邵育新，馮青俊，王明成

（1.河南省平輿縣家畜家禽改良站 463000；2.河南省泌陽縣動物疫病預(yù)防控制中心 463700；3.黃淮學(xué)院生物與食品工程學(xué)院 463000）

隨著畜禽養(yǎng)殖規(guī)?；图s化的快速發(fā)展，大量排放的糞污及臭氣物質(zhì)引起的環(huán)境污染問題正逐漸成為人們關(guān)注的焦點，成為制約發(fā)展環(huán)境友好型畜牧業(yè)的主要因素[1]。伴隨著人們對肉制品品質(zhì)要求的提高，只有對有害因素進(jìn)行準(zhǔn)確地了解測定，才能更好地提出建議，提升生產(chǎn)效率；減輕畜牧業(yè)對水源、土壤等環(huán)境的污染，推行綠色養(yǎng)殖，滿足食物安全需求；鞏固我國畜禽產(chǎn)品在國外洋畜禽市場的綜合競爭力，發(fā)揮重要的經(jīng)濟(jì)和社會效益。

吲哚和糞臭素是由飼料蛋白或腸道脫落上皮細(xì)胞中的色氨酸在單胃動物后腸厭氧微生物作用下產(chǎn)生的主要降解物，隨動物周齡的增長而增加。產(chǎn)生的位置主要在盲腸，與菌群的多樣性和含量有關(guān)。糞臭素有極強(qiáng)的糞臭味，一部分形成后隨糞便排出體外，為主要糞臭源之一；另一部分由腸壁入血，通過血液循環(huán)進(jìn)入肝臟后，部分被代謝由尿液排出，剩余部分則沉積在脂肪、肝臟、腎臟、肌肉中，引起肉產(chǎn)生膻味，降低肉品質(zhì)[2]。高濃度的糞臭素影響牲畜的生理及呼吸功能，引起急性中毒；低濃的糞臭素可改變動物的神經(jīng)內(nèi)分泌功能，降低代謝及免疫功能[2]。另外，吲哚和糞臭素進(jìn)入體內(nèi)能夠影響酶的功能，如胃蛋白酶和胰蛋白酶。

巨大芽孢桿菌為革蘭氏陽性菌，芽孢桿菌屬，常用來生產(chǎn)解磷固鉀肥，該菌芽孢具有極強(qiáng)的繁殖力和耐受性[3]。芽孢桿菌可以產(chǎn)生體外酶，如蛋白酶，脂肪酶和淀粉酶等，還可產(chǎn)生降解飼料中碳水化合物的酶類，如果膠酶、纖維素酶等，其中大多數(shù)是動物體內(nèi)無法合成的酶。此外，芽孢桿菌抑制大腸桿菌的活動，扭轉(zhuǎn)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化為氨和胺，使糞便和尿液中氨氮的濃度降低，從而達(dá)到除臭功能[4,5]。

目前對巨大芽孢桿菌調(diào)控吲哚和糞臭素產(chǎn)生的研究較少。探究巨大芽孢桿菌制劑對糞臭素產(chǎn)生的影響，采用分子生物學(xué)方法探究其如何影響動物體內(nèi)微生態(tài)平衡具有重要的生產(chǎn)實踐意義。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器

黃淮學(xué)院生物與食品工程實踐實訓(xùn)中心篩選、鑒定、保存的巨大芽孢桿菌（Bacillus megatherium）。

鼓風(fēng)干燥箱（DHG-92410A，常州諾基儀器有限公司）；光照培養(yǎng)箱（MGC-250，上海恒科學(xué)儀器有限公司）；移液槍（Eppendorf，Thermo Fisher Scientific）；立式壓力蒸汽滅菌鍋（LDZX-50KBS，上海申安醫(yī)療器械廠）；超凈工作臺（SWCJ-2ED，蘇凈蘇潔凈化設(shè)備有限公司）；可見光分光光度計（721G，上海儀電分析儀器有限公司）；電子分析天平（FA-1004，鄭州渠通商貿(mào)有限公司）；冰箱（BCD252KU，河南新飛電器有限公司）；真空冷凍干燥機(jī) (D-1A-50，北京博弈康實驗儀器有限公司)；立式壓力蒸汽滅菌鍋（LDZX-50KBS，上海申安醫(yī)療器械廠）。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗動物處理

將從駐馬店建業(yè)市場購得的肉雞在每天的7:00、12:00 和17:00 進(jìn)行飼喂。飼糧的各營養(yǎng)組成和含量如表1。并按表2 進(jìn)行分組并飼喂。

表1 基礎(chǔ)日糧組成與營養(yǎng)水平

表2 各組肉雞巨大芽孢桿菌的添加量

1.2.2 試驗樣品采集

分別在飼喂后0h、24h、36h、48h、72h、96h、120h 定時采集兩組健康肉雞的糞便。在飼養(yǎng)期間，距籠底15cm 處放一塑料布，跟蹤采集塑料布上的直腸鮮糞，立即裝入密封袋中，置-20℃冷凍保存，用于吲哚和糞臭素的測定。

1.2.3 吲哚和糞臭素含量測定

本研究選用對二甲基苯甲醛比色法檢測吲哚和糞臭素。吲哚和糞臭素可溶于熱水，蒸餾時可隨水蒸氣一同揮發(fā)，吲哚和糞臭素中均含有吲哚環(huán)，與試劑中的對二甲基氨基苯甲醛反應(yīng)，出現(xiàn)玫瑰吲哚而呈紅色，玫瑰吲哚在550nm 處有吸收，故選取550nm 作為檢測波長。

1.2.3.1 蒸餾:取8g 糞樣放入500mL 燒瓶中，進(jìn)行蒸餾。圓底燒瓶下方適當(dāng)加熱，以確保燒瓶內(nèi)液體在40～45mL。

1.2.3.2 萃取:采集餾出液180mL。量取100mL 餾出液，置于250mL 分液漏斗中，加入飽和Na2SO4溶液3mL，用30mL三氯甲烷進(jìn)行萃取，搖動2min，靜置分層。放出三氯甲烷層置于另一250mL 分液漏斗中。在三氯甲烷溶液中加入100mL 超純水，1mL 飽和Na2SO4溶液，3mL 稀鹽酸，搖動2min。將三氯甲烷層移入干凈的250mL 分液漏斗中，加入10mL 顯色劑，搖動2min，靜置，分離酸層。

1.2.3.3 測吸光度：移取酸層液18mL 于50mL 容量瓶中，加入20mL 冰醋酸(優(yōu)級純)，混勻，靜置l0min 后，用分光光度計在550nm 波長處測定其吸光度，同時作空白試驗。每組做三個平行試驗。

1.2.3.4 繪制濃度曲線：以時間為橫坐標(biāo)，濃度為縱坐標(biāo)繪制吲哚和糞臭素含量隨時間變化的濃度曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 吲哚含量的測定結(jié)果

通過對二甲氨基苯甲醛法分別測定了試驗組和對照組雞糞中吲哚的含量。結(jié)果如圖1 和表3 所示，試驗組吲哚含量普遍較對照組的低，最高達(dá)13.60μg/g，最低達(dá)到6.58μg/g；而對照組的吲哚含量高達(dá)16.01μg/g。統(tǒng)計學(xué)分析顯示實驗組與對照組的吲哚含量在大部分時間點具有顯著差異。

圖1 吲哚隨喂食時間的變化趨勢

表3 飼喂前后不同時間吲哚的含量

2.2 糞臭素含量的測定結(jié)果

同樣利用對二甲氨基苯甲醛法分別測定了試驗組和對照組雞糞中糞臭素的含量。結(jié)果如圖2 和表4 所示，試驗組糞臭素含量普遍較對照組的低，但相差并不明顯，在喂食后第三天差值達(dá)到最大為16.99μg/g，且具有顯著差異。巨大芽孢桿菌對糞臭素含量產(chǎn)生的影響并不明顯，可能是雞體內(nèi)的酸性環(huán)境不太適合該菌的生長繁殖，致使微生物的調(diào)控功能受限。

圖2 糞臭素隨喂食時間的變化趨勢

表4 飼喂前后不同時間吲哚的含量

3 討論

吲哚(Indole) 和糞臭素(Skatole)是L-色氨酸在單胃動物后腸厭氧微生物作用下產(chǎn)生的主要降解產(chǎn)物。吲哚是由L-色氨酸脫氨基生成吲哚丙酮酸，后者脫α-酮戊二酸直接生成吲哚。其中腸桿菌科(Enterobacteriaceae)中的大腸桿菌(E.coil)、變形菌屬(Proteeae)的普通變形桿菌(Proteus vulgaris)、普羅威登斯菌（Providencia sp.）和摩根菌屬(Morganella sp.)可以形成吲哚。而糞臭素的產(chǎn)生是由L-色氨酸脫氨基生成吲哚丙酮酸，后者在多行擬桿菌和檸檬酸桿菌等微生物的作用下脫羧生成吲哚乙酸，進(jìn)而脫羧形成糞臭素。到目前為止，已知有9 種菌株能夠產(chǎn)生糞臭素：糞味梭菌（Clostridium scatologenes）、疾病梭菌（Clostridium nauseum）、假單胞菌（Pseudomonas）、根瘤菌（Rhizobium sp.）、瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus）、乳酸桿菌11201（Lactobacillus sp.11201）、產(chǎn)糞臭素奧爾森氏菌（Olsenella scatoligenes）、牙齦奧爾森氏菌DSM 7084（Olsenella uli DSM 7084）和扭曲真桿菌（Faecalictena contorta）[6]。Olsenella scatoligenes 是目前已知的唯一從分離到的動物源糞臭素生成菌[7]。

吲哚和糞臭素主要有糞便排出體外，部分通過門靜脈運輸?shù)礁闻K，進(jìn)入肝臟后大部分可被快速代謝，由尿液排出。另有部分吲哚衍生物被結(jié)腸或盲腸末端吸收，繞開肝臟通過腔腸靜脈末端直接進(jìn)入外周血液。據(jù)測量，動物每日的糞臭素吸收量在365～820μmol，吸收量可以根據(jù)日糧而改變。而吲哚的吸收量約為糞臭素的三倍，為929～2999μmol。二者主要在肝臟中進(jìn)行代謝，在腎臟和肺等其他器官中也可進(jìn)行代謝，共分為兩個階段：氧化反應(yīng)階段和共軛反應(yīng)階段[8]。反應(yīng)過程中相關(guān)酶的活性及表達(dá)情況、代謝產(chǎn)物濃度變化反映了糞臭素在肝臟中的分解效率和在組織中的沉積能力，對闡明糞臭素的代謝途徑及提高肉品質(zhì)具有重要的參考價值。

巨大芽孢桿菌能增強(qiáng)機(jī)體內(nèi)酶的活性，使機(jī)體對蛋白質(zhì)的利用率增強(qiáng)，從而減少吲哚和糞臭素的產(chǎn)生[9]。另外，巨大芽孢桿菌能調(diào)節(jié)腸道菌群；減少有害菌群的感染，改善生產(chǎn)性能[10]；芽孢桿菌對其他一些細(xì)菌也有一定的抑制作用[11]。因此，巨大芽孢桿菌可能抑制能夠合成吲哚和糞臭素的相關(guān)細(xì)菌的生長，從而導(dǎo)致吲哚和糞臭素合成受阻。研究表明，巨大芽孢桿菌可以將氨氮作為氮源來進(jìn)行繁殖，且該菌的生長繁殖和氨氮降解同步進(jìn)行[12]。利用吲哚和糞臭素合成自身生長所必需的營養(yǎng)物質(zhì)可能是巨大芽孢桿菌降低二者含量的另一種途徑。

糞臭素在畜禽腸道中是連續(xù)產(chǎn)生的，完全阻止其生成似乎是不切實際的。目前采取的一些物理學(xué)和化學(xué)清除糞臭素的方法有一定的效果，但是這些方法引起的成本、能量消耗及二次污染等問題仍然限制了其應(yīng)用范圍。利用微生物進(jìn)行生物降解與轉(zhuǎn)化成為一種可行的和生態(tài)友好型的清除糞臭素的方法[13,14]。目前發(fā)現(xiàn)具有降解糞臭素能力的菌株多是在厭氧環(huán)境下完成的。厭氧菌降解糞臭素的過程相對較長，且易受氧氣等發(fā)酵環(huán)境的制約，不利于大面積推廣。相應(yīng)地，分離和培養(yǎng)需氧菌對于糞臭素的降解具有重要意義。本研究以好氧菌為研究對象，發(fā)現(xiàn)巨大芽孢桿菌可以一定程度上控制吲哚和糞臭素的產(chǎn)生，這對研發(fā)除臭劑具有重要的理論意義和應(yīng)用。