張朝華，劉旭幫，朱銀川，湯建民

國家心血管病中心發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示，我國心腦血管病患病人數(shù)已達(dá)到2.9億，心血管疾病引起的死亡占居民疾病死亡構(gòu)成40%以上，是引起居民疾病死亡的首位疾病[1]。炎癥是引起心血管疾病患者心肌損傷的主要誘因之一，腫瘤壞死因子α（TNF-α）是體內(nèi)重要的炎癥細(xì)胞因子，是心血管疾病引起心肌損傷的關(guān)鍵炎癥因子，在急性心肌梗死、冠狀動脈（冠脈）硬化及心力衰竭（心衰）等心血管疾病中起重要作用，誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷和破壞心肌組織[2,3]。microRNA-9（miR-9）是一個新發(fā)現(xiàn)的微小非編碼RNA，被證實(shí)可參與神經(jīng)干細(xì)胞分化[4]，且被證實(shí)參與心腦血管疾病的發(fā)生發(fā)展[5]。本研究以人心肌細(xì)胞H9c2細(xì)胞作為研究對象，敲低H9c2細(xì)胞內(nèi)miR-9表達(dá)以觀察miR-9對TNF-α誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷的影響，探討其分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器人心肌細(xì)胞（H9c2）購買自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏中心；RNAiso plus和PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser購買自日本TARAKA公司；胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基、Lipofectamine? 2000轉(zhuǎn)染試劑均購買自美國賽默飛世爾科技公司；CCK8試劑盒和熒光素酶報告基因檢測試劑盒購買自中國碧云天生物技術(shù)有限公司；GoTaq? qPCR Master Mix購買自中國Promega公司；SIRT1抗體、p65抗體及p-p65抗體均購買自Cell Signaling Technology公司；酶標(biāo)儀購買自BIORAD公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞活性檢測在96孔培養(yǎng)板每孔中接種100 μl濃度為1×105個/ml的心肌細(xì)胞，加入不同濃度（0、5、10、15和20 μg/ml）的TNF-α作用24 h，空白對照組（Control組）中心肌細(xì)胞不添加TNF-α培養(yǎng)24 h；或加入10 μg/ml的TNF-α刺激不同的時間（0、12、24、48和72 h），空白對照組（Control組）為心肌細(xì)胞不添加TNF-α分別培養(yǎng)不同時間（0、12、24、48和72 h）；最后，向每孔加入10微升CCK-8溶液，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1 h后，使用酶標(biāo)儀在450 mm波長處讀取OD值。TNF-α刺激組細(xì)胞活性=[（TNF-α刺激組OD450-空白對照組OD450）/空白對照組OD450]×100%。

1.2.2 miR-9表達(dá)水平檢測10 μg/mL的TNF-α刺激心肌細(xì)胞24 h，通過胰酶消化作用以收集細(xì)胞，向心肌細(xì)胞中加入適量的RNAiso以提取RNA，用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。 PCR參數(shù)設(shè)定：37℃ 60 min；85℃ 5 s。RT-qPCR：根據(jù)GoTaq? qPCR Master Mix試劑盒說明書制備20 μl RT-qPCR系統(tǒng)，使用ABI 7500熒光定量PCR儀器進(jìn)行擴(kuò)增。PCR參數(shù)設(shè)定：95℃，30 s；[90℃ 5 s，65℃ 30 s]-40個循環(huán)。以U6為內(nèi)參，用2-△t△t法計算目的基因的相對表達(dá)量。PCR引物如下：miR-9-F：5'-ACACTCC AGCTGGGTCTTTGGTTATCTAGCT-3'；miR-9-R：5'-TGGTGTCGTGGAGTCG-3'；U6-F：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'， U6-R：5'-AAC GCTTCACGAATTTGCGT-3'。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染H9c2細(xì)胞均培養(yǎng)在添加10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件是37℃，5%CO2。根據(jù)按照Lipofectamine? 2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書所示的轉(zhuǎn)染步驟將miR-NC（5'-GCUUAACCAUGCGACUAUUA-3'）或miR-9-inhibitor (5'-AGAAACCA AUGCGACAUACU-3'）分別轉(zhuǎn)入H9c2細(xì)胞內(nèi)。轉(zhuǎn)染6 h后，更換細(xì)胞培養(yǎng)基，然后將細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)到37℃和5%CO2條件下以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 熒光素酶基因報告通過PCR技術(shù)擴(kuò)增miR-9的3'-UTR的SIRT1結(jié)合基因序列，將野生型（WT）或突變型（MUT）的SIRT1基因序列克隆到pmirGLO質(zhì)粒上以獲得pmirGLO- SIRT1 WT/MUT，使用Lipofectamine? 2000轉(zhuǎn)染試劑將重組質(zhì)粒與miR-NC或miR-9-inhibitor一起轉(zhuǎn)入H9c2細(xì)胞中。48 h后，根據(jù)雙熒光素酶報告基因試劑盒說明所述步驟檢測熒光素酶活性。

1.2.5 蛋白表達(dá)檢測經(jīng)不同條件處理后的H9c9細(xì)胞被收集以用于提取細(xì)胞總蛋白。通過10% SDSPAGE分離50 μg總蛋白。將蛋白從SDS-PAGE凝膠轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h。用磷酸鹽緩沖溶液洗滌膜3遍后，將膜與SIRT1抗體、p65抗體以及p-p65抗體等在4℃孵育過夜。室溫下添加二抗孵育2 h。用磷酸鹽緩沖液-洗滌3次后，加入ECL溶液（WBKLS0100，北京新晶科生物技術(shù)有限公司，中國）進(jìn)行檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析方法研究數(shù)據(jù)由Grahpad Prism 5軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間均數(shù)的比較采用t檢驗(yàn)，多組間均數(shù)比較采用方差分析。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TNF-α以劑量和時間依賴性降低心肌細(xì)胞活性使用不同濃度的TNF-α刺激心肌細(xì)胞（H9c2）24 h，然后通過CCK8試劑盒測定H9c2的細(xì)胞活性，結(jié)果顯示：TNF-α刺激H9c2細(xì)胞的濃度越高，H9c2細(xì)胞的活性就越低，與不加TNF-α的Control組相比，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），圖1A。使用10 μg/mL的TNF-α刺激心肌細(xì)胞（H9c2）不同時間，檢測H9c2的細(xì)胞活性，結(jié)果顯示：TNF-α刺激H9c2細(xì)胞的時間越久，H9c2細(xì)胞的活性越低，與不加TNF-α的Control組相比，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），圖1B。

圖1 TNF-α誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷具有劑量和時間依賴性

2.2 TNF-α以劑量和時間依賴性促進(jìn)心肌細(xì)胞表達(dá)miR-9使用不同濃度的TNF-α刺激心肌細(xì)胞（H9c2）24 h，收集細(xì)胞、提取細(xì)胞總RNA以檢測miR-9表達(dá)，結(jié)果顯示：TNF-α濃度越高，H9c2細(xì)胞中miR-9的表達(dá)水平越高，與0 μg/ml TNF-α刺激組相比，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），圖2A。使用10 μg/ml的TNF-α分別刺激心肌細(xì)胞（H9c2）不同時間，收集細(xì)胞、提取細(xì)胞總RNA以檢測miR-9表達(dá)，結(jié)果顯示：TNF-α刺激H9c2的時間越久，miR-9在H9c2細(xì)胞中的表達(dá)水平越高，與TNF-α刺激0 h相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），圖2B。

圖2 TNF-α促進(jìn)心肌細(xì)胞中miR-9的表達(dá)

2.3 敲低miR-9減少TNF-α誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷通過向H9c2細(xì)胞中轉(zhuǎn)入miR-9-inhibitor以敲低miR-9的表達(dá)，經(jīng)檢測：與miR-NC組相比，miR-9-inhibitor組的H9c2細(xì)胞miR-9的表達(dá)水平顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001），圖3A。用10 μg/ml的TNF-α分別刺激miR-NC組及miR-9-inhibitor組H9c2細(xì)胞24 h，經(jīng)檢測：與miR-NC組相比，TNF-α刺激后，miR-9-inhibitor組的H9c2細(xì)胞活性更高（P＜0.001），圖3B。

圖3 敲低miR-9較少TNF-α誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷

2.4 miR-9通過抑制SIRT1表達(dá)而促進(jìn)心肌細(xì)胞中NF-κB通路激活通過TargetScanHuman（http://www.targetscan.org/vert_72/）數(shù)據(jù)庫查詢miR-9潛在的靶基因，miR-9與SIRT1具有相互結(jié)合的基因序列，圖4A。將pmirGLO-SIRT1 WT/MUT與miR-9-inhibitor共同轉(zhuǎn)入到H9c2細(xì)胞中，然后測定熒光素酶活性。結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)入pmirGLO-SIRT1 MUT的H9c2細(xì)胞中，轉(zhuǎn)入miR-9-inhibitor不影響熒光素酶活性；在轉(zhuǎn)入pmirGLO-SIRT1 WT的H9c2細(xì)胞中，轉(zhuǎn)入miR-9-inhibitor增強(qiáng)熒光素酶活性，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），圖4B。此外，使用10 μg/mL的TNF-α分別刺激miR-NC組及miR-9-inhibitor組H9c2細(xì)胞24 h，收集細(xì)胞檢測蛋白表達(dá)變化，結(jié)果顯示：miR-NC組相比，轉(zhuǎn)入miR-9-inhibitor以敲低miR-9的表達(dá)水平的H9c2細(xì)胞，在TNF-α刺激下SIRT1蛋白表達(dá)更高，而p-p65/p65蛋白表達(dá)比值更低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），圖4C、圖4D。

圖4 miR-9靶向抑制SIRT1表達(dá)而促進(jìn)p65磷酸化

3 討論

TNF-α位于人染色體6q21.33位置上，與主要的相容性復(fù)合體基因緊密相連，這種緊密連接保證了TNF-α在免疫調(diào)節(jié)基因產(chǎn)物的聯(lián)合反應(yīng)和調(diào)控中發(fā)揮重要作用[6]。在機(jī)體內(nèi)，TNF-α是一種發(fā)揮多重生物學(xué)功能的炎癥細(xì)胞因子，在心血管疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用，被證實(shí)在參與調(diào)控急性心肌梗死、動脈粥樣硬化、病毒性心肌炎及器官移植排斥反應(yīng)的病理進(jìn)程。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)TNF-α以劑量和時間依賴形式促進(jìn)心肌細(xì)胞損傷。之前研究已表明，TNF-α在心血管疾病中主要通過招募巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞和心肌細(xì)胞損傷，降低正常細(xì)胞增殖活性和誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡[7,8]。

microRNA是一類在真核細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的、由內(nèi)源基因編碼的長度約為22個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，通過其對靶基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控參與到真核細(xì)胞的分化、增殖、生長和凋亡的調(diào)解。在心血管疾病的中，miRNA不僅通過其對靶基因的調(diào)控而在心肌肥大、心肌壞死和凋亡中發(fā)揮著舉足輕重的作用，并且參與到急性心肌梗死發(fā)病的每個過程[9-11]。同時，由于miRNA在血液中異常的穩(wěn)定，且對各種病理生理?xiàng)l件下表達(dá)差異明顯，是一種理想的疾病血液檢測生物標(biāo)志物。Liu等[12]研究指出，血漿miR-1，miR-208和miR-499是漢人群急性心肌梗死的潛在預(yù)測生物標(biāo)志物。本次研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α不僅以劑量和時間依賴性誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷，且還以劑量和時間依賴性促進(jìn)心肌細(xì)胞中miR-9表達(dá)。

為研究miR-9在TNF-α誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷中發(fā)揮的作用，向心肌細(xì)胞中轉(zhuǎn)入miR-9-Inhibitor以敲低心肌細(xì)胞中miR-9的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：敲低miR-9可顯著降低TNF-α誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷。MiR-9作為一種microRNA并不編碼蛋白而發(fā)揮生物學(xué)功能，而只能通過對其靶基因的調(diào)控而間接參與細(xì)胞生物學(xué)功能的調(diào)控。為了進(jìn)一步研究miR-9對TNF-α誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的調(diào)控作用，通過生物學(xué)信息手段查詢到SIRT1是miR-9的靶基因，且本文通過雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，miR-9靶向抑制心肌細(xì)胞的SIRT1的表達(dá)。SIRT1是sirtuin蛋白家族的成員之一，是一種煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴性組蛋白去乙?；?，不僅可通過去乙?；M蛋白而維持染色質(zhì)和基因組的穩(wěn)定，還可通過其去乙?；墙M蛋白的功能而參與細(xì)胞生物學(xué)功能的調(diào)控[13]。之前研究指出，上調(diào)SIRT1的表達(dá)不僅降低膿毒血癥小鼠體內(nèi)的炎癥性損傷[14]，通過其去乙?；δ芏种苝65蛋白進(jìn)入細(xì)胞核，抑制NF-κB信號通路的激活，減輕炎癥[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，敲低miR-9不僅顯著增加心肌細(xì)胞中SIRT1蛋白的表達(dá)，且顯著降低p65蛋白的磷酸化，提示miR-9可能通過靶向抑制SIRT1蛋白表達(dá)而促進(jìn)NF-κB信號通路的激活，降低細(xì)胞活性。

綜上所述，miR-9可能通過靶向抑制SIRT1蛋白表達(dá)、促進(jìn)NF-κB信號通路的激活從而在TNF-α誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷過程中發(fā)揮促進(jìn)炎癥損傷的作用。而敲低miR-9可減輕TNF-α誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷，提高心肌細(xì)胞活性。