王一 吳小倩 黃偉芳 裴斌 尚芳 孔德松 王小峰朱勇 姚航 劉飛 樊志敏

結(jié)直腸癌是一種常見的消化道惡性腫瘤，在我國(guó)惡性腫瘤發(fā)病率中位居第三位，僅次于肺癌和胃癌，死亡率居第五位，已高于發(fā)展中國(guó)家以及世界平均水平［1-3］。目前結(jié)直腸癌的治療方式主要還是依靠手術(shù)和放、化療，雖然生物制劑、免疫治療等輔助治療正在不斷出現(xiàn)［4-5］，但療效依然較為有限。以往結(jié)直腸癌的研究主要依靠細(xì)胞模型和動(dòng)物模型，但這些模型都存在一定的局限性。而類器官（organoid）模型的出現(xiàn)使得我們可以在體外更加高效且真實(shí)地模擬腫瘤在體內(nèi)的各方面特性，為基礎(chǔ)研究及其向臨床應(yīng)用的轉(zhuǎn)化提供了更加先進(jìn)的工具和橋梁。

一、類器官的出現(xiàn)和發(fā)展

2009年，Hans Clevers團(tuán)隊(duì)在Nature雜志上發(fā)表突破性成果，首次在外體培育出了結(jié)直腸上皮類器官［6］。文中，研究者將腸上皮組織消化為腸隱窩結(jié)構(gòu)或單個(gè)Lgr5+干細(xì)胞，并包裹于基質(zhì)膠（matrigel）中，再加入含有表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor，EGF）、Wnt信號(hào)通路相關(guān)蛋白R(shí)-spondin 1、Noggin蛋白的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。由于Matrigel具有支撐作用，利用腸隱窩底部Lgr5+干細(xì)胞的增殖分化能力，消化獲得的腸隱窩結(jié)構(gòu)或單個(gè)Lgr5+干細(xì)胞能夠向各個(gè)方向生長(zhǎng)，從而形成了包含腸上皮隱窩和絨毛樣結(jié)構(gòu)的3D組織球。經(jīng)免疫熒光染色、免疫組化及電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)其中包含了腸上皮細(xì)胞、杯狀細(xì)胞、潘氏細(xì)胞、腸內(nèi)分泌細(xì)胞以及Lgr5+干細(xì)胞等多種細(xì)胞種類，并具有腸上皮相似的結(jié)構(gòu)。

至2014年，已有包括腸、肝、胃、腦、腎、心臟、皮膚等在內(nèi)的多種器官被成功培育出類器官模型［7-11］。這些類器官模型的共同特點(diǎn)都包括：由相應(yīng)供體器官的多種特征性細(xì)胞構(gòu)成，相比單細(xì)胞模型能夠更好地模擬供體器官的特性；具有供體器官的部分功能，如排泄、過濾、收縮、神經(jīng)活動(dòng)等；與供體器官具有相似的組織排列形態(tài)和空間結(jié)構(gòu)?；诖?，類器官模型相比傳統(tǒng)的細(xì)胞和動(dòng)物模型展現(xiàn)出了諸多優(yōu)勢(shì)，并且由于其建立更為簡(jiǎn)便高效，可能成為傳統(tǒng)模型難以解決的科學(xué)問題的新型研究工具。例如人腦類器官可以用于研究神經(jīng)干細(xì)胞獨(dú)特的分裂方式［10］；視網(wǎng)膜類器官已被用于研究人與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物視網(wǎng)膜組織形態(tài)發(fā)生的區(qū)別［12］；胃腸道類器官則已被用于研究人與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胃腸道各器官在發(fā)育過程中功能的協(xié)調(diào)發(fā)展［13］。此外類器官在多種疾病的發(fā)生機(jī)制及治療的研究中也具有很大的潛力，可以構(gòu)建疾病模型，進(jìn)行化療藥物敏感性及安全性測(cè)試等。除了使用臨床組織樣本培養(yǎng)類器官，目前已有研究團(tuán)隊(duì)成功構(gòu)建了利用分化的人胚胎干細(xì)胞以及誘導(dǎo)多能干細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)結(jié)腸類器官的體系，為未來(lái)類器官的發(fā)展提供了更多的可能［14］。

二、結(jié)直腸癌類器官生物樣本庫(kù)的建立和發(fā)展

在以往的癌癥研究中，細(xì)胞系是最常用的體外模型，可以進(jìn)行高通量的藥物敏感性測(cè)試并將其與基因組的改變相關(guān)聯(lián)［15］。但細(xì)胞系往往已經(jīng)失去原始供體的基因組特征，不具備個(gè)體異質(zhì)性，這給精確預(yù)測(cè)具體患者對(duì)特定藥物的敏感性帶來(lái)了困難。運(yùn)用人源腫瘤異種移植模型（patientderived tumor xenograft，PDX）可以很好地解決這一問題，將供體的原位腫瘤移植入免疫缺陷動(dòng)物，可最大化地保留供體的異質(zhì)性［16］。但PDX模型的建立需要時(shí)間較長(zhǎng)，且需要高昂的費(fèi)用，不利于高通量的藥物篩選。2015年，Hans Clevers團(tuán)隊(duì)首次建立了結(jié)直腸癌類器官生物樣本庫(kù)［17］，他們用27例手術(shù)切除的結(jié)直腸癌樣本成功培育出了22例結(jié)直腸癌類器官，總體成功率達(dá)90%，并且經(jīng)傳代后均可凍存，復(fù)蘇后的成活率可達(dá)80%以上。通過對(duì)供體組織樣本及所培養(yǎng)的類器官進(jìn)行固定、切片及H & E染色后對(duì)比發(fā)現(xiàn)，正常腸上皮組織來(lái)源的類器官形態(tài)較規(guī)則，中空有腔并有絨毛、隱窩樣結(jié)構(gòu)。而結(jié)直腸癌組織來(lái)源的類器官則很大程度上保留了供體組織的形態(tài)學(xué)特征，如薄壁的囊性結(jié)構(gòu)或沒有空腔的緊密型結(jié)構(gòu)。之后分別提取類器官及其相應(yīng)供體活檢組織的基因組DNA，進(jìn)行全外顯子組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)類器官每Mb堿基對(duì)的平均突變率與供體活檢組織相似，且突變主要為CpG向T的突變，與結(jié)直腸癌的大規(guī)模測(cè)序結(jié)果相一致。轉(zhuǎn)錄組分析顯示不同類器官在基因表達(dá)上具有細(xì)微的差異，說(shuō)明了類器官之間具有異質(zhì)性?；诖?，Hans Clevers團(tuán)隊(duì)組織成立了非盈利機(jī)構(gòu)Hubrecht Organioid Technology（HUB），以進(jìn)一步擴(kuò)大結(jié)直腸癌和其他類型類器官生物樣本庫(kù)的規(guī)模。

此后，又有多個(gè)結(jié)直腸癌樣本庫(kù)被建成［17-24］（見表1），進(jìn)一步證明了類器官模型可以用于結(jié)直腸癌患者個(gè)體水平的基因組及其功能的研究，且具有耗時(shí)短、高通量的特點(diǎn)，這是傳統(tǒng)細(xì)胞系模型及PDX模型所無(wú)法做到的。并且由于類器官可以很好地保留供體組織的異質(zhì)性，可以用于高通量的高敏感度的藥物敏感性檢測(cè)，為結(jié)直腸癌患者制定個(gè)性化的治療方案，具有很高的應(yīng)用價(jià)值。

表1 目前結(jié)直腸癌類器官生物樣本庫(kù)建設(shè)情況

三、結(jié)直腸癌類器官生物樣本庫(kù)的應(yīng)用

1.抗結(jié)直腸癌藥物的開發(fā)

近年來(lái)，由于法規(guī)的完善以及越來(lái)越嚴(yán)格的臨床試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，前期基礎(chǔ)研究所開發(fā)的抗癌藥物大部分無(wú)法通過臨床試驗(yàn)最終進(jìn)入臨床使用，導(dǎo)致研發(fā)成本急劇升高。其中影響最為顯著的因素是在藥物的前期開發(fā)過程中沒有合適的臨床前模型進(jìn)行藥物療效的評(píng)價(jià)，導(dǎo)致多數(shù)藥物雖然在基礎(chǔ)研究中顯示出良好的效果，但應(yīng)用于人體后卻無(wú)法達(dá)到滿意的療效。通過收集臨床樣本建立大型結(jié)直腸癌類器官生物樣本庫(kù)，并記錄每個(gè)患者的基線資料，除了可以對(duì)這些類器官進(jìn)行基因組測(cè)序和表達(dá)譜分析外，在抗癌藥物開發(fā)的基礎(chǔ)和臨床研究中可以起到重要的作用，可以幫助發(fā)現(xiàn)新穎的抗癌化合物，探索全新的治療策略。使用類器官模型進(jìn)行抗癌藥物的開發(fā)能夠更好地模擬人體對(duì)于藥物的反應(yīng)，更準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)治療效果，減少后期臨床試驗(yàn)失敗的風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)節(jié)省研發(fā)時(shí)間，降低研發(fā)成本，目前已經(jīng)得到了越來(lái)越廣泛的使用［25］。

2.藥物敏感性檢測(cè)與個(gè)體化治療

類器官作為極具潛力的臨床前模型，在藥物敏感性檢測(cè)方面已有較多應(yīng)用。Schutte等［19］建立了1個(gè)大型結(jié)直腸癌生物樣本庫(kù)，其中包含了35例類器官樣本及59例PDX樣本，并通過基因組測(cè)序驗(yàn)證了這些模型都很好地反應(yīng)了供體腫瘤組織的表型特征。此研究發(fā)現(xiàn)了不同來(lái)源腫瘤的異質(zhì)性如EGFR、PTCH1等基因的突變可能影響到藥物的治療效果，這也印證了類器官模型對(duì)供體組織異質(zhì)性的保留。Ganesh等［21］建立了包含65例直腸癌類器官的樣本庫(kù)，進(jìn)行體外放化療干預(yù)后的類器官模型顯示出了與臨床患者相一致的反應(yīng)。并且將類器官移植入實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)再進(jìn)行相同手段干預(yù)后，可以觀察到相一致的結(jié)果，顯示出了類器官模型在藥敏檢測(cè)中良好的應(yīng)用前景。Yao等［23］運(yùn)用局部進(jìn)展期直腸癌（LARC）且接受了新輔助放化療（NACR）患者的臨床組織樣本構(gòu)建了包含80例類器官的生物樣本庫(kù)，基于此樣本庫(kù)發(fā)現(xiàn)類器官可以預(yù)測(cè)患者對(duì)放療、5-Fu、CPT-11的敏感性，識(shí)別適合進(jìn)行新輔助放化療的患者，指導(dǎo)臨床治療。對(duì)于部分對(duì)放化療不敏感的患者，類器官也可以幫助選擇合適的靶向藥物或新型藥物，避免過度治療并減少治療的副作用。該研究所進(jìn)行的類器官培養(yǎng)及干預(yù)反應(yīng)檢測(cè)均可以在4周內(nèi)完成，證明了類器官模型可以在短時(shí)間內(nèi)對(duì)臨床用藥作出有意義的指導(dǎo)。Vlachogiannis等［20］構(gòu)建了包含24例結(jié)直腸癌類器官在內(nèi)的生物樣本庫(kù)，經(jīng)過對(duì)類器官模型、動(dòng)物移植瘤模型藥敏檢測(cè)結(jié)果以及臨床患者藥物反應(yīng)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)類器官預(yù)測(cè)患者對(duì)靶向藥物或化療藥物的反應(yīng)具有100%的敏感性和93%的特異性，準(zhǔn)確性達(dá)到88%，且具有100%的陰性預(yù)測(cè)率。Narasimhan等［26］對(duì)腹膜轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌組織進(jìn)行類器官培養(yǎng)，并進(jìn)行基因測(cè)序及中通量藥敏測(cè)試。結(jié)果發(fā)現(xiàn)藥物對(duì)腹膜轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌的反應(yīng)性與患者特定的基因組改變相一致，顯示類器官平臺(tái)可以作為藥敏檢測(cè)的平臺(tái)，從而指導(dǎo)預(yù)后不良的結(jié)直腸癌患者進(jìn)行個(gè)體化治療?？偠灾?，在臨床實(shí)踐中對(duì)于需要進(jìn)行化療或靶向藥物治療的結(jié)直腸癌患者，可以對(duì)其活檢或手術(shù)切除組織進(jìn)行類器官培養(yǎng)，高通量的進(jìn)行藥物敏感性檢測(cè)，針對(duì)個(gè)體選擇更為敏感的藥物組合方案，從而提高治療的效果，更符合個(gè)體化治療的發(fā)展趨勢(shì)，具有很高的臨床應(yīng)用價(jià)值。

3.在基礎(chǔ)研究中的應(yīng)用

由于結(jié)直腸癌是一種異質(zhì)性疾病，不同患者的臨床表現(xiàn)和預(yù)后都各不相同，所以類器官在結(jié)直腸癌發(fā)生與發(fā)展的基礎(chǔ)研究中有很高的應(yīng)用前景。Fujii等［18］構(gòu)建了包含55例樣本的結(jié)直腸癌生物樣本庫(kù)，其供體組織包含了多種組織學(xué)亞型及臨床階段。無(wú)論在體外培養(yǎng)或移植到免疫缺陷小鼠體內(nèi)培養(yǎng)，類器官均表現(xiàn)出了與供體組織相似的病理分期和分化能力。在結(jié)直腸腫瘤從正常組織向腺瘤轉(zhuǎn)變以及從腺瘤組織向腺癌轉(zhuǎn)變的過程中，對(duì)局部微環(huán)境的依賴性降低，產(chǎn)生這種變化主要是由基因突變導(dǎo)致的，且能夠加速局部的癌變過程。而對(duì)于進(jìn)展期的結(jié)直腸癌類器官，其生物學(xué)行為的改變?nèi)鐚?duì)BMP/TGF-β的抵抗以及獲得轉(zhuǎn)移的能力，被發(fā)現(xiàn)與基因組的改變沒有直接的關(guān)聯(lián)。未來(lái)利用更先進(jìn)的基因分析技術(shù)可能會(huì)發(fā)現(xiàn)對(duì)結(jié)直腸癌進(jìn)展有重大影響的遺傳學(xué)改變，而類器官模型則可以成為連接生物學(xué)與遺傳學(xué)的主要橋梁。早發(fā)性結(jié)直腸癌（EOCRC）的預(yù)后較差，且難以用細(xì)胞和動(dòng)物模型進(jìn)行研究。Drost等［27］運(yùn)用CRISPR-Cas9技術(shù)在人結(jié)直腸類器官上對(duì)最常見的結(jié)直腸癌突變基因進(jìn)行靶向修飾，證實(shí)類器官模型可以作為結(jié)直腸癌發(fā)生研究的重要工具。Takeda等［28］則運(yùn)用CRISPRCas9技術(shù)干預(yù)結(jié)直腸癌類器官，構(gòu)建了對(duì)結(jié)直腸癌發(fā)生相關(guān)基因進(jìn)行功能驗(yàn)證的平臺(tái)，并且可以進(jìn)一步推廣至其他類型的腫瘤中。Yan等［24］利用EOCRC患者的臨床組織樣本培養(yǎng)了49例類器官，并對(duì)其進(jìn)行了外顯子組及轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，尋找EOCRC中的關(guān)鍵突變以及轉(zhuǎn)錄組的變化。該團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)了在EOCRC類器官中就包含了PTPRK-RSPO3融合在內(nèi)的多種表型特征。而從轉(zhuǎn)錄角度，與APC突變型類器官相比，RSPO融合型與正常腸組織類器官更為相似，表現(xiàn)為BMP2高表達(dá)且依賴于BMP/SMAD通路的失活，且表達(dá)較少的干細(xì)胞標(biāo)志物PTK7，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析也證實(shí)了這一結(jié)果。通過對(duì)EOCRC和正常腸類器官的長(zhǎng)期培養(yǎng)，相較于正常腸癌類器官，EOCRC類器官的穩(wěn)定性更強(qiáng)，這一特性對(duì)CRISPR-Cas9技術(shù)的合理使用有所幫助。此外，這些發(fā)現(xiàn)對(duì)正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)的Wnt分泌抑制劑、RSPO、PTK7靶向藥物對(duì)RSPO融合型及APC突變型結(jié)直腸癌的不同應(yīng)用作出了一定的指導(dǎo)作用。

四、小結(jié)

結(jié)直腸癌類器官生物樣本庫(kù)的建立和應(yīng)用為結(jié)直腸癌的基礎(chǔ)研究、藥物開發(fā)、個(gè)體化治療提供了更為可靠的工具，相較于傳統(tǒng)的疾病模型具有諸多優(yōu)勢(shì)。但結(jié)直腸癌類器官生物樣本庫(kù)的進(jìn)一步推廣應(yīng)用仍存在一定的挑戰(zhàn)。例如類器官培養(yǎng)的技術(shù)相對(duì)復(fù)雜，對(duì)技術(shù)人員的操作要求較高；類器官培養(yǎng)雖然相較于構(gòu)建PDX模型成本較低，但建立大規(guī)模的生物樣本庫(kù)仍然需要較高的費(fèi)用投入；目前結(jié)直腸癌類器官主要以上皮組織培養(yǎng)為主，還缺乏成熟的包含基質(zhì)及免疫系統(tǒng)的培養(yǎng)體系，需要進(jìn)一步研究探索?？偠灾?，類器官技術(shù)的出現(xiàn)以及結(jié)直腸癌類器官生物樣本庫(kù)的建立和應(yīng)用有望建立結(jié)直腸癌基礎(chǔ)研究與臨床試驗(yàn)的直接聯(lián)系，補(bǔ)充以細(xì)胞系和PDX模型為基礎(chǔ)的藥物研究的不足，進(jìn)一步推動(dòng)結(jié)直腸癌的個(gè)體化治療。