徐秋玲，鄭學芝，郭 冉，王文婷，張緒東

(牡丹江醫(yī)學院，黑龍江 牡丹江 157011)

心肌纖維化是糖尿病心肌損傷的病理機制之一，高糖刺激導致炎性反應在糖尿病心肌損害中發(fā)揮著重要作用[1]。細胞Toll樣受體(TLR)是Ⅰ型跨膜蛋白，活化后激活下游核因子κB(NF-κB)，使細胞內(nèi)炎性細胞因子增多，導致心肌間質(zhì)膠原纖維大量沉積，心肌間質(zhì)纖維化[2]。中藥黃芩的主要活性成分為黃芩苷，可抑制高血壓大鼠心肌細胞纖維化[3]。但黃芩苷對糖尿病心肌纖維化是否具有作用，且相關研究較少。本研究通過建立大鼠糖尿病模型，觀察了黃芩苷與TLR/NF-κB 信號通路的關系，旨在探討黃芩苷干預糖尿病心肌纖維化機制。

1 材料與方法

1.1材料 雄性SD大鼠由哈爾濱醫(yī)科大學實驗動物學部提供，黃芩苷購自Sigma公司(高效液相色譜測定含量大于95%，用生理鹽水配制藥液)，masson染色試劑購自福州邁新生物技術公司，兔抗鼠白細胞介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、TLR4、核因子-κBp65(p65)、Ⅰ型膠原(collagenⅠ)多克隆抗體均購自Abcam公司，兔抗鼠β-actin多克隆抗體購自博士德生物工程有限公司。

1.2方法

1.2.1建立糖尿病大鼠模型 2019年7月選取雄性SD大鼠25只，體重180～222 g，尾靜脈注射鏈脲佐菌素45 mg/kg(溶于0.1 mmol/L枸櫞酸緩沖液)。72 h后連續(xù)2次空腹血糖大于或等于16.7 mmol/L為糖尿病模型造模成功，共20只。

1.2.2分組與給藥 將40只大鼠按照隨機區(qū)組設計法分為對照組(NC組，腹腔注射生理鹽水)、糖尿病模型組(DM組，腹腔注射生理鹽水)、黃芩苷+糖尿病組[Baicalin+DM組，腹腔注射黃芩苷藥液15 μmol/L/(kg·d)]和黃芩苷+對照組[Baicalin+NC組，腹腔注射黃芩苷藥液15 μmol/L/(kg·d)]，每組10只。連續(xù)用藥8周。

1.2.3Masson染色 取各組大鼠心尖組織制備石蠟切片，按masson染色試劑盒說明書進行操作。每組取材6張片子，高倍鏡(400×)下觀察。計算心肌膠原容積分數(shù)[CVF=(膠原面積/全視野面積)×100%]。

1.2.4Western-blotting檢測IL-1β、TNF-α、TLR4、p65、collagenⅠ蛋白水平 按試劑說明書提取各組大鼠心肌組織總蛋白，檢測蛋白濃度和純度，進行分裝，每管蛋白為50 μg，凍存于-80 ℃冰箱備用。Western-blotting步驟：十二烷基硫酸鈉-聚丙稀酰胺電泳，轉(zhuǎn)膜，免疫反應(封閉液稀釋一抗1∶100、二抗1∶1 000)，二氨基聯(lián)苯胺顯色。采用4000R柯達成像系統(tǒng)凝膠成像儀采集圖像并進行分析。計算條帶光密度值與條帶面積比值。

1.2.5觀察指標 觀察各組大鼠血糖、心臟重量指數(shù)(心臟重量/體重)、CVF，以及IL-1β、TNF-α、TLR4、p65、collagenⅠ蛋白水平等。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠血糖、心臟重量指數(shù)比較 與NC組比較，DM組大鼠血糖明顯升高，心臟重量指數(shù)明顯增加，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與DM組比較，Baicalin+DM組大鼠血糖明顯降低，心臟重量指數(shù)明顯減小，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1、圖1。

A：各組血糖比較；B：各組心臟重量指數(shù)比較;與NC組比較，aP<0.05；與DM組比較，bP<0.05。

表1 各組大鼠血糖、心臟重量指數(shù)比較

2.2各組大鼠心肌組織變化及CVF比較 DM組大鼠心肌纖維排列紊亂，部分肌纖維被藍染的膠原纖維取代，纖維組織明顯增生；與DM組比較，Baicalin+DM組大鼠心肌纖維排列較規(guī)則，肌纖維變性較輕，纖維組織增生明顯減少。與NC組比較，DM組大鼠CVF明顯升高，與DM組比較，Baicalin+DM組大鼠CVF明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2、3。

A：NC組；B：DM組；C：Baicalin+DM組；D：Baicalin+NC組。

2.3各組大鼠心肌IL-1β、TNF-α、TLR4、p65、collagenⅠ表達水平比較 與NC組比較，DM組大鼠心肌IL-1β、TNF-α、TLR4、p65、collagenⅠ表達水平均明顯升高，與DM組比較，Baicalin+DM組大鼠心肌IL-1β、TNF-α、TLR4、p65、collagenⅠ表達水平均明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2，圖4、5。

與NC組比較，aP<0.05；與DM組比較，bP<0.05。

表2 各組大鼠心肌NF-κB p65/β-actin表達水平比較

A：NC組；B：DM組；C：Baicalin+DM組；D：Baicalin+NC組。

A為IL-1β，B為TNF-α，C為TLR4,D為p65,E為collagenⅠ；與NC組比較，aP<0.05；與DM組比較，bP<0.05。

3 討 論

心肌間質(zhì)纖維化，即膠原纖維大量沉積是高血糖侵害下導致心肌損害的重要病變之一，纖維化增加了心室壁僵硬度，降低了心室順應性，導致心功能不全[4]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，終末期心力衰竭患者死亡的主要原因為心肌間質(zhì)纖維化[5]。本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，DM組大鼠心臟重量指數(shù)明顯增加，心肌纖維排列紊亂，纖維組織增生明顯，膠原纖維增多。心肌collagenⅠ表達水平明顯增加，印證了在高血糖因素刺激下可導致心肌纖維化，影響心臟功能。

有研究表明，敲除免疫球蛋白樣受體b4的大鼠出現(xiàn)病理性心肌肥大，心肌炎性反應增強，心肌纖維化，而NF-κB信號通路參與了這一病理機制[6]。在新生大鼠心臟成纖維細胞的研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB參與了血管緊張素Ⅱ誘導的心肌纖維化，使用 NF-κB抑制蛋白α(IκBα)抑制NF-κB活性可減輕纖維化進程[7]。本研究DM組大鼠心肌NF-κB p65蛋白和炎性性別因子--IL-1β、TNF-α表達水平均明顯升高，collagenⅠ表達水平也明顯升高，推測高濃度葡萄糖激活了NF-κB信號通路，誘導了異常的炎性反應，心肌細胞過表達炎性性別因子，TNF-α、IL-1β釋放增多，侵害心肌組織。

TLR主要分布在淋巴細胞、巨噬細胞、血管細胞表面，TLR有多種亞型，其中TLR4在心臟組織中表達水平最高，在心肌缺血再灌注損傷中TLR4參與了IL-10基因敲除小鼠心肌纖維化病理機制[8]。TLR4與配體結(jié)合后先活化IκB激酶，導致細胞內(nèi)NF-κB/IκB復合物IκB亞基被絲氨酸磷酸化，蛋白酶降解，從而釋放NF-κB二聚體，NF-κB進入細胞核，結(jié)合在NF-κB結(jié)合位點，啟動轉(zhuǎn)錄進程。激活細胞核內(nèi)NF-κB，在心肌梗死損傷介導的炎性反應中發(fā)揮著重要作用[9]。炎性性別因子主要通過Toll樣受體識別損傷的相關分子模式，導致炎性反應。TLR4誘發(fā)心肌細胞免疫反應，釋放炎性性別因子，致使細胞外基質(zhì)沉積，促進心肌纖維化病程發(fā)展[10]。有研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病動脈粥樣硬化病變時機體血管內(nèi)皮細胞TLR4蛋白表達上調(diào)，NF-κB被激活，加劇了動脈粥樣硬化斑塊的形成，推測TLR4/NF-κB信號通路參與了血管的炎性反應，介導糖尿病動脈粥樣硬化病理過程[11-12]。本研究結(jié)果顯示，高血糖刺激同樣可誘導NF-κB活化，加重心肌炎性反應，同時本研究Western-blotting檢測結(jié)果顯示，DM組大鼠心肌TLR4表達水平明顯高于NC組，表明高血糖是通過TLR/NF-κB信號通路導致心肌炎性反應增強。

黃芩苷(C21H18O11)是黃芩中主要的黃酮類成分，具有多種藥理作用，如抑菌抗炎、調(diào)節(jié)免疫、抗氧化、抗纖維化、心血管保護作用等。在血管緊張素Ⅱ誘導的心肌成纖維細胞中黃芩苷調(diào)節(jié)了腺苷酸激活蛋白激酶/轉(zhuǎn)化生長因子-β/sma和mad的同源蛋白信號通路，抑制細胞增殖及膠原合成，降低纖維連接蛋白和結(jié)締組織生長因子表達，可抑制心肌纖維化，預防心力衰竭[13]。在慢性壓力超負荷小鼠模型中黃芩苷能減輕因壓力超負荷引起的心功能障礙和心室重構[14]。在腎性高血壓大鼠心肌中黃芩苷可減少心肌細胞凋亡，減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應，抑制心肌纖維化，改善心室重構[15]。黃芩苷在高血糖誘導心肌纖維化中的作用和分子機制的研究較少，本研究探討了黃芩苷對糖尿病心肌纖維化的機制，結(jié)果顯示，Baicalin+DM組大鼠血糖明顯低于DM組，表明黃芩苷具有降低血糖的作用，且黃芩苷能改善糖尿病大鼠心肌纖維化，Baicalin+DM組大鼠心肌IL-1β、TNF-α、TLR4、p65表達水平均明顯低于DM組，推測黃芩苷通過抑制TLR4/NF-κB信號通路、減少NF-κB的核轉(zhuǎn)位、抑制炎性性別因子釋放而改善心肌纖維化，起到保護心肌的作用，但黃芩苷調(diào)控TLR4的機制尚需進一步研究。