WMIL尚無針對性的治療手段。腦白質(zhì)中少突膠質(zhì)細(xì)胞(OLs)含量豐富，且對低灌注異常敏感，極易發(fā)生缺血缺氧從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[7]。因此，亟需進(jìn)一步研究OLs缺血缺氧導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的機(jī)制。

非受體酪氨酸激酶(c-Abl)廣泛表達(dá)于機(jī)體的細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)中，其下游底物眾多，與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞黏附、細(xì)胞周期、氧化應(yīng)激和DNA損傷等均密切相關(guān)[8-10]。c-Abl最初作為一種癌基因被發(fā)現(xiàn)，與B細(xì)胞受體融合表達(dá)引發(fā)慢性粒細(xì)胞白血病[11]。近些年來，c-Abl在神經(jīng)系統(tǒng)中的作用越來越受到關(guān)注[12-13]。在體外培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞中，過氧化氫可激活c-Abl，通過磷酸化哺乳動物Ste20樣激酶1/2(MST1/2)介導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡[14-15]；在阿爾茲海默病中，β-淀粉樣蛋白(Aβ)可激活c-Abl，通過磷酸化細(xì)胞抑癌因子p73導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡[16]；在帕金森病中，1-甲基-4苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(MPTP)及1-甲基-4苯基吡啶(MPP+)均可激活c-Abl，通過磷酸化p38 Y182位點(diǎn)導(dǎo)致了多巴胺能神經(jīng)元的凋亡[17]。但是，c-Abl在OLs中的作用少有報(bào)道。本研究在體外建立oli-neu和OLs糖氧剝奪(OGD)模型，初步探討c-Abl如何參與OGD介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，以揭示細(xì)胞缺血缺氧的分子機(jī)制，為WMIL的防治提供新靶點(diǎn)與新思路。

1 材料與方法

1.1 動物及材料

出生后3 d 的C57BL/6J乳鼠(北京斯貝福公司)；少突膠質(zhì)細(xì)胞系(oli-neu)(本實(shí)驗(yàn)室儲存)；DMEM/F12培養(yǎng)基(美國Gibco 公司)；甲狀腺素T3、多聚右旋賴氨酸(PDL)(美國Sigma公司)；c-Abl磷酸化抑制劑ABL001(美國Selleck公司)；Y245-c-Abl抗體和p-p38抗體(美國Cell Signaling Technology公司)；caspase-3抗體(武漢三鷹生物公司)；Anexin V-FITC/PI試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；CellTiter-Glo試劑盒(美國Promega公司)。

1.2 方法

1.2.1oli-neu與OLs的培養(yǎng) 將oli-neu接種于含體積分?jǐn)?shù)0.05的胎牛血清、體積分?jǐn)?shù)0.01的馬血清、體積分?jǐn)?shù)0.01的鏈霉素和體積分?jǐn)?shù)0.02的B27(100倍)的高糖DMEM/F12培養(yǎng)基中，置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi),培養(yǎng)至合適密度后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。取生后3 d的C57BL/6J乳鼠經(jīng)低溫麻醉后處死，乙醇消毒后剝離大腦半球，使用抗體吸附方法[18]獲得原代少突膠質(zhì)前體細(xì)胞(OPCs)，用DMEM/F12重懸計(jì)數(shù)后均勻鋪于PDL包被的培養(yǎng)皿中，1.5 h后將培養(yǎng)基更換為OPC增殖培養(yǎng)基，再培養(yǎng)1 d后，更換為含有T3的OPC分化培養(yǎng)基，分化3 d后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2oli-neu細(xì)胞活力和凋亡的檢測 將oli-neu以每孔約103個(gè)均勻平鋪于96孔板中，培養(yǎng)36 h后，將oli-neu進(jìn)行OGD處理(置于含體積分?jǐn)?shù)0.05的CO2和體積分?jǐn)?shù)0.1的O2的無糖培養(yǎng)基中培養(yǎng))，分別于第0、3、6、9小時(shí)時(shí)使用CellTiter-Glo試劑盒檢測自發(fā)光強(qiáng)度，測定oli-neu的活力。oli-neu先分別加入等體積的二甲基亞砜(DMSO)(A組)和ABL001(100 nmol/L)(B組)進(jìn)行預(yù)處理后，再經(jīng)OGD處理6 h以后，測定oli-neu細(xì)胞活力。將oli-neu以每孔約106個(gè)均勻平鋪于12孔板中，培養(yǎng)24 h后進(jìn)行OGD處理，分別于第0、3、6、9小時(shí)時(shí)使用Annexin V-FITC/PI試劑盒檢測細(xì)胞凋亡情況，細(xì)胞凋亡判斷標(biāo)準(zhǔn)：Annexin V-FITC(-)/PI(+)為壞死細(xì)胞，Annexin V-FITC(+)/PI(+)為晚期凋亡細(xì)胞，Annexin V-FITC(+)/PI(-)為早期凋亡細(xì)胞，Annexin V-FITC(-)/PI(-)為正常細(xì)胞。細(xì)胞凋亡率的計(jì)算方法為早期凋亡細(xì)胞與晚期凋亡細(xì)胞之和與總細(xì)胞的比值。

1.2.3Western blot方法檢測oli-neu和OLs中相關(guān)蛋白的相對表達(dá)量 分別將oli-neu和OLs以每孔約106個(gè)均勻平鋪于12孔板中，培養(yǎng)24 h后，分別進(jìn)行OGD處理，并分別于第0、3、6、9 h小時(shí)時(shí)使用裂解液(提前加入蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑)提取總蛋白，先采用BCA試劑盒測定濃度后再進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)[18]。分別加入Y245-c-Abl抗體和p-p38抗體(1∶500)4 ℃孵育過夜，以β-actin作為內(nèi)參照。使用Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值，目的蛋白相對表達(dá)量以目的蛋白灰度值/內(nèi)參照蛋白灰度值計(jì)算，結(jié)果取3次實(shí)驗(yàn)的均值。同時(shí)對A組、B組采用Western blot方法檢測oli-neu中Y245-c-Abl、p-p38和caspase-3蛋白的相對表達(dá)水平，其中以cleaved-caspase-3的相對表達(dá)量與pro-caspase-3的相對表達(dá)量的比值表示細(xì)胞凋亡的相對變化，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。于OLs中先分別加入等體積的DMSO(C組)和ABL001(100 nmol/L)(D組)進(jìn)行預(yù)處理以后，再經(jīng)OGD處理6 h，同樣采用Western blot方法檢測OLs中Y245-c-Abl、p-p38蛋白相對表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié) 果

2.1 OGD對oli-neu細(xì)胞活力和凋亡的影響

oli-neu經(jīng)OGD處理第0、3、6、9小時(shí)時(shí)細(xì)胞活力分別為1.00±0.02、0.88±0.03、0.38±0.07、0.31±0.01，細(xì)胞凋亡率分別為(12.47±2.11)%、(16.82±1.31)%、(23.43±2.41)%、(35.68±3.16)%，隨著OGD處理時(shí)間的延長，細(xì)胞活力明顯下降，細(xì)胞凋亡率明顯上升(F=249.10、68.18,P<0.05)。

2.2 oli-neu和OLs經(jīng)OGD處理后Y245-c-Abl和p-p38蛋白的相對表達(dá)水平比較

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，oli-neu和OLs經(jīng)OGD處理第0、3、6、9小時(shí)時(shí)，各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞內(nèi)Y245-c-Abl、p-p38蛋白的相對表達(dá)水平比較差異均有顯著性(F=4.68～15.93，P<0.05)；在OGD處理第6小時(shí)時(shí)oli-neu內(nèi)上述兩種蛋白表達(dá)水平較第0小時(shí)時(shí)顯著升高(q=3.61、4.01,P<0.05)；在OGD處理第3小時(shí)時(shí)OLs內(nèi)Y245-c-Abl蛋白的相對表達(dá)水平較第0小時(shí)時(shí)顯著升高(q=2.99，P<0.05)；在OGD處理第3、6、9小時(shí)時(shí)，OLs內(nèi)的p-p38蛋白的相對表達(dá)水平較第0小時(shí)時(shí)顯著升高(q=4.48～6.20，P<0.05)。結(jié)果見表1。

表1 OGD處理oli-neu和OLs不同時(shí)間點(diǎn)Y245-c-Abl、p-p38蛋白相對表達(dá)水平比較

2.3 ABL001預(yù)處理對oli-neu和OLs的影響

A、B組中oli-neu的細(xì)胞活力分別為0.39±0.07、0.53±0.01，細(xì)胞凋亡率則分別為(22.41±0.53)%、(18.76±1.81)%，兩組細(xì)胞活力和凋亡率比較，差異均具有顯著性(t=3.81、3.33，P<0.05)。Western blot結(jié)果顯示，A組oli-neu內(nèi)Y245-c-Abl和p-p38蛋白的相對表達(dá)水平及cleaved-caspase-3/pro-caspase-3比值分別為0.74±0.02、0.83±0.06和1.04±0.05，B組分別為0.64±0.04、0.54±0.12和0.90±0.06，A、B組間上述3個(gè)指標(biāo)比較差異均有顯著性(t=2.80～4.23，P<0.05)。C組OLs內(nèi)Y245-c-Abl和p-p38蛋白的相對表達(dá)水平分別為0.91±0.15、0.90±0.15，D組分別為0.49±0.17、0.64±0.05，C、D組間上述2個(gè)指標(biāo)比較差異均有顯著性(t=3.06、3.79，P<0.05)。

3 討 論

膠質(zhì)細(xì)胞在大腦的營養(yǎng)傳遞、吞噬和修復(fù)等方面發(fā)揮重要作用[19-20]。OLs是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的成髓細(xì)胞[21-22]。OLs沿著軸突形成髓鞘，在髓鞘間的間隔形成郎飛結(jié)來完成動作電位間跳躍式傳導(dǎo)，對神經(jīng)元起到保護(hù)、快速傳導(dǎo)的作用[23-24]。此外，OLs還可通過釋放腦源性生長因子等為神經(jīng)元提供營養(yǎng)支持，尤其是在長投射的軸突中[25-26]。OLs對神經(jīng)元的保護(hù)和神經(jīng)功能的維持至關(guān)重要，其功能障礙會直接導(dǎo)致神經(jīng)元的退行性病變[27]。

腦白質(zhì)具有動脈走行較長、側(cè)支循環(huán)少的供血特點(diǎn)，對低灌注非常敏感，容易發(fā)生缺血性病變[7]。目前臨床對WMIL尚無針對性的治療方案。本研究對oli-neu經(jīng)OGD處理，結(jié)果顯示隨著OGD處理時(shí)間的延長，細(xì)胞活力顯著下降，細(xì)胞凋亡率明顯升高，提示在oli-neu經(jīng)OGD處理過程中可能有多種凋亡信號被激活。

c-Abl在多物種間高度保守，且參與眾多的細(xì)胞過程，包括調(diào)控肌動蛋白細(xì)胞骨架、細(xì)胞周期以及細(xì)胞凋亡等[28-29]。在體內(nèi)c-Abl結(jié)構(gòu)中存在SH3-SH2-激酶結(jié)構(gòu)域的發(fā)卡結(jié)構(gòu)，該發(fā)卡結(jié)構(gòu)通過氨基酸殘基(由豆蔻酸修飾)與激酶結(jié)構(gòu)域中疏水性口袋結(jié)合，從而使c-Abl被抑制[30-31]。然而在受到外界壓力或DNA損傷時(shí)，位于SH2結(jié)構(gòu)域與激酶結(jié)構(gòu)域連接處的245位點(diǎn)被磷酸化，激活c-Abl[32]。近年來，在多種腫瘤疾病之中均發(fā)現(xiàn)有激活狀態(tài)的c-Abl[32-35]。而在神經(jīng)退行性疾病中，活性氧可以調(diào)節(jié)c-Abl的活性，介導(dǎo)細(xì)胞死亡。c-Abl是否也參與到OGD誘導(dǎo)的oli-neu凋亡過程尚不清楚。本研究的結(jié)果顯示，在OGD處理第6小時(shí)時(shí)oli-neu內(nèi)c-Abl被顯著激活，經(jīng)ABL001預(yù)處理，再經(jīng)OGD處理6 h后，oli-neu細(xì)胞凋亡率降低，提示c-Abl與OGD誘導(dǎo)的oli-neu細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。絲裂原激活蛋白激酶(MAPK)在響應(yīng)外界壓力刺激中非常重要。在真核細(xì)胞中，有幾條平行的MAPK信號通路以響應(yīng)不同的刺激，其中p38MAPKs主要由炎癥因子和外界壓力激活，在多個(gè)生理過程中發(fā)揮重要作用。在先前研究中，c-Abl在MPTP誘導(dǎo)的帕金森模型中被激活，激活的c-Abl直接磷酸化p38并介導(dǎo)多巴胺神經(jīng)元凋亡[17]。本研究通過ABL001抑制了OGD誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)c-Abl磷酸化的同時(shí)，也抑制了p38的磷酸化，提示c-Abl-p38信號通路也參與了OGD誘導(dǎo)的oli-neu的凋亡。

由于原代細(xì)胞在研究分子機(jī)制中具有不可替代的作用，并且其在體外的發(fā)生發(fā)展與體內(nèi)更加相近。因此，本研究對原代培養(yǎng)的OLs進(jìn)行OGD處理，以驗(yàn)證c-Abl-p38信號通路是否也介導(dǎo)了原代OLs的凋亡。結(jié)果顯示，OLs經(jīng)過ABL001預(yù)處理，再經(jīng)OGD處理6 h后，c-Abl激酶活性被抑制，同時(shí)p38的磷酸化水平也下降，提示在原代OLs的OGD模型中也存在c-Abl-p38信號通路的激活。然而p38下游底物眾多，介導(dǎo)不同的生物學(xué)功能。在OGD誘導(dǎo)的原代神經(jīng)元凋亡中，p38抑制劑SB203580通過抑制p38的磷酸化發(fā)揮抗凋亡作用[36]。研究發(fā)現(xiàn)，在星形膠質(zhì)細(xì)胞OGD/復(fù)氧(OGD/R)導(dǎo)致的細(xì)胞水腫中，通過抑制p38的激活降低了水通道蛋白4(AQP4)的表達(dá)，從而減輕了細(xì)胞的水腫[37]。人趨化因子CX3CL1和其受體CX3CR1介導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞激活，通過p38MAPK/PKC信號通路在缺血性腦損傷中發(fā)揮負(fù)面作用[38]。然而在本研究中，p38如何介導(dǎo)其下游的底物參與OGD誘導(dǎo)的OLs凋亡尚不清楚，有待進(jìn)一步深入探討。

總之，本研究結(jié)果顯示c-Abl參與了OGD誘導(dǎo)的oli-neu和OLs凋亡過程，而c-Abl抑制劑可以減輕細(xì)胞凋亡，其促進(jìn)凋亡的機(jī)制可能是通過c-Abl-p38通路介導(dǎo)的。c-Abl有望成為WMIL新的治療靶點(diǎn),并為慢性WMIL的防治提供新的思路。但是c-Abl在體內(nèi)如何發(fā)揮作用還有待深入探究。