張雅妮 白曉飛 韋超

(1 青島大學(xué)，山東 青島 266071； 2 山東第一醫(yī)科大學(xué)(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院)山東省眼科研究所；3 山東第一醫(yī)科大學(xué)(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院)山東省眼科研究所，山東省眼科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室-省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地)

晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)是由蛋白質(zhì)、脂質(zhì)以及核酸的游離氨基與還原糖的羰基發(fā)生糖基化反應(yīng)所形成[1]。正常條件下，AGEs在體內(nèi)的累積與年齡呈正相關(guān)[2]。糖尿病可導(dǎo)致AGEs在體內(nèi)各組織內(nèi)呈病理性蓄積，是引起糖尿病并發(fā)癥的重要原因之一[3-4]。目前，在糖尿病大鼠的角膜上皮、基質(zhì)以及內(nèi)皮層細(xì)胞均檢測(cè)到AGEs的沉積，而且AGEs的沉積與糖尿病角膜病變引起的上皮愈合延遲有關(guān)[5-6]。樹(shù)突狀細(xì)胞(DCs)作為一種強(qiáng)有效的抗原遞呈細(xì)胞，在控制炎癥反應(yīng)、促進(jìn)免疫耐受、募集免疫細(xì)胞和產(chǎn)生抗病毒細(xì)胞因子等生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用[7]。在正常角膜基質(zhì)及上皮層中均發(fā)現(xiàn)有DCs，呈角膜外周密集而角膜中央稀疏分布[8]。研究發(fā)現(xiàn)，DCs損耗可以延遲角膜上皮傷口愈合以及角膜神經(jīng)的再生[9]。Toll樣受體4(TLR4)作為T(mén)LRs家族的成員，可上調(diào)炎性因子和干擾素的表達(dá)，引起炎癥和免疫反應(yīng)[10-11]。已有相關(guān)研究顯示，TLR4信號(hào)通路參與了糖尿病引起的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，而TLR4抑制劑瑞沙托維(TAK-242)可有效逆轉(zhuǎn)糖尿病引起的活性氧產(chǎn)生和核因子κB(NF-κB)活性[12-13]。然而，糖尿病條件下過(guò)度堆積的AGEs能否通過(guò)調(diào)控TLR4信號(hào)通路活化DCs尚不清楚。本研究旨在通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究探討AGEs對(duì)糖尿病小鼠角膜中DCs活化功能的影響及相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料和設(shè)備

SPF級(jí)雄性C57BL/6小鼠36只，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司，4～6周齡。1640培養(yǎng)基(美國(guó)HyClone公司)，白細(xì)胞介素4(IL-4)、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)(美國(guó)PEPROTECH公司)，TAK-242(美國(guó)MedChemExpress公司)，SYBR Green qPCR試劑盒(南京諾唯贊生物科技股份有限公司)，AGE-BSA、雙抗夾心ELISA試劑盒(美國(guó)Abcam公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.11型糖尿病小鼠模型的建立 選用6周齡小鼠，隨機(jī)分為正常對(duì)照組(A組)12只和1型糖尿病組(B組)18只。A組小鼠連續(xù)5 d腹腔注射0.1 mL檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，B組小鼠連續(xù)5 d腹腔注射鏈脲佐菌素60 mg/kg。3個(gè)月后當(dāng)小鼠血糖值>16.7 mmol/L，即為1型糖尿病小鼠建模成功。A、B組小鼠各6只，斷頸處死后取下眼球，剪下角膜，用于后續(xù)的Western Blot實(shí)驗(yàn)。其他小鼠用于后續(xù)角膜上皮損傷模型構(gòu)建。

1.2.2體外誘導(dǎo)小鼠骨髓源樹(shù)突狀細(xì)胞(BMDCs)4周齡正常小鼠6只，斷頸處死后分離股骨和脛骨，用1640培養(yǎng)基沖洗骨髓腔至其變白。制備為單細(xì)胞懸液后，加入紅細(xì)胞裂解液靜置3 min，離心棄上清液，PBS重懸2次以后。加入含10 μg/L IL-4和20 μg/L GM-CSF的1640培養(yǎng)基，重懸后接種。置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2的恒溫箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)3 d后更換為含有IL-4和GM-CSF(濃度同前)的1640培養(yǎng)基。培養(yǎng)6 d后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3小鼠BMDCs分組及處理 將培養(yǎng)6 d的BMDCs按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)隨機(jī)分為C、D、E、F、G、H組。C、F組為空白對(duì)照組，于1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h；D組為牛血清白蛋白(BSA)組，于含有200 mg/L BSA的1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h；E、G組為AGE-BSA組，于含200 mg/L AGE-BSA的1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h；H組為T(mén)AK-242組，使用5 μmol/L TAK-242預(yù)處理1 h后，加入同G組的培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h，然后進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.4酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)各組細(xì)胞上清液內(nèi)干擾素-β(IFN-β)蛋白的濃度 分別收集C、D、E、F、G、H組小鼠BMDCs上清液，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，檢測(cè)各組細(xì)胞上清液中IFN-β蛋白的濃度。

1.2.5Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組小鼠的角膜內(nèi)AGEs及各組細(xì)胞內(nèi)p-IRF3、p-p65蛋白的表達(dá)水平 向A、B組角膜以及C、D、E、F、G、H組BMDCs內(nèi)加入裂解液(含體積分?jǐn)?shù)0.01磷酸酶抑制劑和體積分?jǐn)?shù)0.01蛋白酶抑制劑)冰上裂解30 min，收集裂解液并超聲破碎，隨后離心吸取上清液，分別獲得角膜組織與細(xì)胞總蛋白，利用BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。將20 μg蛋白樣品上樣至含體積分?jǐn)?shù)0.10 SDS-PAGE凝膠中，電泳、轉(zhuǎn)膜；用含體積分?jǐn)?shù)0.05 BSA室溫封閉1 h，再分別加入一抗AGEs、干擾素調(diào)節(jié)因子3(IRF3)、磷酸化IRF3(p-IRF3)、p65以及p-p65，4 ℃孵育過(guò)夜，次日加入1∶5 000的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育2 h；以蛋白印跡成像系統(tǒng)進(jìn)行顯影。以GAPDH/β-actin作為對(duì)照，使用Image Lab軟件分析條帶灰度值。

1.2.6實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測(cè)各組細(xì)胞炎性因子的表達(dá) 小鼠BMDCs按步驟1.2.2培養(yǎng)6 d后，按步驟1.2.3分為C、D、E、F、G、H組，6組細(xì)胞采用艾德萊試劑盒提取細(xì)胞內(nèi)總RNA。然后根據(jù)諾唯贊反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)，在RNA內(nèi)加入4×gDNA wiper Mix，42 ℃作用2 min；隨后加入5×HiScript Ⅲ qRT SuperMix，37 ℃作用15 min；繼以85 ℃作用5 s，然后反轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)SYBR Green嵌合熒光法進(jìn)行qPCR，以GAPDH作為內(nèi)參照。引物由美國(guó)Invitrogen公司設(shè)計(jì)并合成，引物序列見(jiàn)表1。采用2-△△CT方法計(jì)算各組BMDGs內(nèi)IFN-β、CXC基序趨化因子10(CXCL10)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)和白細(xì)胞介素-12p35(IL-12p35) mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

表1 小鼠關(guān)鍵基因引物核苷酸序列

1.2.7小鼠角膜上皮損傷模型構(gòu)建及分組與處理將18只6周齡小鼠隨機(jī)分為I、J、K組，每組6只。I組在按照A組小鼠處理的基礎(chǔ)上于結(jié)膜下注射溶劑(體積分?jǐn)?shù)0.01二甲基亞砜+體積分?jǐn)?shù)0.99 PBS)；J組在按照B組小鼠處理的基礎(chǔ)上于結(jié)膜下注射溶劑(同I組)；K組小鼠在按照B組小鼠處理的基礎(chǔ)上于結(jié)膜下注射0.375 g/L TAK-242，TAK-242溶于溶劑內(nèi)(同I組)。所有小鼠腹腔注射麻醉藥全身麻醉后置于操作臺(tái)上，以無(wú)齒鑷固定眼球，用直徑2.5 mm的環(huán)鉆輕壓中央角膜上皮層，輕輕旋轉(zhuǎn)環(huán)鉆在上皮層留下壓痕，不損傷角膜基質(zhì)層，用上皮刮刀將壓痕范圍內(nèi)的角膜上皮組織刮除，致角膜上皮組織損傷。將熒光素鈉染液滴在小鼠眼球表面，于刮除后0、24和40 h在裂隙燈下觀察小鼠角膜上皮修復(fù)情況并拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 兩組小鼠角膜內(nèi)AGEs表達(dá)比較

Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，與A組小鼠相比，B組小鼠角膜組織中AGEs蛋白的水平顯著增高。見(jiàn)圖1。

A、B分別對(duì)應(yīng)A、B組圖1 兩組小鼠角膜組織AGEs蛋白表達(dá)情況

2.2 各組小鼠BMDCs活化情況比較

ELISA結(jié)果顯示，C、D、E組BMDCs上清液內(nèi)IFN-β蛋白的表達(dá)量比較差異具有顯著意義(F=176.52，P<0.05)，E組BMDCs上清液中IFN-β表達(dá)量顯著高于C、D組(t=13.51、14.95，P<0.05)。見(jiàn)表2。RT-qPCR分析顯示，3組小鼠BMDCs內(nèi)IFN-β、CXCL10、IL-6和IL-12p35 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較差異具有顯著意義(F=46.98～4 251.15，P<0.05)，E組細(xì)胞內(nèi)IFN-β、CXCL10、IL-6以及IL-12p35 mRNA的相對(duì)表達(dá)量均顯著高于C、D組(P<0.05)。見(jiàn)表2。Western Blot結(jié)果顯示，E組TLR4通路下游關(guān)鍵蛋白p-IRF3和p-p65的表達(dá)量較C、D組明顯增加。見(jiàn)圖2。

表2 3組小鼠BMDCs中炎性因子表達(dá)水平的比較

C、D、E分別為C、D、E組圖2 3組小鼠BMDCs中IRF3、p-IRF3、p65和p-p65蛋白的表達(dá)水平

2.3 TAK-242干預(yù)后各組小鼠BMDCs活化情況比較

ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，F(xiàn)、G、H組BMDCs上清液內(nèi)IFN-β蛋白表達(dá)量比較差異具有顯著性(F=23.01，P<0.05)，其中G組細(xì)胞上清液中IFN-β蛋白的表達(dá)量顯著高于F組(t=34.90，P<0.05)，H組細(xì)胞上清液中IFN-β蛋白的表達(dá)量顯著低于G組(t=34.97，P<0.05)。見(jiàn)表3。RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，3組小鼠BMDCs內(nèi)IFN-β、CXCL10、IL-6和IL-12p35 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較差異具有顯著性(F=44.64～1 257.10，P<0.05)，其中G組細(xì)胞內(nèi)IFN-β、CXCL10、IL-6和IL-12p35 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著高于F組(P<0.05)，H組低于G組(P<0.05)。見(jiàn)表3。Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，H組TLR4通路下游相關(guān)蛋白p-IRF3和p-p65表達(dá)水平較G組明顯降低。見(jiàn)圖3。

表3 3組小鼠BMDCs中炎性因子表達(dá)水平的比較

2.4 TAK-242對(duì)糖尿病小鼠角膜上皮損傷修復(fù)的影響

組別、時(shí)間及其交互作用均對(duì)小鼠角膜上皮損傷面積具有明顯影響(F組別=19.94，F(xiàn)時(shí)間=446.68，F(xiàn)交互=9.96，P<0.05)。單獨(dú)效應(yīng)結(jié)果顯示，在24、40 h，3組小鼠角膜上皮損傷面積比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=5.85、4.89，P<0.05)，其中J組角膜上皮損傷面積顯著高于I組(P<0.05)，K組低于J組(P<0.05)。3組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)角膜上皮損傷面積比較差異有顯著性(F=8.97～16.69，P<0.05)，其中，24 h上皮損傷面積均小于0 h(P<0.05)，40 h上皮損傷面積均小于24 h(P<0.05)。見(jiàn)圖4、表4。

表4 各組小鼠角膜上皮刮除后上皮損傷面積比較

F、G、H分別為F、G、H組圖3 3組小鼠BMDCs中IRF3、p-IRF3、p65和p-p65蛋白的表達(dá)水平

3 討 論

AGEs作為一類(lèi)復(fù)雜的非酶促蛋白質(zhì)翻譯后修飾產(chǎn)物，參與了糖尿病角膜病變、糖尿病腎病、糖尿病足及糖尿病視網(wǎng)膜病變等多種糖尿病并發(fā)癥的發(fā)病過(guò)程[5,14-16]。AGEs在角膜上皮基底膜的沉積可影響上皮細(xì)胞與基底膜的黏附，進(jìn)而引發(fā)糖尿病角膜上皮的改變，是引起糖尿病角膜病變的重要機(jī)制之一[17]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)顯示，糖尿病小鼠角膜表達(dá)AGEs蛋白較正常小鼠明顯增多，進(jìn)一步證實(shí)了AGEs在糖尿病角膜病變中異常沉積。

I、J、K分別對(duì)應(yīng)I、J、K組圖4 各組小鼠角膜上皮刮除后熒光素鈉染色結(jié)果

近年來(lái)，LEPPIN等[18]發(fā)現(xiàn)DCs在糖尿病及其并發(fā)癥的致病過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵性作用，糖尿病角膜病變中角膜DCs的增加可能與神經(jīng)纖維減少存在關(guān)聯(lián)。研究表明，DCs可以通過(guò)模式識(shí)別受體(例如Toll樣受體)識(shí)別外來(lái)物從而起到了保護(hù)角膜的作用[19]。TLR4作為T(mén)oll樣受體家族成員，已被證實(shí)參與了糖尿病的發(fā)病過(guò)程[20]。TLR4信號(hào)通路主要通過(guò)MyD88/NF-κB和TRIF/IRF3兩條途徑，引起下游信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)以及誘發(fā)慢性炎癥反應(yīng)，該炎癥反應(yīng)是糖尿病角膜病變發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素之一[21-22]。TLR4/TRIF/IRF3途徑主要參與Ⅰ型干擾素的表達(dá)[23]。糖尿病通過(guò)活化TLR4/NF-κB加劇氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)，進(jìn)而參與到糖尿病并發(fā)癥的發(fā)病過(guò)程中[24-25]?；诮悄?nèi)DCs數(shù)量少且難分離，本研究通過(guò)體外原代培養(yǎng)BMDCs模型后發(fā)現(xiàn)，AGE-BSA可引起B(yǎng)MDCs內(nèi)p-p65和p-IRF3蛋白表達(dá)增加，這表明AGE-BSA可能通過(guò)影響TLR4/NF-κB和TLR4/IRF3兩條途徑來(lái)調(diào)控BMDCs的活化，進(jìn)一步上調(diào)下游炎性相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)(包括IFN-β、CXCL10、IL-6和IL-12p35)，進(jìn)而參與到糖尿病角膜病變的慢性炎癥反應(yīng)中。TAK-242作為一種選擇性TLR4抑制劑，可直接結(jié)合在TLR4胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域中抑制其活化[26]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TAK-242干預(yù)后，BMDCs內(nèi)p-p65和p-IRF3蛋白的表達(dá)均降低，且通路下游的炎性相關(guān)細(xì)胞因子水平亦顯著下調(diào)，提示阻斷TLR4信號(hào)通路可以抑制AGE-BSA對(duì)于BMDCs的活化作用，進(jìn)一步表明AGE-BSA可能通過(guò)TLR4信號(hào)通路調(diào)控BMDCs的活化。

糖尿病患者在遭受眼部創(chuàng)傷或手術(shù)后易發(fā)生淺表點(diǎn)狀角膜炎、復(fù)發(fā)性角膜糜爛及持續(xù)性上皮缺損等癥狀[27]。糖尿病角膜病變引起的病理改變包括AGEs的沉積、角膜上皮基底膜成分的改變、角膜神經(jīng)的損傷以及氧化應(yīng)激等[28]。AGEs的累積可觸發(fā)細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激及慢性炎癥等病理過(guò)程，進(jìn)一步加重糖尿病患者角膜的病變[29-30]?；诖耍狙芯恐荚谔接慣LR4信號(hào)通路在糖尿病角膜上皮損傷修復(fù)過(guò)程中的作用。熒光素鈉染色結(jié)果顯示，在角膜上皮刮除后24、40 h，糖尿病小鼠角膜上皮愈合較正常小鼠延遲，與之前報(bào)道的結(jié)果一致[31]。而糖尿病小鼠結(jié)膜下注射TAK-242干預(yù)后，上皮修復(fù)速度較糖尿病對(duì)照小鼠加快，說(shuō)明TLR4信號(hào)通路可能參與了糖尿病角膜上皮損傷修復(fù)延遲的病理過(guò)程。

綜上所述，本研究證實(shí)糖尿病小鼠角膜內(nèi)存在AGEs過(guò)表達(dá)，AGE-BSA可能通過(guò)調(diào)控TLR4信號(hào)通路來(lái)促進(jìn)BMDCs分泌炎性相關(guān)細(xì)胞因子，TLR4信號(hào)通路可能參與了糖尿病小鼠角膜上皮損傷修復(fù)延遲愈合的過(guò)程。本研究不足在于角膜內(nèi)DCs含量比較少，在動(dòng)物水平驗(yàn)證其功能變化存在一定困難，僅能通過(guò)其對(duì)角膜上皮愈合的影響間接驗(yàn)證，后續(xù)研究將對(duì)此不足進(jìn)一步完善。本研究結(jié)果為揭示TLR4信號(hào)通路在糖尿病角膜病變防治中的作用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。