汪云吉,劉麗婭,佟立濤,李言,錢海峰,周素梅,王立*

1(江南大學(xué) 食品學(xué)院,江蘇 無(wú)錫,214122)2(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,北京,100193)

蕓豆,學(xué)名菜豆(PhaseolusvulgarisLinn.sp),屬豆科(Leguminosae)菜豆屬(Phaseolus),是一年生草本植物的籽粒[1]。我國(guó)蕓豆種植面積在世界范圍內(nèi)排名第三[2],年總產(chǎn)量約8～9 萬(wàn)t,主要分布在黑、蒙、冀、晉、甘、新、川、滇、黔等地[3]。蕓豆中蛋白質(zhì)含量為17.91%～22.03%,脂肪含量為2.56%～8.46%,總糖含量4.50%～5.42%[4],并且含有豐富的維生素與礦物質(zhì)[5]。

1945年,BOWMAN[6]首次在蕓豆中發(fā)現(xiàn)α-淀粉酶抑制劑(α-amylase inhibitor,α-AI),α-AI是一種糖蛋白[7],可與淀粉酶形成復(fù)合物,從而有效抑制其活性[8],阻礙碳水化合物水解與消化,進(jìn)而降低血糖水平[9],可作為降糖控糖食品的原料。蕓豆α-AI純品提取過(guò)程復(fù)雜、周期長(zhǎng)、成本高[10],其水提物提取簡(jiǎn)單,對(duì)α-淀粉酶也具有較強(qiáng)的抑制效果,但其中存在凝集素[9],會(huì)促使紅細(xì)胞凝集,引起小腸表面絨毛細(xì)胞病變,影響消化吸收,進(jìn)而對(duì)機(jī)體免疫功能造成損害[11]。目前常用降低凝集素活力的方法有熱處理[12]、超高壓處理[13]、輻照處理[12]以及調(diào)控pH[14]等。其中超高壓與輻照處理成本較高,且無(wú)法完全去除；而熱處理及調(diào)控pH在去除凝集素活力的同時(shí),也將蕓豆α-AI活力完全去除[15],無(wú)法在保留提取物α-淀粉酶抑制活力的同時(shí)去除凝集活力。

針對(duì)目前存在的問(wèn)題,本研究計(jì)劃通過(guò)在控制pH與溫度等條件時(shí),同時(shí)添加蛋白酶,在最大程度保留提取物α-淀粉酶抑制活力并去除凝集活力。以花蕓豆為原料,α-淀粉酶抑制率與凝集活力為指標(biāo),在篩選出最佳用酶的基礎(chǔ)上,優(yōu)化提取物的制備工藝。另外,研究了提取物對(duì)日常主食估計(jì)血糖生成指數(shù)(estimated glycemic index,eGI)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花蕓豆由國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系食用豆體系提供；面包、米飯、白饅頭及玉米饅頭,當(dāng)?shù)爻校?%兔血紅細(xì)胞,上海源葉生物科技有限公司；3,5-二硝基水楊酸(3,5-dinitrosalicylic acid,DNS)、菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶、酸性蛋白酶,北京索萊寶生物有限公司；中性蛋白酶、堿性蛋白酶,日本天野酶制品株式會(huì)社；α-淀粉酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶,美國(guó)Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

CT410旋風(fēng)式樣品磨,福斯賽諾分析儀器(蘇州)有限公司;SP-Max 2300A光吸收型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀,上海閃譜生物科技有限公司；LUX-24數(shù)顯恒溫水浴鍋,北京陸?？萍加邢薰?；LXJ-ⅡB低速大容量多管離心機(jī),上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 花蕓豆粗提物的制備與工藝優(yōu)化

將經(jīng)旋風(fēng)磨磨粉,過(guò)60目篩后的花蕓豆粉與去離子水以料液比1∶5(g∶mL)的比例混合,室溫下攪拌提取2 h,8 000 r/min離心30 min,收集上清液,隨后分別加入菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶,根據(jù)各蛋白酶最適條件反應(yīng)1 h,以α-淀粉酶抑制活力與凝集活力為指標(biāo)確定最佳酶。

以凝集活力與α-淀粉酶抑制率為指標(biāo),進(jìn)行時(shí)間(30、60、90、120、150 min)、pH(2、2.5、3、3.5、4)、溫度(30、40、50、60、70 ℃)和酶底比(500、1 000、1 500、2 000、2 500 U/g)單因素試驗(yàn),因?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)主要目的是制得無(wú)凝集活力的花蕓豆提取物,因此在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,以去除凝集活力為主要目的,兼顧α-淀粉酶抑制率進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)。

1.3.2 α-淀粉酶抑制率測(cè)定

α-淀粉酶抑制率的測(cè)定參考YANG等[16]的方法稍作修改。將0.25 mL豬胰α-淀粉酶溶液(1.5 U/mL)和0.25 mL適當(dāng)稀釋的蕓豆提取液在37 ℃水浴中孵育10 min,加入10 g/L可溶性淀粉0.25 mL,準(zhǔn)確反應(yīng)5 min后立刻加入1.0 mL DNS溶液終止反應(yīng)。將混合物置于沸水浴中10 min,隨后在冰浴中冷卻至室溫,用5 mL去離子水稀釋后在540 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

1.3.3 凝集活力測(cè)定

凝集活力的測(cè)定參考HE等[17]的方法稍作修改。在96孔“V”型板的每1孔中加入50 μL 磷酸緩沖鹽溶液(10 mmol/L,pH 7.4),在第1孔加入提取液,混勻后取出50 μL加入第2孔,混勻,以此類推,倍比稀釋,第12孔取出50 μL溶液棄去,最后在各孔中加入2%兔血紅細(xì)胞50 μL,4 ℃條件下靜置2 h后觀察血凝結(jié)果。凝集活力按公式(1)計(jì)算：

(1)

式中：n,96孔“V”型板中顯示血凝的最高孔數(shù),n=0表示無(wú)凝集活力;ρ,樣品蛋白質(zhì)量濃度,mg/mL,V,添加到每孔的樣品體積,mL。

1.3.4 總淀粉含量測(cè)定

采用Megazyme assays Kit(K-TSTA)試劑盒法測(cè)定。

1.3.5 蛋白濃度的測(cè)定

采用LORRY法[18],以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。

1.3.6 模擬胃腸道處理對(duì)提取物α-淀粉酶抑制率的影響

模擬胃腸處理主要參考讓一峰等[19]的方法稍作修改。將經(jīng)過(guò)處理后的提取物于37 ℃金屬浴中振搖,用1 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH至2并加入胃蛋白酶來(lái)模擬胃環(huán)境,用1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至8.2并加入胰蛋白酶來(lái)模擬腸環(huán)境。各反應(yīng)120 min后回調(diào)溫度與pH,測(cè)定其對(duì)α-淀粉酶的抑制率。

1.3.7 血糖生成指數(shù)的測(cè)定

按照FERRER-MAIRAL等[20]的方法測(cè)定血糖生成指數(shù),并做了適當(dāng)修改。準(zhǔn)確稱取樣品(含淀粉50 mg),添加花蕓豆提取物,添加α-淀粉酶,于37 ℃金屬浴中振搖2 min,調(diào)節(jié)pH至2,加入胃蛋白酶,37 ℃金屬浴中振搖60 min,中和調(diào)節(jié)pH,加入α-淀粉酶與胰蛋白酶,在0、10、20、30、60、90、120、180、240 min處取樣,沸水浴5 min滅酶活性后離心,取上清液進(jìn)行葡萄糖含量測(cè)定。參考GOI等[21]的方法建立非線性模型,淀粉水解動(dòng)力學(xué)按公式(2)計(jì)算：

C=C∞×(1-(exp-kt))

(2)

式中:C,C∞,k分別表示各時(shí)間點(diǎn)的淀粉水解率、最終水解率和動(dòng)力學(xué)常數(shù)。水解指數(shù)(HI)為樣品的水解曲線的面積與葡萄糖相應(yīng)面積的百分比。估計(jì)血糖生成指數(shù)按公式(3)[22]計(jì)算：

eGI=0.862×HI+8.198

(3)

1.3.8 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。使用SPSS 21.0軟件進(jìn)行顯著性分析,使用Origin 2018進(jìn)行做圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同蛋白酶對(duì)蕓豆提取物α-淀粉酶抑制活力和凝集活力的影響

不同蛋白酶處理結(jié)果見表1。在α-淀粉酶抑制活力方面,菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶與中性蛋白酶對(duì)提取物抑制活力無(wú)顯著影響(P>0.05),且凝集活力保留超過(guò)95%；堿性蛋白酶處理后,提取物抑制率保留率為80.30%,凝集活力保留超過(guò)90%；酸性蛋白酶處理效果較好,提取物α-淀粉酶抑制率保留率為85.89%,推測(cè)活力降低的主要原因是酸性環(huán)境與溫度的協(xié)同作用[15],凝集活力降低至6.97%,原因可能是酸性蛋白酶在酶解凝集素的同時(shí),pH對(duì)溫度誘導(dǎo)的凝集素的失活也具有協(xié)同效應(yīng)[23]。因此,選擇酸性蛋白酶進(jìn)行后續(xù)研究。

表1 不同蛋白酶對(duì)花蕓豆提取物α-淀粉酶抑制活力與凝集活力的影響

2.2 花蕓豆α-淀粉酶抑制提取物制備工藝優(yōu)化

2.2.1 pH的影響

在溫度50 ℃、時(shí)間60 min、加酶量1 000 U/g條件下,研究了pH對(duì)花蕓豆粗提液α-淀粉酶抑制活力與凝集活力的影響,結(jié)果以相對(duì)活力表示。如圖1所示,在α-淀粉酶抑制活力方面,隨著pH在2～4范圍內(nèi)升高,提取物α-淀粉酶抑制活力呈現(xiàn)出先下降后升高的趨勢(shì),在pH 3.5時(shí)抑制活力保留率最低為87.53%,此時(shí)凝集活力保留11.65%。在pH 3條件下,凝集活力保留率最低僅為5.76%,這可能是因?yàn)樗崤c熱的協(xié)同作用會(huì)使粗提物中凝集素活力顯著降低[23],同時(shí)pH變化過(guò)程中酸性蛋白酶活力也發(fā)生改變[24]。綜合考慮,選擇處理pH值為3。

圖1 pH對(duì)花蕓豆提取物α-淀粉酶抑制活力與凝集活力的影響

2.2.2 溫度的影響

由圖2可知,在加酶量1 000 U/g、時(shí)間60 min、pH 3條件下,隨著溫度的升高,花蕓豆提取物對(duì)α-淀粉酶的抑制活力與凝集活力均呈現(xiàn)降低趨勢(shì)。當(dāng)溫度為30 ℃,提取物抑制活力與凝集活力保留率約為90%。溫度升高至40 ℃,抑制活力變化不顯著,凝集活力保留率降低至86.06%。溫度>50 ℃時(shí),抑制活力隨著溫度的升高顯著降低(P<0.05),這是因?yàn)槭|豆α-AI熱穩(wěn)定性較低,隨著溫度的升高,活力降低[7]。當(dāng)溫度達(dá)到70 ℃時(shí),抑制活力保留81.87%。此時(shí)凝集活力保留率僅為0.16%。綜合考慮,選擇溫度為70 ℃。

圖2 溫度對(duì)花蕓豆提取物α-淀粉酶抑制活力與凝集活力的影響

2.2.3 時(shí)間的影響

在加酶量1 000 U/g、溫度50 ℃、pH 3條件下,處理時(shí)間對(duì)花蕓豆提取液α-淀粉酶抑制活力與凝集活力的影響如圖3所示。在60 min內(nèi),隨著處理時(shí)間的增加,提取液對(duì)α-淀粉酶的抑制活力呈現(xiàn)降低的趨勢(shì),當(dāng)時(shí)間>60 min時(shí),抑制活力不再變化,保留率約為87.22%,此時(shí)凝集活力也趨于穩(wěn)定,不再隨著時(shí)間的增加而變化,保留率約為5.51%。綜合考慮,處理時(shí)間選擇60 min。

圖3 時(shí)間對(duì)花蕓豆提取物α-淀粉酶抑制活力與凝集活力的影響

2.2.4 加酶量的影響

在溫度50 ℃、時(shí)間60 min、pH 3條件下,加酶量對(duì)花蕓豆提取液α-淀粉酶抑制活力與凝集活力的影響如圖4所示。隨著加酶量由500 U/g增加到1 000 U/g,花蕓豆提取物相對(duì)抑制活力與相對(duì)凝集活力均顯著降低,分別從95.62%和42.18%降低至87.22%和5.31%,隨著加酶量的進(jìn)一步增加,相對(duì)抑制活力與相對(duì)凝集活力均不再變化,這是因?yàn)楫?dāng)?shù)孜锓肿优c酶分子百分之百結(jié)合的時(shí)候,再增加酶的用量也不會(huì)對(duì)反應(yīng)造成顯著影響[25]。綜合考慮,選擇加酶量為1 000 U/g。

圖4 加酶量對(duì)花蕓豆提取物α-淀粉酶抑制活力與凝集活力的影響

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果,以相對(duì)凝集活力為指標(biāo),進(jìn)行正交試驗(yàn),結(jié)果如表2所示?？梢缘贸鋈コ盍Φ淖罴褩l件為A1B3C3D2,即pH 2.5、溫度70 ℃、時(shí)間90 min、加酶量1 000 U/g。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)此時(shí)血凝板中未出現(xiàn)血凝現(xiàn)象(n=0),即相對(duì)凝集活力為0%,表明正交試驗(yàn)結(jié)果可靠。各影響因素主次順序?yàn)闇囟?加酶量>時(shí)間>pH。凝集素對(duì)人體有害,將其去除是花蕓豆提取物應(yīng)用于食品工業(yè)的前提,所以選擇A1B3C3D2方法,此時(shí)相對(duì)抑制率為75.38%,相對(duì)凝集活力為0%。方差分析結(jié)果表明(表3),各因素對(duì)粗提物凝集活力影響顯著。

表3 方差分析結(jié)果

2.4 模擬胃腸道對(duì)提取物α-淀粉酶抑制率的影響

無(wú)凝集活力花蕓豆提取物分別經(jīng)體外胃、腸環(huán)境模擬后,α-淀粉酶抑制率的變化如圖5所示,在模擬胃液處理后,抑制率顯著降低,從63.15%降低至55.18%,這說(shuō)明提取物對(duì)胃蛋白酶的水解具有一定的抵抗力,仍能保持一定的α-淀粉酶抑制率[26]。模擬腸液處理后,提取物對(duì)α-淀粉酶的抑制率變化不顯著,與讓一峰等[19]的研究結(jié)果相符。提取物先后經(jīng)體外胃環(huán)境模擬和體外腸環(huán)境模擬后,仍具有53.53%抑制率?？偠灾?花蕓豆提取物在體外模擬胃、腸環(huán)境后仍對(duì)α-淀粉酶具有抑制效果,較為穩(wěn)定。

A-未經(jīng)過(guò)模擬腸胃處理；B-模擬胃液處理；C-模擬腸液處理；D-模擬胃腸處理

2.5 花蕓豆提取物添加量對(duì)日常主食eGI的影響

日常主食淀粉水解度如圖6所示,淀粉水解度隨著水解時(shí)間的增加而增加,然后趨于平衡。面包淀粉水解平衡的時(shí)間為120 min,米飯、白饅頭和玉米饅頭則為180 min。添加了1%～3%的花蕓豆提取物后,米飯、白饅頭和玉米饅頭淀粉水解平衡的時(shí)間降低至120 min,同時(shí)隨著花蕓豆提取物添加量的增加,淀粉水解度顯著降低,在添加3%提取物后,面包、米飯、白饅頭與玉米饅頭的水解度分別從77.79%、84.58%、84.91%和77.90%降低至30.48%、40.98%、19.08%和15.12%。說(shuō)明花蕓豆提取物能夠有效抑制不同淀粉的水解。

a-面包；b-米飯；c-白饅頭；d-玉米饅頭

不同提取物添加量對(duì)主食eGI的影響如表4所示,面包、米飯、白饅頭與玉米饅頭的eGI值分別為65.00、71.65、68.17和63.41,其中米飯屬于高GI食品,面包、白饅頭與玉米饅頭屬于中GI食品,隨著花蕓豆提取物的添加,4種主食eGI值都得到顯著降低,且隨著添加量的增加,eGI值進(jìn)一步降低,當(dāng)添加量為3%時(shí),面包、米飯、白饅頭與玉米饅頭的eGI值分別降低至30.69、39.51、22.30和19.69,屬于低GI食品。說(shuō)明花蕓豆提取物可應(yīng)用于低GI食品中生產(chǎn)中,添加提取物的食品會(huì)降低餐后葡萄糖的升高,有益于糖尿病,肥胖癥等疾病患者[27]。

表4 不同提取物添加量主食的估計(jì)血糖生成指數(shù)

3 結(jié)論

花蕓豆粗提物具有較強(qiáng)的α-淀粉酶抑制活力與凝集活力,比較了菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶與堿性蛋白酶處理對(duì)粗提物α-淀粉酶抑制活力與凝集活力的影響,最終選擇酸性蛋白酶制備無(wú)凝集活力花蕓豆提取物。正交試驗(yàn)結(jié)果表明,溫度70 ℃,pH 2.5,處理時(shí)間90 min,加酶量1 000 U/g條件下,花蕓豆粗提物的凝集活力被完全去除的同時(shí)α-淀粉酶的抑制活力保留75.38%。對(duì)花蕓豆粗提物凝集活力影響最大的因素是溫度。體外模擬胃環(huán)境后,花蕓豆提取物α-淀粉酶抑制活力顯著降低,體外模擬腸環(huán)境則無(wú)顯著影響?；ㄊ|豆提取物的添加會(huì)顯著降低面包、米飯、白饅頭與玉米饅頭的eGI值,且隨著添加量的增加進(jìn)一步降低。