魯振環(huán)，張濤，朱曉峰，曾德強(qiáng)

（廣東省韶關(guān)市粵北人民醫(yī)院 胃腸外科，廣東 韶關(guān) 512025）

0 引言

結(jié)直腸癌是臨床常見惡性腫瘤，流行病學(xué)調(diào)查顯示其發(fā)病率和死亡率居惡性腫瘤第四位，且其發(fā)病有年輕化趨勢(shì)[1]。結(jié)直腸癌的早期診斷是改善患者預(yù)后的關(guān)鍵，游離DNA是由單鏈和雙鏈DNA組成的無細(xì)胞形態(tài)的DNA，既往有報(bào)道顯示腫瘤微轉(zhuǎn)移灶和細(xì)胞裂解可增加游離DNA表達(dá)量[2-3]，推測(cè)游離DNA可能參與結(jié)直腸癌變過程，本研究回顧性分析醫(yī)院60例接受血清循環(huán)游離DNA（circulating free DNA，cfDNA）檢測(cè)患者的臨床資料，探討cfDNA與結(jié)直腸癌病理特點(diǎn)的關(guān)系，為結(jié)直腸癌的早期診斷提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料。本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，采用簡(jiǎn)單隨機(jī)抽樣法選取醫(yī)院2018年9月至2019年9月60例接受cfDNA檢測(cè)的患者作為研究對(duì)象，對(duì)其臨床資料進(jìn)行回顧性分析。其中30例經(jīng)病理活檢確診為結(jié)直腸癌[4]，為觀察組，其中男18例，女12例；年齡（49.62±9.05）歲；體重指數(shù)（20.79±2.31）kg/m2。另30例為結(jié)腸息肉患者，為對(duì)照組，其中男21例，女9例；年齡（47.91±8.65）歲；體重指數(shù)（20.55±2.08）kg/m2。兩組患者性別、年齡、體重指數(shù)等基本資料無顯著性差異（P＞0.05），具有可比性。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑和方法。在患者入院后24 h內(nèi)空腹采集肘靜脈血5 mL，3000 r/min離心10 min，留取血清于EP管內(nèi)，-700C凍存?zhèn)溆?。選用Qiagen公司生產(chǎn)的DNA提取試劑盒，游離DNA提取方法參照試劑盒說明進(jìn)行。利用 Invitrogen 公司生產(chǎn)的 Sybr Green 定量 PCR 預(yù)混液進(jìn)行。利用分子生物學(xué)軟件DNAStar對(duì)GenBank中登錄的PPIA基因序列進(jìn)行分析，再用PrimerSelect軟件在基因保守區(qū)域設(shè)計(jì)檢測(cè)引物，并對(duì)引物進(jìn)行二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)等分析，篩選出2對(duì)引物，序列分別為PPIA-116F：AAG AAG TGA CTG CTC ATC TA，PPIA-116R：AAG CAC TGC TGCACG ATC A；PPIA-132F：ACA TGG GTA CTA AGC AAC AAA ATA AG；PPIA-132R：CAC AAT TGG AAC ATC TTT GTT AAA C，合成PPIA基因片段。25 ul總反應(yīng)體系中包含 12.5ul 2 X預(yù)混反應(yīng)液，正反向引物（10uM）各 1ul，DNA 5ul，雙蒸水5.5 ul，反應(yīng)條件為95°10 min，40個(gè)循環(huán)的95°15 s-60度1 min，在60°收集熒光信號(hào)，采用熒光定量PCR儀測(cè)量Ct值，利用滅菌純水提取質(zhì)粒DNA，稀釋后取5個(gè)梯度標(biāo)準(zhǔn)品，以熒光定量PCR作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)公式計(jì)算樣本中cfDNA濃度。cfDNA濃度=標(biāo)準(zhǔn)曲線確定樣品拷貝數(shù)/反應(yīng)中血漿體積。

1.3 觀察指標(biāo)。比較不同性別、年齡、體重指數(shù)、腫瘤分類、分期及腫瘤直徑患者cfDNA濃度。采用受試者工作曲線（receiver operating characteristic，ROC）分析cfDNA濃度判斷結(jié)直腸癌的價(jià)值，結(jié)果以曲線下面積（area under the curve，AUC）表示，以AUC＞0.75為應(yīng)用價(jià)值高。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法。選用SPSS 22.0軟件包處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩兩比較行t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以百分比表示，兩兩比較行χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組cfDNA濃度比較。觀察組患者cfDNA濃度為（413.16±104.43）ng/ mL，對(duì)照組為（276.33±97.46）ng/mL，兩組cfDNA濃度比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.247，P=0.001）。

2.2 不同特征結(jié)直腸癌患者cfDNA濃度比較。不同腫瘤直徑患者cfDNA濃度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），不同性別、年齡、體重指數(shù)、腫瘤分類及分期的結(jié)直腸癌患者cfDNA濃度比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）.見表1。

表1 不同特征結(jié)直腸癌患者cfDNA濃度比較

2.3 cfDNA濃度判斷結(jié)直腸癌的價(jià)值分析。以cfDNA濃度為檢驗(yàn)變量，以是否為結(jié)直腸癌為狀態(tài)變量，繪制ROC曲線。見圖1，結(jié)果顯示其AUC為0.759（S.E.=0.062，95%CL=0.638-0.881，P=0.001）。靈敏度為0.867，特異度為0.567，最佳截?cái)嘀禐?73.50 ng/mL。

圖1 cfDNA濃度判斷結(jié)直腸癌的ROC分析

3 討論

結(jié)直腸癌的早期診斷對(duì)提高臨床治療效果和改善患者預(yù)后具有重要意義，而腫瘤標(biāo)記物作為非損傷性實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)，被公認(rèn)為是結(jié)直腸癌早期篩查的重要依據(jù)[5]。近年來有學(xué)者發(fā)現(xiàn)外周血血清中存在來源于腫瘤細(xì)胞微轉(zhuǎn)移灶的特異性DNA[6]，這可能有助于結(jié)直腸癌的早期診斷。本研究發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸良惡性患者間cfDNA水平差異顯著，提示cfDNA濃度可作為診斷結(jié)直腸癌的依據(jù)之一，Rui Zhang等[7]還認(rèn)為血清cfDNA濃度與結(jié)腸早期病變程度具有顯著相關(guān)性。而分子實(shí)驗(yàn)則發(fā)現(xiàn)隨著腫瘤進(jìn)展，腫瘤細(xì)胞被巨噬細(xì)胞吞噬，使cfDNA濃度逐漸增加[8-10]。因而，cfDNA濃度檢測(cè)有望成為早期診斷結(jié)直腸癌的無創(chuàng)指標(biāo)。

本研究還發(fā)現(xiàn)不同腫瘤直徑患者cfDNA濃度差異顯著，這可能是因隨著腫瘤生長(zhǎng)，更多的cfDNA被釋放入血所致。Barault L等還認(rèn)為cfDNA濃度與腫瘤負(fù)荷相關(guān)，也說明cfDNA參與腫瘤增殖生長(zhǎng)。本研究采用ROC分析顯示cfDNA判斷結(jié)直腸癌的AUC為0.759，提示cfDNA有助于結(jié)直腸癌的早期診斷。另外，李禹龍等報(bào)道還發(fā)現(xiàn)不同cfDNA濃度患者總生存期差異顯著，提示監(jiān)測(cè)cfDNA濃度有助于預(yù)后判斷，cfDNA濃度可能與結(jié)直腸癌的惡性程度相關(guān)，但其具體原因還有待進(jìn)一步研究。本研究隨訪時(shí)間較短，未行不同cfDNA濃度患者預(yù)后比較，這有待今后延長(zhǎng)隨訪時(shí)間觀察。

綜上所述，不同結(jié)直腸癌腫瘤直徑患者cfDNA濃度差異顯著，檢測(cè)cfDNA濃度有助于結(jié)直腸癌的早期診斷。