劉暢,馬現(xiàn)永,馬三梅*,鄧盾*

1(暨南大學(xué) 生物工程學(xué)系,廣東 廣州,510632) 2(廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物科學(xué)研究所 畜禽育種國家重點實驗室 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華南動物營養(yǎng)與飼料重點實驗室 廣東省畜禽育種與營養(yǎng)研究重點實驗室 廣東畜禽肉品質(zhì)量安全控制與評定工程技術(shù)研究中心,廣東 廣州,510640)

黃曲霉毒素(aflatoxin,AFT)是一類致毒性超強的真菌毒素,主要是由黃曲霉(Aspergillusflavus)和寄生曲霉(Aspergillusparaciticus)產(chǎn)生[1]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了20多種黃曲霉毒素,根據(jù)其結(jié)構(gòu)的不同可以大致分為2類：AFB和AFG[2]。其中黃曲霉毒素B1(Alfatoxin B1,AFB1)分布最廣泛,毒性也最強。畜禽食用含有AFB1的飼料會引起肝臟損傷、免疫力下降甚至死亡；人長期食用被AFB1污染的農(nóng)產(chǎn)品會引起嘔吐、發(fā)育遲緩并誘發(fā)肝癌[3]。肝臟既是代謝AFB1的主要場所,同時也是AFB1損傷的主要器官,其損傷過程是由CYP450酶系、線粒體、免疫系統(tǒng)和自由基等機制介導(dǎo)的復(fù)雜轉(zhuǎn)化過程[4]。鑒于AFB1的毒性,如何避免AFB1感染和進行AFB1脫毒,對于食品安全至關(guān)重要。

黃曲霉毒素降解的方法一般有物理法[5-6]、化學(xué)法[7-8]和生物降解法。物理法和化學(xué)法會使原料中營養(yǎng)成分流失,還可能產(chǎn)生新的有害物質(zhì)[9]。生物降解法主要是利用微生物產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物或酶將有毒基團分解,具有專一性強、效率高等優(yōu)點[10]。細菌和真菌中都存在著可以降解AFB1的微生物[11],可降解AFB1的細菌主要有渾濁紅球菌(Rhodococcusopacus)[12-13]、橙紅色粘球菌(Myxococcusfulvus)[9]、食醚紅球菌(Rhodococcusaetherivorans)[14]、枯草芽胞桿菌(Bacillussubtills)[15]、施氏假單胞菌(Pseudomonasstutzeri)[16-17]等,真菌主要有寄生曲霉(Aspergillusparasiticus)、白腐菌(Trametesversicolor)和假蜜環(huán)菌(Armillariellatabescens)等[10]。但是關(guān)于微生物降解AFB1的相關(guān)酶的報道卻不多。研究表明,在降解AFB1中起作用的酶包括乳過氧化氫酶[18]、漆酶[3]和黃曲霉毒素氧化酶[19]等。但是目前仍缺乏能夠?qū)嶋H應(yīng)用的微生物酶,有關(guān)黃曲霉解毒酶的開發(fā)工作仍需要進一步加強。多銅氧化酶具有來源廣泛、易于獲取、底物譜廣泛、對環(huán)境非常友好等優(yōu)點[20-21]。因此,多銅氧化酶在工業(yè)上有著廣泛的應(yīng)用前景,是一類開發(fā)潛力較強的霉菌毒素脫毒劑[22-23]。

本文從乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici7_4)基因組中篩選到一種多酮氧化酶,通過基因工程的手段重組到大腸桿菌中進行誘導(dǎo)表達,得到重組的大腸桿菌。將重組大腸桿菌的多銅氧化酶純化,研究其對AFB1的降解能力以及酶學(xué)性質(zhì),進一步探究重組多銅氧化酶的降解潛力,為后續(xù)深入研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑

AFB1標準品,上海佰曄生物科技中心;乙酰丁香酮(acetosyringone,AS)、丁香醛(syringaldehyde,SA)、阿魏酸(ferulic acid,FA)、1-羥基苯并三唑(1-hydroxybenzotriazole,HBT)、酚紅(phenol red,PhR)、2,2′,6,6′-四甲基呱啶氧化物(2,2′,6,6′-tetramethyl-piperidine-N-oxyl,TEMPO)、2,2′-聯(lián)氨-雙-(3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸)二氨鹽(2,2′-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid),ABTS),生工生物工程(上海),色譜級乙腈、色譜級甲醇,上海阿拉丁試劑有限公司

1.2 AFB1的檢測

向反應(yīng)后的樣品中加入5 mLV(乙腈)∶V(水)=84∶16的混合液,再加入1 mL正己烷,用旋渦振蕩器充分混勻,靜置60 min,取下層溶液經(jīng)0.22 μm聚偏氟乙烯濾膜過濾后進樣。使用高效液相色譜-光化學(xué)反應(yīng)器-熒光檢測器(high performance liquid chromatography-Photoelectric reactor-Fluorescence detector,HPLC-PHR-FLD)的方法對AFB1進行檢測。色譜條件：色譜柱為X-BridgeTMC18(4.6 mm×250 mm,5 μm),進樣量20 μL,流動相為V(甲醇)∶V(水)∶V(乙腈)=35∶55∶10,流速1 mL/min,柱溫30oC,熒光激發(fā)光波長360 nm,發(fā)射光波長440 nm[24]。

1.3 酶活力測定

將1 min 轉(zhuǎn)化1 pmol AFB1所需的酶量定義為1個酶活力單位(U)。酶降解AFBl的活性采用U/mg的形式表示。

1.4 試驗方法

1.4.1 基因克隆及載體構(gòu)建

P.acidilactici7_4基因組信息已公布在NCBI上(NZ_ACXB00000000),其基因組中多酮氧化酶D2EK17編碼的基因NZ_GG730086.1由安徽通用系統(tǒng)生物有限公司合成,基因兩端添加EcoRI和XhoI酶切位點,將載體和基因片段分別用EcoRI和XhoI酶切,T4連接酶連接后轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細胞,冰浴30 min,在42 ℃水浴鍋熱激90 s,冰浴2 min后加入500 μL LB液體培養(yǎng)基37 ℃,200 r/min培養(yǎng)1 h。培養(yǎng)物離心后涂布在含有50 μL/mL的卡那霉素 LB 平板,培養(yǎng)16 h左右后挑選單菌落,經(jīng)酶切和測序驗證無誤后,將構(gòu)建好的pET-28a(+)-CueO轉(zhuǎn)入到BL21(DE3)感受態(tài)細胞中。

1.4.2 重組CueO表達與純化

將含有pET-28a(+)-CueO轉(zhuǎn)入到BL21(DE3)的單菌落加入含有0.1 mg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中,37 ℃,170 r/min搖床培養(yǎng)24 h?；罨木阂?%的接種量培養(yǎng)至OD600為0.6左右,加異丙基硫代半乳糖苷(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)使其濃度為0.5 mmol/L,同時加入250 mmol/L的無菌硫酸銅溶液,使其終濃度為0.25 mmol/L,16 ℃,150 r/min,培養(yǎng)18～20 h。菌液4 ℃,4 000 r/min,離心10 min,收集菌體。100 mL菌體用25 mL(50 mmol/L,pH 7.2)磷酸緩沖液(phosphate buffer solution,PBS)重懸菌體,冰水浴超聲破碎15 min,4 ℃,10 000 r/min離心10 min,收集上清液。上清液通過鎳柱結(jié)合后,用30 mmol/L的咪唑洗脫雜蛋白,最后用300 mmol/L咪唑洗脫目的蛋白。使用購自生工生物工程公司的C500090脫鹽柱進行脫鹽,具體方法參照說明書。純化脫鹽后的蛋白用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel-electrophoresis,SDS-PAGE)鑒定分子質(zhì)量和純度。

1.4.3 酶學(xué)性質(zhì)分析

1.4.3.1 不同介體對重組CueO降解AFB1的影響

反應(yīng)在一個20 mL無菌玻璃瓶中進行,反應(yīng)體系為1 mL,包括：20 μL 5 μg/mL的AFB1標準液,380 μL 純化后的酶液(含純酶193.04 μg,下同),濃度為100 mmol/L的不同介體100 μL,生理鹽水500 μL。反應(yīng)體系在37 ℃下避光靜置反應(yīng)12 h。每個處理3個重復(fù),以不加入酶的反應(yīng)體系作為對照。反應(yīng)結(jié)束后用1.2小節(jié)的萃取回收方法處理,使用HPLC-PHR-FLD測定AFB1含量。

1.4.3.2 重組CueO降解AFB1的最適溫度和熱穩(wěn)定性

最適溫度：反應(yīng)在一個20 mL無菌玻璃瓶進行,反應(yīng)體系為1 mL,包括：20 μL 5 μg/mL的AFB1標準液,380 μL 純化后的酶液,100 μL 100 mmol/L的SA溶液100 μL,500 μL 生理鹽水。反應(yīng)體系在4、30、37、50、60、70、80 ℃下避光靜置反應(yīng)12 h,每個處理3個重復(fù),以不加入酶的反應(yīng)體系作為對照。反應(yīng)結(jié)束后用1.2小節(jié)的萃取回收方法處理,使用HPLC-PHR-FLD測定AFB1含量。

熱穩(wěn)定性：將酶液分別放置在不同溫度(4、30、37、50、60、70、80 ℃)下處理2 h,12 000 r/min,離心5 min,取上清液。反應(yīng)在一個20 mL無菌玻璃瓶中進行,反應(yīng)體系為1 mL,包括：20 μL 5 μg/mL的AFB1標準液,380 μL 處理后的酶液,100 μL 100 mmol/L的SA溶液,生理鹽水500 μL。反應(yīng)體系在37oC下避光靜置反應(yīng)12 h。每個處理3個重復(fù),以不加入酶的反應(yīng)體系作為對照。反應(yīng)結(jié)束后用1.2小節(jié)的萃取回收方法處理,使用HPLC-PHR-FLD測定AFB1含量。

1.4.3.3 重組CueO降解AFB1的最適pH

反應(yīng)在一個20 mL無菌玻璃瓶中進行,反應(yīng)體系為1 mL,包括：20 μL 5 μg/mL的AFB1標準液,380 μL 純化后的酶液,100 μL 100 mmol/L的SA溶液,500 μL 緩沖液(pH值為4.0～10.0)。反應(yīng)體系在37 ℃下避光靜置反應(yīng)12 h,每個處理3個重復(fù),以不加入酶的反應(yīng)體系作為對照。反應(yīng)結(jié)束后用1.2小節(jié)的萃取回收方法處理,用HPLC-PHR-FLD測定AFB1含量。

1.5 Km與Vmax的測定

選用不同質(zhì)量濃度的AFB1(50、100、200、400、800、1 000、2 000 ng/mL)作為底物,在最適溫度與最適pH條件下反應(yīng)24 h,通過公式(1)[25]計算出反應(yīng)速率[pmol/(min·mg)],使用米氏方程獲得Km和Vmax值[26]。

(1)

1.6 降解產(chǎn)物的毒性分析

降解產(chǎn)物毒性分析實驗設(shè)置3個處理,分別是未反應(yīng)的AFB1、CueO降解后的AFB1以及SA介體對照(含有SA和AFB1)。反應(yīng)在一個250 mL無菌錐形瓶中進行,反應(yīng)體系為50 mL,包括：500 μL 1 mg/mL的AFB1標準液,44.5 mL 純化后的酶液,5 mL 100 mmol/L的SA溶液。反應(yīng)體系在37 ℃下避光靜置反應(yīng)12 h。未反應(yīng)的AFB1處理組和SA介體對照組中用pH 7.0的磷酸緩沖液代替酶液,反應(yīng)結(jié)束后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮樣品,DMSO回收AFB1用于下一步實驗,每個處理做3個重復(fù)。

取處于生長對數(shù)期的LO2肝細胞,消化后用1640培養(yǎng)液吹勻成單細胞懸液。細胞計數(shù)后,以5×104cell/mL的密度種進96孔板中,每孔加入100 μL。5% CO2,37 ℃隔夜貼壁陪養(yǎng)后,加入100 μL降解產(chǎn)物處理液。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后每孔加入20 μL 5 mg/mL的3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide,MTT),繼續(xù)培養(yǎng)4 h。吸掉上清液后每孔加入200 μL DMSO,置搖床振勻后,測量各孔在570 nm處的吸光值[27]。

2 結(jié)果與討論

2.1 序列分析

CueO的開放閱讀框由1 434個堿基構(gòu)成,對應(yīng)477個氨基酸殘基。通過SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)同源建模法預(yù)測蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu),根據(jù)可信度(GMQE)選擇合適的模板。其中可信度最高的模板是2yxw.1(GMQE為0.61)。3zx1.1的GMQE為0.53,6iqx.1的GMQE為0.58。根據(jù)模板可推測,CueO氨基酸序列含有細菌多銅氧化酶的保守序列HXHG,HXH,HXXHXH和HCHXLXHEDXXM(紅色下劃線部分),符合多銅氧化酶序列特征。

圖1 CueO氨基酸序列多序列比對結(jié)果

2.2 蛋白表達純化

CueO蛋白的理論分子質(zhì)量為54.36 kD,pI為5.42。經(jīng)過SDS-PAGE檢測(圖2),重組蛋白可以在上清液中表達。使用30 mmol/L咪唑洗脫雜蛋白,300 mmol/L咪唑洗脫目的蛋白,純化的純度較好。重組蛋白分子質(zhì)量大小約60 kDa左右,比CueO理論分子量稍大,原因是pET-28a(+)載體上N端序列和CueO融合表達,加上這部分氨基酸殘基的分子質(zhì)量和電泳結(jié)果一致。以上結(jié)果說明CueO可以在大腸桿菌中實現(xiàn)可溶性表達。

1-Ni-NTA純化后的CueO;2-IPTG誘導(dǎo)后E.coli BL21(DE)3,pET28(a)-CueO可溶蛋白;3-IPTG誘導(dǎo)后E.coli BL21(DE)3,pET28(a)-CueO不可溶蛋白;4-IPTG誘導(dǎo)后E.coli BL21(DE)3,pET28(a)-CueO全細胞;5-Marker;6-E.coli BL21(DE)3,pET28(a)-CueO未誘導(dǎo)

2.3 重組CueO對AFB1的降解性質(zhì)

2.3.1 不同介體對重組CueO降解AFB1的影響

常見介體主要分為2大類,即天然介體(natural mediators)和合成介體(synthetic mediators)[7]。實驗比較了7種不同介體對重組CueO酶降解AFB1活性的影響。AS、SA、FA屬于天然介體；ABTS、HBT、PhR和TEMPO為合成介體。由圖3可知,介體本身對AFB1會有一些降解作用,但不同的介體催化AFB1的反應(yīng)能力不同,其中SA最強。當加入重組CueO酶時,“CueO-介體”催化AFB1降解的能力均顯著提高,SA作為介體時,相對降解率最高,達到96.89%。

圖3 不同介體對AFB1降解率的影響

AS次之,相對降解率達到76.52%,HBT和ABTS效果較差。因此CueO最佳的反應(yīng)介體是SA。

漆酶催化氧化還原反應(yīng),對底物具有一定選擇性,只有氧化還原勢能低于漆酶的物質(zhì),且能夠進入活性中心的物質(zhì)才能直接被漆酶氧化[28]。而高于漆酶氧化還原勢能的底物,需要有介體參與才能被氧化[29]。由于漆酶CueO不能和AFB1直接反應(yīng),漆酶-介體-底物的反應(yīng)是否能夠進行,取決于介體是否能夠進入到活性中心以及介體的氧化還原勢能。CueO-SA具有較強的AFB1降解能力可能和上述原因相關(guān)。

2.3.2 重組CueO降解AFB1的最適溫度和熱穩(wěn)定性

不同溫度條件下,重組CueO降解AFB1的結(jié)果如圖4所示。重組CueO在37 ℃下相對降解率最高,隨著溫度的升高呈現(xiàn)先升高再降低的趨勢。從4 ℃到37 ℃,溫度越高,AFB1相對降解率越高,降解效果越好。當溫度超過37 ℃時,降解率開始急劇下降。由此可見重組CueO降解AFB1的最適反應(yīng)溫度為37 ℃。

圖4 溫度對AFB1降解率的影響

該重組CueO酶在4 ℃處理后,相對降解率最高。50 ℃處理后,酶對AFB1的相對降解率下降了26.89%；在80 ℃時,酶失去活性。因此該酶在低于70 ℃時,具有一定的熱穩(wěn)定性。

2.3.3 重組CueO降解AFB1的最適pH

在不同pH緩沖液處理下,降解AFB1結(jié)果如圖5所示。重組CueO在pH 4.0～6.0,隨著pH值的升高,AFB1的降解率呈現(xiàn)下降趨勢。當pH為7.0時,重組CueO降解AFB1效果最好。pH值超過7.0之后,隨著pH值的升高,AFB1降解率反而降低。因此,重組CueO降解AFB1的最適pH為7.0。

圖5 不同pH條件對AFB1降解率的影響

在上述優(yōu)化的條件下,以SA為介體檢測了重組酶CueO降解AFB1的能力,結(jié)果如圖6所示,AFB1的出峰時間在11.45 min左右,隨著反應(yīng)時間的延長峰面積不斷減少,12 h后對100 ng/mL AFB1的降解率可達64.8%。

圖6 重組CueO酶降解AFB1的HPLC結(jié)果

2.3.4 底物濃度對重組CueO降解AFB1酶活力的影響

比較了從0～0.006 4 μmol/L濃度下重組CueO降解AFB1的酶活變化。在起始階段,隨著底物濃度的增加,重組CueO的酶活力不斷增加,但到0.003 2 μmol/L(1 000 ng/mL)時酶活力達到最大值,為7.895 U/mg,之后再增加底物濃度,其降解AFB1活性不再增加。

圖7 底物濃度對重組CueO降解AFB1酶活的影響

2.4 Km與Vmax的測定

利用GraphPad Prism5.0計算重組CueO的Km與Vmax,通過Michaelis-Menten做圖,計算出Km=1.99×10-3μmol,Vmax=11.31 pmol/(min·mg)。

2.5 降解產(chǎn)物的毒性分析

通過MTT實驗,得到了不同質(zhì)量濃度AFB1對人肝細胞LO2存活率的影響,0～0.5 μg/mL AFB1對肝細胞LO2存活率影響不大。當AFB1質(zhì)量濃度達到10 μg/mL時,細胞存活率下降到51.29%。因此實驗選用10 μg/mL作為AFB1的處理質(zhì)量濃度。

將未處理的AFB1、回收的降解產(chǎn)物以及SA對照(含有介體和AFB1)加入到肝細胞中混合培養(yǎng),以比較三者的細胞毒性差異,結(jié)果如圖8所示。與未降解的AFB1相比,CueO脫毒產(chǎn)物對細胞毒性明顯降低,細胞存活率上升了24.86%；同時,未降解的AFB1組與SA對照組對肝細胞的毒性影響差異不顯著。這些結(jié)果說明了重組酶CueO不僅可以有效的降解AFB1,而且降解產(chǎn)物對細胞的毒性明顯減少。

圖8 降解產(chǎn)物對肝細胞LO2存活率的影響

3 結(jié)論

本文首次研究了乳酸菌多酮氧化酶對AFB1的降解效果,發(fā)現(xiàn)Pediococcusacidilactici7_4中多銅氧化酶CueO基因可在大腸桿菌中成功表達出可溶性蛋白,純化獲得的重組多銅氧化酶CueO對AFB1有降解作用。重組CueO最佳介體為SA,最適溫度為37 ℃,最適pH為7.0。通過Michaelis-Menten法計算得Km=1.99×10-3μmol,Vmax=11.31 pmol/(min·mg),表明其對AFB1的親和力較強。細胞毒性實驗表明,重組CueO可以有效降解AFB1,并且降解產(chǎn)物對細胞毒性降低,具有進一步的研究和開發(fā)價值。