魏亞楠,王金曉,林良才,陳博超,崔丹瑤,張翠英*

1(工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室(天津科技大學),天津,300457) 2(天津科技大學 生物工程學院,天津,300457)

白酒中的酯類物質(zhì)是提供香氣的主要風味物質(zhì),約占白酒風味物質(zhì)的75%～95%[1]。酯類含量過高時,酒體會產(chǎn)生臭味;酯類含量過低時則會使酒體品質(zhì)降低,味道淡。只有適宜的酯含量才能協(xié)調(diào)白酒風味[2-5]。白酒中的酯類物質(zhì)包括中鏈脂肪酸乙酯和乙酸酯,乙酸酯又包括乙酸乙酯、乙酸異戊酯等[6]。乙酸乙酯的香氣類似蘋果香、香蕉香,和己酸乙酯、乳酸乙酯以及丁酸乙酯并稱為四大酯[7],是清香型和米香型白酒的主體香氣,是清香型白酒中含量最高的酯類物質(zhì),在濃香型、醬香型和米香型等白酒中也起著不可替代的作用[8],乙酸乙酯也是唯一一種被國家白酒標準明確規(guī)定的風味物質(zhì)[9]。乙酸異戊酯的香氣類似蘋果香[10],是決定白酒香氣和品格的關(guān)鍵成分,由于乙酸異戊酯的香味閾值極低,僅為0.23 mg/L[11],因此乙酸異戊酯的含量過高會破壞白酒香氣平衡,控制乙酸異戊酯含量對提升白酒的品質(zhì)有重要意義。白酒發(fā)酵過程中,乙酸酯主要由釀酒酵母中的醇乙?；D(zhuǎn)移酶以及其他酯合成酶生物催化合成的。由此可見,釀酒酵母是乙酸酯合成的關(guān)鍵影響因素,對白酒發(fā)酵中風味物質(zhì)的合成有很大的影響。因此,選育具有優(yōu)良產(chǎn)香性狀的釀酒酵母菌株對白酒釀造行業(yè)具有重要的應用意義[12]。

研究表明,ATF1編碼的醇乙?；D(zhuǎn)移酶可以催化釀酒酵母中乙酸乙酯和乙酸異戊酯的生成[13]。VERSTREPEN等[14]發(fā)現(xiàn)啤酒酵母中ATF1的缺失導致乙酸乙酯和乙酸異戊酯的質(zhì)量濃度分別降低了40%和16%,而過表達ATF1會使得乙酸乙酯和乙酸異戊酯的的質(zhì)量濃度顯著上調(diào),分別提高了30.9倍和183倍。LILLY等[15]研究發(fā)現(xiàn),葡萄酒酵母中ATF1基因過表達可提升乙酸乙酯的質(zhì)量濃度3～10倍和乙酸異戊酯的質(zhì)量濃度4～12倍。相反的,IAH1基因編碼的乙酸異戊酯水解酶可以催化釀酒酵母中乙酸酯的水解。FUKUDA等[16]發(fā)現(xiàn),IAH1過表達可以提升乙酸異戊酯水解活性2倍多。LILLY等[17]發(fā)現(xiàn)IAH1基因的過表達會導致乙酸乙酯、乙酸己酯和乙酸苯乙酯等酯類的質(zhì)量濃度顯著下降。綜上所述,IAH1基因編碼的乙酸異戊酯水解酶與醇乙酰基轉(zhuǎn)移酶共同調(diào)控著乙酸乙酯和乙酸異戊酯的平衡[13,18]。

實驗室前期在AY12的單倍體a45菌株基礎上敲除了BAT2同時過表達了ATF1,構(gòu)建了低產(chǎn)高級醇高產(chǎn)乙酸酯菌株a45-AWT[19],其以玉米濃醪為原料模擬白酒發(fā)酵產(chǎn)生的乙酸異戊酯的質(zhì)量濃度過高,不符合高品質(zhì)白酒的要求。因此,本文通過調(diào)節(jié)IAH1基因的表達量,改善風味物質(zhì)比例,以獲得高產(chǎn)乙酸乙酯、適量高產(chǎn)乙酸異戊酯、低產(chǎn)高級醇的釀酒酵母菌株,便于工業(yè)運用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 質(zhì)粒、菌株及培養(yǎng)基

研究所用的菌株和質(zhì)粒見表1。

表1 本實驗研究所用的菌株和質(zhì)粒

YEPD培養(yǎng)基：葡萄糖2 g,蛋白胨2 g,酵母浸粉1 g,加水定容至100 mL,115 ℃滅菌20 min。G418抗性YEPD培養(yǎng)基配制時每100 mL加入30 mg G418,Zeocin抗性YEPD培養(yǎng)基配制時每100 mL培養(yǎng)基加入50 mg Zeocin。固體培養(yǎng)基需額外添加2%瓊脂粉。

LB培養(yǎng)基：氯化鈉1 g,蛋白胨1 g,酵母浸粉0.5 g,121 ℃滅菌 20 min。LB(Ampr)培養(yǎng)基每100 mL添加10 mg氨芐青霉素。固體培養(yǎng)基需額外添加2%瓊脂粉。

營養(yǎng)鹽：無水硫酸鎂15 g,磷酸二氫鉀7.5 g,尿素8.1 g,加蒸餾水定容至100 mL,4 ℃保存。

1.1.2 主要試劑

DL5 000 DNA Marker、rTaqDNA聚合酶、dNTP、Yeast RNAiso Kit酵母Total RNA提取試劑盒,寶生物中國大連公司；酵母浸粉(生化試劑),天津泰進科技有限公司；葡萄糖(分析純)、氯化鈉(分析純),天津索羅門生物科技有限公司；胰蛋白胨,天津市英博生化試劑有限公司；瓊脂糖、PEG3350,北京索萊寶公司；G418,BBI公司；甘油,鼎國昌盛公司；醋酸鋰,天津市化學試劑一廠。

1.1.3 主要儀器

YXQ-LS-30SII高壓蒸汽滅菌鍋,山東新華醫(yī)療器械廠；全自動凝膠成像儀,美國SYNGENE公司；GL20A型高速冷凍離心機,中科院生物物理所技術(shù)服務公司；PCT-200型PCR基因擴增儀,美國BIO-RAD公司；DYY-4c型電泳儀,北京市六一儀器廠；7890A氣相色譜儀,美國安捷倫科技公司；StepOnePlus熒光定量PCR儀,美國ABI公司；全自動生長曲線分析儀,芬蘭BIOSCREEN公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株的構(gòu)建

1.2.1.1 引物的設計與合成

本研究中用到的引物如表2所示。根據(jù)NCBI網(wǎng)站上查閱的S.cerevisiaeS288C的基因序列,利用Primer 5.0軟件設計PCR反應引物。

表2 研究中的主要引物

1.2.1.2 突變株的構(gòu)建

a45-AWT菌株剔除抗性基因KanMX。在a45-AWT菌株基礎上進行過表達IAH1基因需要KanMX基因再次作為篩選標記,需要將a45-AWT菌株KanMX基因刪除。利用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法[20]將含有Cre重組酶的質(zhì)粒pGAPza導入菌株a45-AWT,涂布于含有Zeocin抗性的YEPD平板上,在30 ℃下避光培養(yǎng)2 d；挑取轉(zhuǎn)化子于半乳糖培養(yǎng)基中,在30 ℃ 180 r/min條件下培養(yǎng)6 h,稀釋10-4后涂布于YEPD平板,在30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d；挑取轉(zhuǎn)化子,點接于YEPD平板和含有G418抗性的YEPD平板,在30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d；挑取在YEPD平板中正常生長且在含有G418抗性的YEPD平板不生長的菌落,提取轉(zhuǎn)化子基因組,作為模板,PCR擴增驗證pGAPZa質(zhì)粒導入成功且KanMX被剔除。將驗證正確的轉(zhuǎn)化子傳代培養(yǎng),10代后進行純化,驗證轉(zhuǎn)化子pGAPZa質(zhì)粒丟失,且KanMX被剔除。

a45-BAI菌株構(gòu)建,以親本菌株AY12的單倍體a45的基因組為模板,GA-F/GA-R、GB-F/GB-R和IAH1-F/IAH1-R為引物,PCR擴增得到上同源臂GA、下同源臂GB以及IAH1片段；以質(zhì)粒pUC-PABBK為模版,PGKp-F/PGKp-R和PGKt-KanMX-F/PGKt-KanMX-R為引物,PCR擴增得到PGKp和PGKt-KanMX片段,并將片段用PCR純化回收試劑盒進行純化回收,測序驗證。用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法將純化回收后的片段導入菌株a45-AWT-K,通過含有G418抗性的YEPD平板篩選轉(zhuǎn)化子,用酵母基因組DNA提取試劑盒提取轉(zhuǎn)化子的基因組進行PCR驗證。

a45ΔGal80菌株構(gòu)建,為了證明Gal80位點對菌株a45的生長性能和發(fā)酵性能無影響,構(gòu)建a45ΔGal80菌株。以AY12的單倍體a45基因組為模板,Gal80-GA-F/Gal80-GA-R和Gal80-GB-F/Gal80-GB-R為引物,擴增片段上同源臂GA和下同源臂GB,以質(zhì)粒PUG6為模板,G-KANA-F/G-KANA-R為引物,擴增片段loxp-KanMX-loxp。將片段用PCR純化回收試劑盒進行純化,測序驗證。用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法將純化回收后的片段導入菌株a45,通過含有G418抗性的YEPD平板篩選轉(zhuǎn)化子,用酵母基因組DNA提取試劑盒提取轉(zhuǎn)化子的基因組進行 PCR驗證。

a45ΔBAT2菌株構(gòu)建。為了明確BAT2和ATF1對乙酸酯和高級醇的不同作用,構(gòu)建a45ΔBAT2菌株。采用與構(gòu)建a45ΔGal80菌株同樣的方法構(gòu)建a45ΔBAT2。

1.2.2 玉米濃醪模擬白酒發(fā)酵實驗

1.2.2.1 一級二級種子液制備

(1)玉米水解液的制備

稱取玉米醪1 kg,向其中3 L加入60～70 ℃的自來水,靜置20 min,進行玉米醪的糊化,使玉米醪充分膨脹,然后加入600 μL的液化酶(α-淀粉酶2×104U/mL),85～90 ℃液化1.5 h,20 min攪拌1次,液化結(jié)束后,迅速冷卻降溫至60 ℃,加入2 mL糖化酶(10×104U/mL)糖化20 h,每隔一段時間進行攪拌。待糖化結(jié)束后,將糖化液用3層濾布過濾,得到滲出液即為玉米水解液,在105 ℃下高壓滅菌20 min,室溫保存使用。

(2)種子培養(yǎng)基的制備

一級種子培養(yǎng)基：8°Bix玉米水解液,0.5%的酵母浸粉。

二級種子培養(yǎng)基：12°Bix玉米水解液,0.5%的酵母浸粉。

1.2.2.2 玉米濃醪發(fā)酵培養(yǎng)基[21-23]制備

(1)稱取60 g玉米醪置于250 mL三角瓶,加入135 mL 60～70 ℃熱水并攪拌均勻,放置20 min。

(2)向其中加入30 μL的液化酶(α-淀粉酶 2×104U/mL)并攪拌均勻,90 ℃水浴90 min,液化。

(3)迅速冷卻至60 ℃,加入90 μL糖化酶(10×104U/mL)并攪拌均勻,60 ℃水浴20 min,糖化。

(4)迅速冷卻至40 ℃,加入1.2 mL酸性蛋白酶(2×104U/mL)并攪拌均勻,40 ℃水浴20 min。

(5)迅速冷卻至30 ℃,加入1 mL營養(yǎng)鹽溶液。

挑取一環(huán)斜面菌株接入裝有5 mL一級種子培養(yǎng)基的試管中,30 ℃靜置培養(yǎng)24 h；將上述菌液轉(zhuǎn)移至裝有54 mL二級種子培養(yǎng)基的150 mL三角瓶中,30 ℃靜置培養(yǎng)16 h至對數(shù)期后期；以10%接種量接入至玉米濃醪發(fā)酵培養(yǎng)基中,30 ℃靜置發(fā)酵,每隔12 h稱重；發(fā)酵至每12 h失重小于1 g,結(jié)束后測定發(fā)酵時間、CO2累積排放質(zhì)量、酒精度(體積分數(shù))、剩余還原糖質(zhì)量濃度和蒸餾后的酒樣高級醇及乙酸酯質(zhì)量濃度。

1.2.2.3 CO2排放質(zhì)量的測定

酵母在發(fā)酵過程中逐漸將葡萄糖轉(zhuǎn)化成乙醇和CO2,CO2排放質(zhì)量的變化間接表示了發(fā)酵反應的速度和進程,玉米濃醪三角瓶的重量變化等于CO2排放質(zhì)量[24]。

1.2.2.4 酒精度(體積分數(shù))的測定

將100 mL水和100 mL發(fā)酵液加入至1 L錐形瓶,搖晃均勻后放置于電爐上,將瓶口與冷凝管連接,開啟冷凝水,蒸餾發(fā)酵液。收集餾出液100 mL,測定溫度和酒精度,利用酒精校正表校正得到該酒樣在20 ℃時的酒精度(體積分數(shù))[24]。

1.2.2.5 剩余還原糖質(zhì)量濃度的測定

發(fā)酵液中剩余還原糖的質(zhì)量濃度采用斐林試劑法[25]檢測。

1.2.2.6 高級醇及乙酸酯質(zhì)量濃度的測定

本實驗采用氣相色譜儀對酒樣中的高級醇及乙酸酯質(zhì)量濃度進行測定[26]。

色譜條件：檢測器,FID；色譜柱,Agilent 1909 N-213(30 m×320 μm,0.5 μm)；載氣,氮氣；載氣流速2 mL/min；進樣口溫度200 ℃；檢測器溫度200 ℃；進樣量1 μL；柱溫50 ℃維持8 min,5 ℃/min升至120 ℃,維持5 min。

1.2.3 mRNA水平測定

采用實時熒光定量PCR(real-time PCR)法[27],以UBC6基因為內(nèi)參基因,檢測基因ATF1和IAH1的表達水平變化。

1.2.4 生長曲線的測定

為了檢測釀酒酵母的生長情況,采用全自動生長曲線測定儀30 ℃下測量OD600值[28]。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株的構(gòu)建

2.1.1 a45-AWT菌株剔除KanMX基因

在a45-AWT菌株基礎上進行基因編輯需要KanMX基因再次作為篩選標記,需要剔除KanMX基因,將該突變株命名為a45-AWT-K(圖1-a)。利用驗證引物KanMX-F/KanMX-R驗證,其片段長度為1 613 bp。為保證重組菌株的遺傳穩(wěn)定性,通過傳代丟失pGAPZa質(zhì)粒,利用驗證引物Zecio-F/Zecio-R驗證,其片段長度為1 200 bp,電泳結(jié)果說明第10代突變株pGAPZa質(zhì)粒成功丟失(圖1-b)。

a-菌株a45-AWT剔除KanMX的過程；b-菌株a45-AWT剔除KanMX的PCR驗證結(jié)果M-DL5 000 DNA marker；泳道 1-以KanMX-F/KanMX-R為引物,a45-AWT的基因組為模板PCR擴增的結(jié)果(1 613 bp)；泳道2-以KanMX-F/KanMX-R為引物,a45-AWT-K的基因組為模板PCR擴增的結(jié)果；泳道3-以Zecio-F/Zecio-R為引物,a45-AWT-K的第10代基因組為模板PCR擴增的結(jié)果(1 200 bp)；泳道 4-以Zecio-F/Zecio-R為引物,a45-AWT-K的第乙代的基因組為模板,PCR擴增的結(jié)果

2.1.2 a45-BAI菌株構(gòu)建和驗證

用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法將構(gòu)建a45-BAI菌株所需的片段純化回收后的片段導入菌株a45-AWT-K(圖2-a)。提取陰性對照AY12的單倍體a45基因組及G418抗性平板上長出來的轉(zhuǎn)化子的基因組,利用驗證引物YZ-IAH1-1-F/YZ-IAH1-1-R、YZ-IAH1-2-F/YZ-IAH1-2-R和YZ-IAH1-3-F/YZ-IAH1-3-R對構(gòu)建的轉(zhuǎn)化子進行定點驗證,其片段長度分別為2 145、1 564和2 129 bp,且陰性對照無條帶,驗證條帶與預期一致(圖2-b)。

a-菌株 a45-BAI的構(gòu)建過程；b-菌株 a45-BAI的PCR驗證結(jié)果M-DL5000 DNA marker；泳道1-以YZ-IAH1-1-F/YZ-IAH1-1-R為引物,a45的基因組為模板擴增得到的產(chǎn)物；泳道 2-以YZ-IAH1-1-F/YZ-IAH1-1-R為引物,a45-AWT的基因組為模板擴增得到的產(chǎn)物；泳道3-以YZ-IAH1-1-F/YZ-IAH1-1-R為引物,a45-AWT-K的基因組為模板擴增得到的產(chǎn)物；泳道4-以YZ-IAH1-1-F/YZ-IAH1-1-R為引物,a45-BAI的基因組為模板擴增得到的產(chǎn)物(2 145 bp)；泳道5-以YZ-IAH1-2-F/YZ-IAH1-2-R為引物,a45的基因組為模板擴增得到的產(chǎn)物；泳道 6-以YZ-IAH1-2-F/YZ-IAH1-2-R為引物,a45-AWT的基因組為模板擴增得到的產(chǎn)物(2 425 bp)；泳道7-以YZ-IAH1-2-F/YZ-IAH1-2-R為引物,a45-AWT-K的基因組為模板擴增得到的產(chǎn)物；泳道8-以YZ-IAH1-2-F/YZ-IAH1-2-R為引物,a45-BAI的基因組為模板擴增得到的產(chǎn)物(1 564 bp)；泳道9-以YZ-IAH1-3-F/YZ-IAH1-3-R為引物,a45的基因組為模板擴增得到的產(chǎn)物；泳道10-以YZ-IAH1-3-F/YZ-IAH1-3-R為引物,a45-AWT的基因組為模板擴增得到的產(chǎn)物；泳道11-以YZ-IAH1-3-F/YZ-IAH1-3-R為引物,a45-AWT-K的基因組為模板擴增得到的產(chǎn)物；泳道12-以YZ-IAH1-3-F/YZ-IAH1-3-R為引物,a45-BAI的基因組為模板擴增得到的產(chǎn)物(2 129 bp)

2.1.3 a45ΔGal80菌株和a45ΔBAT2菌株的構(gòu)建及驗證

用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法將構(gòu)建a45ΔGal80菌株所需的片段導入菌株a45(圖3-a)。提取陰性對照AY12的單倍體a45基因組及G418平板上的轉(zhuǎn)化子基因組,利用驗證引物GA-K-F/GA-K-R和GK-B-F/GK-B-R對構(gòu)建的轉(zhuǎn)化子進行定點驗證,其片段長度分別為1 260和1 309 bp,且陰性對照無條帶,驗證條帶與預期一致(圖3-b)。用同樣的方法構(gòu)建a45ΔBAT2菌株并驗證。

a-菌株a45ΔGal80的構(gòu)建過程；b-菌株a45ΔGal80的PCR驗證結(jié)果M-DL5000 DNA marker；泳道1-以 GA-K-F/GA-K-R 為引物,a45ΔGal80的基因組為模板擴增到的產(chǎn)物(1260 bp)；泳道2-以GA-K-F/GA-K-R為引物,a45的基因組為模板擴增得到的產(chǎn)物；泳道3-以GK-B-F/GK-B-R為引物,a45ΔGal80的基因組為模板擴增得到的產(chǎn)物(1 309 bp)；泳道4-以GK-B-F/GK-B-R為引物,a45的基因組為模板擴增得到的產(chǎn)物

2.2 突變株與親本菌株的發(fā)酵實驗

2.2.1 模擬白酒發(fā)酵的基本發(fā)酵性能

模擬白酒發(fā)酵條件檢測重組菌株的發(fā)酵性能以及風味物質(zhì),分別對發(fā)酵液中的CO2排放質(zhì)量、剩余還原糖的質(zhì)量濃度和酒精度(體積分數(shù))進行測定。如表3所示,a45ΔBAT2、a45-AWT和a45-BAI菌株發(fā)酵產(chǎn)生的CO2排放的質(zhì)量、剩余還原糖的質(zhì)量濃度和酒精度(體積分數(shù))與a45沒有顯著性差異。

表3 突變菌株和親本菌株的基本發(fā)酵性能

2.2.2 模擬白酒發(fā)酵生成的主要風味物質(zhì)

用GC檢測蒸餾的酒樣中主要乙酸酯和高級醇的質(zhì)量濃度。如圖4所示,突變株a45-AWT發(fā)酵生成的乙酸乙酯和乙酸異戊酯的質(zhì)量濃度分別為835.27和63.68 mg/L,比a45分別高29.14和10.26倍,正丙醇、異丁醇和異戊醇的質(zhì)量濃度分別為57.59、17.23和154.43 mg/L,分別比a45降低了17.2%、31.1%和54.5%。突變株a45-BAI的乙酸乙酯和乙酸異戊酯的質(zhì)量濃度分別為267.88和10.73 mg/L,分別比a45高867%和89.4%,分別比a45-AWT降低67.9%和83.2%。正丙醇、異丁醇、異戊醇的質(zhì)量濃度分別為69.58、24.99和339.59 mg/L,分別較原始菌株a45降低了22.8%、49.4%和12.5%,分別比a45-AWT升高了20.8%、45.0%和120%。突變株a45-BAI的高級醇的質(zhì)量濃度為501.18 mg/L,較原始菌株a45降低了14.8%,比a45-AWT升高了70.5%。

圖4 突變菌株和親本菌株的乙酸酯和高級醇生成量

出發(fā)菌株a45發(fā)酵產(chǎn)生的乙酸乙酯和乙酸異戊酯的質(zhì)量濃度比是4.9,敲除BAT2時乙酸乙酯和乙酸異戊酯之間的質(zhì)量濃度比為5.63,提高了14.8%。菌株a45-AWT的乙酸乙酯和乙酸異戊酯之間的質(zhì)量濃度比為13.36,比a45提高了1.37倍。菌株a45-BAI的乙酸乙酯和乙酸異戊酯的質(zhì)量濃度比為25.02,比出發(fā)菌株高4.1倍,比a45-AWT提高了87.3%。

出發(fā)菌株a45發(fā)酵產(chǎn)生的高級醇與乙酸酯之間的質(zhì)量濃度比為17.64,敲除BAT2時高級醇與乙酸酯之間的質(zhì)量濃度比為14.68,升高了78.7%。菌株a45-AWT的高級醇與乙酸酯之間的質(zhì)量濃度比為1.80,比a45降低了97.8%。菌株a45-BAI的高級醇與乙酸酯之間的質(zhì)量濃度比為32.80,比a45降低了89.8%,比a45-AWT提高了4.48倍。

表4 突變菌株和親本菌株的發(fā)酵結(jié)果

2.3 ATF1及IAH1基因相對表達量的檢測

檢測了重組菌株a45-AWT和a45-BAI中ATF1基因及IAH1基因的轉(zhuǎn)錄水平。如圖5所示,在敲除BAT2且過表達ATF1時,ATF1的相對表達水平提高了43.66倍,IAH1的相對表達水平無顯著性差異。在敲除BAT2并且過表達ATF1和IAH1時,IAH1的相對表達水平提高了45.5倍,ATF1的相對表達水平提高了34.84倍,表明IAH1和ATF1基因的過表達提高了其轉(zhuǎn)錄水平,乙酸乙酯和乙酸異戊酯的適量增長是ATF1和IAH1的共同調(diào)控作用。

a-重組菌株的ATF1相對表達量；b-重組菌株的IAH1相對表達量

2.4 突變株與親本菌株生長性能的比較

為了檢測其生長性能,考察了親本菌株和突變菌株在30 ℃培養(yǎng)條件下的生長情況。如圖6所示,與原始菌株a45相比,突變株和出發(fā)菌整體生長趨勢基本一致,穩(wěn)定期菌體密度相似,表明重組菌株的生長性能沒有顯著影響。

圖6 菌株的生長曲線

3 結(jié)論

乙酸乙酯和乙酸異戊酯是白酒中調(diào)節(jié)風味的關(guān)鍵微量成分,適量提高白酒中乙酸乙酯和乙酸異戊酯含量可以協(xié)調(diào)白酒的味道。IAH1最初被發(fā)現(xiàn)時,其編碼的酶被證明具有水解乙酸異戊酯的功能,隨著研究深入,學者發(fā)現(xiàn)其對別的乙酸酯也有著水解作用,敲除IAH1基因顯著升高了乙酸乙酯、乙酸異戊酯和乙酸異丁酯的產(chǎn)量[29],本實驗前期的研究也表明敲除IAH1基因顯著上調(diào)了乙酸乙酯和乙酸異戊酯的產(chǎn)量[30],這與我們的研究相一致。從結(jié)果來看,其對乙酸異戊酯作用的傾向大于乙酸乙酯,過表達IAH1基因乙酸乙酯的質(zhì)量分數(shù)顯著降低了67.9%,乙酸異戊酯的質(zhì)量分數(shù)顯著降低了83.2%,這印證了學者對其酶學性質(zhì)的研究,底物酶對乙酸異戊酯的活性高于乙酸乙酯[31]。學者已經(jīng)對IAH1編碼的酶進行結(jié)晶解析,后續(xù)對其理性設計,有望實現(xiàn)對某些酯的特異性改造,在白酒發(fā)酵中會有更強的應用[10]。

本實驗室前期以工業(yè)釀酒酵母菌株AY12的單倍體a45為出發(fā)菌株,敲除BAT2同時過表達ATF1,構(gòu)建了1株低產(chǎn)高級醇高產(chǎn)乙酸酯菌株a45-AWT,但其乙酸異戊酯含量過高,因此本研究以a45-AWT為親本菌株,在Gal80位點上過表達IAH1基因,成功構(gòu)建了a45-BAI菌株。a45-BAI菌株的乙酸異戊酯的質(zhì)量分數(shù)比a45-AWT降低了83.2%,雖然乙酸乙酯的質(zhì)量分數(shù)也降低了67.9%,但仍然比野生菌株a45提高了8.67倍,高級醇的質(zhì)量分數(shù)比野生菌株a45降低了14.8%。a45-BAI菌株與野生型菌株的生長性能沒有顯著差別,且具有高產(chǎn)乙酸乙酯、適量產(chǎn)乙酸異戊酯、低產(chǎn)高級醇的特點,可顯著改善白酒產(chǎn)品的風味和品質(zhì)。