盧 芳，閆靜思，劉樹民

基于生理及寒熱模型大鼠腸道菌群多樣性變化的淫羊藿藥性歸屬研究

盧 芳1，閆靜思2，劉樹民3*

1. 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)繼續(xù)教育學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040 2. 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，黑龍江 哈爾濱 150040 3. 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，黑龍江 哈爾濱 150040

基于高通量測序技術(shù)探討淫羊藿對生理狀態(tài)及寒熱模型大鼠腸道菌群多樣變化的影響以判斷淫羊藿的藥性歸屬。取SD大鼠40只隨機分為3部分，生理狀態(tài)大鼠、熱證模型大鼠及寒證模型大鼠。生理狀態(tài)大鼠共10只，隨機分為2組：空白組與淫羊藿組（SmQ）；熱證模型大鼠共15只，隨機分為3組：空白組、熱證模型組（RmcM）、熱證模型淫羊藿組（RmcQ）；寒證模型大鼠共15只，隨機分為3組：空白組、寒證模型組（HMmc）、寒證模型淫羊藿組（HQmc）。分別采用優(yōu)樂甲120 mg/kg及冰水游泳方式建立大鼠熱證與寒證模型，SmQ組、RmcQ組和HQmc組自造模第1天起ig淫羊藿提取物（10 mL/kg），空白組給予等量生理鹽水，連續(xù)給藥15 d，之后取大鼠新鮮糞便進行腸道菌群多樣性分析。淫羊藿可引起不同證候大鼠腸道菌群中OTUs數(shù)量、α多樣性及主要菌門豐度的變化，同時通過β多樣性分析可發(fā)現(xiàn)不同樣本間的菌群結(jié)構(gòu)出現(xiàn)顯著性差異；同一樣本間的菌群結(jié)構(gòu)較為相似，表明實驗所獲得的樣本可用于分析腸道菌群的變化。在門水平下，各模型淫羊藿組樣本的擬桿菌門相對豐度均發(fā)生顯著上升，厚壁菌門相對豐度發(fā)生顯著下降，結(jié)合兩菌門所具有的功能可對淫羊藿藥性進行進一步推斷。通過對不同證候大鼠腸道菌群多樣性的綜合分析，生品淫羊藿藥性偏寒涼，這可為臨床合理用藥提供理論依據(jù)。

淫羊藿；腸道菌群；中藥藥性；高通量測序；證候

中藥藥性理論是對中藥性質(zhì)與功能的高度概括，以四氣五味為其核心內(nèi)容，此外還包括升降浮沉、歸經(jīng)、毒性等內(nèi)容[1]。淫羊藿來源于小檗科植物淫羊藿Maxim.、箭葉淫羊藿(Sieb. et Zucc.) Maxim.、柔毛淫羊藿Maxim.或朝鮮淫羊藿Nakai的干燥葉，為臨床常用的補腎藥。淫羊藿首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，其性寒、味辛；而《本草綱目》中，李時珍對淫羊藿的描述為“味甘氣香，性溫不寒，能益精氣”，同時根據(jù)《中國藥典》2020年版記載，淫羊藿性溫，味辛、甘，主入肝、腎經(jīng)，具有補腎陽、強筋骨、祛風(fēng)濕的功效[2]。與最初的記載相比，淫羊藿的藥性描述存在較大變化，因此明確該藥藥性對臨床用藥具有指導(dǎo)作用。中藥的“寒、熱、溫、涼”藥性可通過藥物作用后的機體反映概括得來[3]，而腸道菌群對于維持人體健康具有重要作用，通過對比服藥前后的腸道菌群差異可對藥物的功能及性質(zhì)進行推測。本課題組前期從物質(zhì)及能量代謝的角度對其藥性進行了初步研究[4]，故本實驗以Illumina MiSeq高通量測序平臺為依托，從大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)及多樣性角度著手，研究生品淫羊藿對生理狀態(tài)與寒熱模型大鼠的影響，進一步分析淫羊藿的藥性歸屬，為臨床辨證用藥提供理論依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器與試劑

KDC-160HR型高速低溫離心機（科大創(chuàng)新股份公司），RS232G型紫外分光光度計（Eppendorf公司），AL204電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司），超低溫冰箱（賽默飛世爾科技中國有限公司），YP10001電子稱（上海佑科儀器有限公司），DYY-6C型電泳儀，2720型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）儀（美國ABI公司），gdsAUTO520型凝膠成像系統(tǒng)和32RL117950型臺式紫外分析儀（美國BG公司），F(xiàn)Lx800型多功能酶標(biāo)儀（美國BioTek公司），QuantiFluorTMTBS380型熒光計（美國Promega公司）。

TruSeq Nano DNA LT樣品制備試劑盒（FC-121-4001、FC-121-4002），核酸純化試劑盒（Agencourt AMPure XP Beads，批號A63881）和MiSeq測序試劑盒v2（600-cycles-PE，貨號MS-102-3003）均購自Illumina公司；溴化乙錠 [生工生物工程（上海）股份有限公司，貨號EX328-5 mL]；強力土壤DNA提取試劑盒（美國MoBio，貨號12888）；Q5超保真DNA聚合酶（新英格蘭生物有限公司）；脫氧核糖核苷三磷酸（dNTP，10 mmol/L，上海派森諾生物科技有限公司）；APGX-500G DNA 凝膠回收試劑盒（美國Axygen公司）；文庫檢測及定量試劑盒（Invitrogen公司，批號75510-019）；高靈敏度DNA檢測試劑盒（Agilent公司，批號5067-4626）。

1.2 藥物

淫羊藿藥材購買于世一堂中藥材有限公司，批號為140316，經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源學(xué)教研室王振月教授鑒定為小檗科植物淫羊藿Maxim.的干燥葉。優(yōu)甲樂片（德國默克，批號20160815，規(guī)格50mg×100 片/盒），氯化鈉注射液（吉林省都邦藥業(yè)股份有限公司，批號1509290509）。

1.3 動物

SD雄性大鼠，SPF級，體質(zhì)量（200±20）g，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，動物實驗由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物管理與使用委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號2018043001），許可證編號SCXK（黑）2018-003。標(biāo)準(zhǔn)鼠飼料喂養(yǎng)，自由飲水，所有實驗大鼠的使用嚴格遵守動物保護協(xié)會所規(guī)定的有關(guān)規(guī)定。實驗動物監(jiān)測系統(tǒng)環(huán)境為通風(fēng)、避光、隔音、屏蔽狀態(tài)，采用自動定時光控系統(tǒng)控制大鼠生活環(huán)境的明暗光照（12 h/12 h），室溫（24±3）℃，濕度40%～70%，噪聲≤40 dB，光照強度300 lx。

2 方法

2.1 供試藥液的制備

2.1.1 淫羊藿提取物的制備 淫羊藿提取物由前期實驗所得[5]。提取方法：將淫羊藿生藥材于15倍蒸餾水中回流提取1 h，共2次；合并2次藥液，濾過并減壓濃縮至稠浸膏，出膏率約為21%。依照《中國藥典》2020年版要求對供試藥液進行測定，生品淫羊藿提取物中淫羊藿苷的質(zhì)量分數(shù)為0.53%，根據(jù)成人每日臨床最高用量10 g及出膏率計算大鼠給藥劑量為0.175 g/kg，臨用時以蒸餾水稀釋，制成36 mg/kg的淫羊藿提取物溶液。

2.1.2 優(yōu)甲樂溶液的制備 取優(yōu)甲樂片劑研細，取粉末適量，精密稱定，加入蒸餾水超聲混懸，制成12 mg/mL的優(yōu)樂甲溶液。

2.2 動物分組、造模與給藥

2.2.1 動物的分組 SD大鼠40只隨機分成3部分，供生理狀態(tài)實驗、熱證模型大鼠實驗及寒證模型大鼠實驗用。生理狀態(tài)實驗大鼠隨機分為2組：空白（K）組與淫羊藿組（SmQ），每組5只；熱證模型實驗大鼠隨機分為3組：空白組、熱證模型組（RmcM）、熱證模型淫羊藿組（RmcQ），每組5只；寒證模型實驗大鼠隨機分為3組，包括空白組、寒證模型組（HMmc）與寒證模型淫羊藿組（HQmc），每組5只。

2.2.2 造模及給藥 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后開始造模，熱證模型實驗中的RmcM組與RmcQ組大鼠ig給予120 mg/kg優(yōu)甲樂?？瞻捉M大鼠ig給予等量蒸餾水，1次/d，連續(xù)15 d；寒證模型實驗中的HMmc組與HQmc組大鼠在0 ℃冰水中游泳，當(dāng)大鼠后腿僵直時結(jié)束，1次/d，連續(xù)15 d。SmQ組、RmcQ組和HQmc組大鼠從造模第1天開始ig淫羊藿提取物10 mL/kg，各實驗中的空白組、RmcM組與HMmc組每天ig給予等量蒸餾水，連續(xù)15 d。實驗進行至第14天，將各組大鼠放入實驗動物監(jiān)測系統(tǒng)中24 h，監(jiān)測各組大鼠的氧氣消耗量、CO2呼出量、產(chǎn)熱量及能量轉(zhuǎn)化率。

2.3 樣本采集

末次給藥后，將大鼠麻醉，隨后截取大鼠盲腸段，取其內(nèi)容物即新鮮糞便，于液氮中速凍并保存于超低溫冰箱（?80 ℃）中。

2.4 糞便DNA提取及測序

利用強力土壤DNA提取試劑盒提取各樣本的全部DNA，提取步驟嚴格按照說明書進行，提取結(jié)束后，利用0.8%瓊脂糖凝膠電泳判斷DNA分子大小，并通過紫外分光光度計對DNA進行定量。在干冰條件郵寄至上海派森諾生物科技有限公司進行測序。隨后通過PCR擴增及其產(chǎn)物定量、文庫構(gòu)建、質(zhì)檢與定量獲得合格的文庫，最后在MiSeq機器上進行2×300 bp的雙端測序。得到原始數(shù)據(jù)后，再經(jīng)QIIME軟件與Mothur軟件等進行分析，最終得到各組實驗樣本菌群的分析與處理結(jié)果。

2.5 統(tǒng)計分析

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠基礎(chǔ)代謝情況

結(jié)果表明與空白組相比，淫羊藿對生理狀態(tài)大鼠的基礎(chǔ)代謝無顯著影響。在熱證模型實驗中，RmcM組大鼠的產(chǎn)熱量、CO2呼出量及能量轉(zhuǎn)化率較空白組均顯著升高，表明熱證大鼠造模成功；與RmcM組相比，RmcQ組大鼠的CO2呼出量顯著降低。在寒證模型實驗中，HMmc組大鼠的產(chǎn)熱量、CO2呼出量、氧氣消耗量及能量轉(zhuǎn)化率較空白組均顯著降低；與HMmc組相比，HQmc組大鼠各項指數(shù)未發(fā)生顯著變化。見表1～3。

3.2 淫羊藿提取物對生理狀態(tài)大鼠腸道菌群多樣性的影響

3.2.1 2組大鼠樣本腸道菌群的OTUs（operational taxonomic units）劃分與分析 空白組共有2650個OTUs，獨有1433個OTUs，SmQ組有2099個OTUs，獨有882個OTUs，2組共有1217個OTUs，如圖1所示。與空白組相比，SmQ組OTUs數(shù)量顯著降低。

3.2.2 2組大鼠樣本腸道菌群的α多樣性分析 如圖2-A～C所示，各組樣本的多樣性幾近飽和，表明測序深度足夠，同時各組樣本量已足以反應(yīng)群落的豐富度。將2組樣本的生物多樣性指數(shù)進行比較，如表4所示，與空白組相比，SmQ組的豐富度指數(shù)Chao1與多樣性指數(shù)Shannon均顯著升高（＜0.05、0.01）。

表1 生理狀態(tài)大鼠基礎(chǔ)代謝情況()

表2 熱證模型大鼠基礎(chǔ)代謝情況()

與空白組比較：*＜0.05**＜0.01；與RmcM組比較：#＜0.05

*< 0.05**< 0.01blank group;#< 0.05RmcM group

表3 寒證模型大鼠實驗基礎(chǔ)代謝實驗結(jié)果()

與空白組比較：*＜0.05**＜0.01，表4同

*< 0.05**< 0.01blank group, same as below Table 4

3.2.3 2組大鼠樣本腸道菌群的分類學(xué)組成分析 空白組腸道菌群隸屬于11個門、61個屬，SmQ組腸道菌群隸屬于13個門、63個屬，如圖3所示。結(jié)合圖4進一步分析，與空白組相比，門水平下SmQ組中的厚壁菌門（Firmicutes）和變形菌門（Proteobacteria）豐度水平顯著上調(diào)，放線菌門（Actinobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）和疣微菌門（Verrucomicrobia）豐度水平顯著下調(diào)。屬水平下SmQ組中的棒桿菌屬（＜0.01）、閻氏菌屬（＜0.05）、粘放線菌里斯滕森菌屬（＜0.05）、嗜堿菌屬（＜0.01）、柯林斯氏菌屬（＜0.05）、擬桿菌屬（＜0.01）、副擬桿菌屬（＜0.01）、丁酸弧菌屬（＜0.01）、芽孢桿菌屬（＜0.01）、球菌屬（＜0.01）、腸球菌屬（＜0.01）、乳桿菌屬（＜0.01）、克（＜0.01）、布勞特氏菌屬（＜0.05）、考拉桿菌屬（＜0.01）、糞芽孢菌屬（＜0.01）、霍爾德曼氏菌屬（＜0.05）、薩特氏菌屬（＜0.05）、冷桿菌屬（＜0.05）豐度水平顯著上調(diào)；蘇黎世桿菌屬（＜0.05）、糞球菌屬（＜0.05）、毛螺菌屬（＜0.05）、羅斯拜瑞氏菌屬（＜0.05）、糞桿菌屬（＜0.01）、顫螺旋菌屬（＜0.01）、支原體屬（＜0.01）豐度水平顯著下調(diào)。

圖2 生理狀態(tài)大鼠樣本腸道菌群的稀疏曲線(A)、物種累積曲線(B)、豐度等級曲線(C)

表4 生理狀態(tài)大鼠腸道菌群微生物多樣性指數(shù)()

圖3 生理狀態(tài)大鼠樣本腸道菌群在門(A) 和屬(B) 水平下豐度分布

圖4 生理狀態(tài)大鼠樣本腸道菌群具有顯著差異的菌門

3.2.4 2組大鼠樣本腸道菌群的LEfse（linear discriminant analysis effect size）分析 根據(jù)LEfSe分析，可確定2組間具有豐富度差異的菌群種類，如圖5所示。在空白組中，豐度較高的菌屬有、擬桿菌屬、芽孢桿菌屬、嗜堿菌屬、乳桿菌屬、、克里斯滕森菌屬、、丁酸弧菌屬、糞芽孢菌屬、布勞特氏菌屬、球菌屬、考拉桿菌屬、柯林斯氏菌屬、、副擬桿菌屬、霍爾德曼氏菌屬、棒桿菌屬、薩特氏菌屬、腸球菌屬。在SmQ組中，豐度較高的菌屬有、、、糞球菌屬、糞桿菌屬、羅斯拜瑞氏菌屬、蘇黎世桿菌屬、顫螺旋菌屬、、。

3.2.5 2組大鼠樣本腸道菌群的β多樣性分析 如圖6-A所示，各組樣本基本存在于各自區(qū)域內(nèi)，表明組內(nèi)樣本間的腸道菌群具有較強的相似性。在圖6-B中，組間差異顯著高于組內(nèi)差異，表明2組間樣本的腸道菌群結(jié)構(gòu)多樣性存在明顯差異，即淫羊藿提取物可對生理狀態(tài)大鼠的腸道菌群產(chǎn)生影響。

3.2.6 2組大鼠樣本腸道菌群比較分析 如圖7所示，通過偏最小二乘判別分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA），空白組與SmQ組各自聚類，且2組顯著分開，表明2組間的腸道菌群結(jié)構(gòu)及多樣性具有明顯差異。

3.3 淫羊藿提取物對熱證模型大鼠腸道菌群多樣性的影響

3.3.1 3組大鼠樣本腸道菌群的OTUs劃分與分析 熱證模型實驗共分為3組，其中空白組共有2220個OTUs，獨有498個OTUs，RmcM組共有1643個OTUs，獨有8個OTUs，RmcQ組共有1715個OTUs，獨有11個OTUs，3組共有的OTUs為1531個，如圖8所示。與空白組相比，RmcM組和RmcQ組OTUs顯著降低，但RmcQ具有一定回調(diào)趨勢。

圖5 生理狀態(tài)大鼠樣本腸道菌群的LEfSe多級物種差異判別分析

圖6 生理狀態(tài)大鼠樣本腸道菌群β多樣性分析

圖7 生理狀態(tài)大鼠樣本腸道菌群PLS-DA

RmcQ-熱證模型淫羊藿組 RmcM-熱證模型組，下圖同

3.3.2 3組大鼠樣本腸道菌群的α多樣性分析 如圖9-A～C所示，曲線趨于平坦，表明樣本量足以反應(yīng)群落豐富度，同時測序深度足以反映樣本的多樣性。從圖9-C可以看出RmcM組腸道菌群豐度顯著低于空白組，但RmcQ組豐度曲線介于RmcM組和空白組之間，說明有上調(diào)腸道菌群豐度的作用，可見經(jīng)淫羊藿治療后RmcM組群落的均勻度被拉伸，豐富度顯著增加。與空白組相比，RmcM組Chao1和ACE指數(shù)值有所降低，多樣性指數(shù)無明顯差異。與RmcM組比較，RmcQ組Chao1與ACE指數(shù)值有所回升，但3組間的指數(shù)差異并不具顯著性，見表5。

3.3.3 3組大鼠樣本腸道菌群的分類學(xué)組成分析 空白組腸道菌群隸屬于10個門、50個屬；RmcM組腸道菌群隸屬于8個門、48個屬；RmcQ組腸道菌群隸屬于8個門、49個屬。如圖10所示，在門水平下，空白組、RmcM組、RmcQ組具有顯著性差異的有擬桿菌門、厚壁菌門和疣微菌門，其中RmcQ組擬桿菌門的豐度水平呈上調(diào)趨勢，厚壁菌門和疣微菌門呈下調(diào)趨勢；各組豐度水平排序結(jié)果如下：在擬桿菌門中為RmcQ組＞RmcM組＞空白組；在厚壁菌門中為RmcM組＞空白組＞RmcQ組；在疣微菌門中為空白組＞RmcM組＞RmcQ組。結(jié)合圖11分析，在屬水平下，與空白組相比，RmcM組中考拉桿菌屬（＜0.05）的豐度水平顯著性下降；與RmcM組相比，RmcQ組中嗜堿菌屬與戴沃斯菌屬（＜0.05）的豐度水均顯著下降。

圖9 熱證模型大鼠樣本腸道菌群的稀疏曲線(A)、物種累積曲線(B)、豐度等級曲線(C)

表5 熱證模型實驗菌群微生物多樣性指數(shù)()

圖10 熱證模型大鼠樣本間腸道菌群具有顯著差異的菌門

圖11 熱證模型大鼠樣本腸道菌群屬水平的群落分類豐度分布熱圖

3.3.4 3組大鼠樣本腸道菌群的β多樣性分析 基于UniFrac距離的樣本聚類分析以等級樹的形式表現(xiàn)各組樣本間的相似性，樣本間分支越短，兩樣本越相似，如圖12所示。與RmcM組相比，空白組多數(shù)樣本與RmcQ組樣本間分支長度更短，表明2組間群落結(jié)構(gòu)具有明顯相似性。

3.3.5 3組大鼠樣本腸道菌群比較分析 通過PLS-DA，如圖13所示，空白組、RmcM組、RmcQ組3組各呈類聚現(xiàn)象，且空白組和RmcM組無明顯交叉，表明RmcM組菌群群落有明顯變化，RmcQ組和空白組有所交叉，具有一定共線性，表明對熱證模型大鼠腸道菌群有回調(diào)作用。

3.4 淫羊藿提取物對寒證模型大鼠腸道菌群多樣性的影響

3.4.1 3組大鼠樣本腸道菌群的OTUs劃分與分析 空白組共有2004個OTUs，獨有982個OTUs，HMmc組共有1908個OTUs，獨有14個OTUs，HQmc組共有1907個OTUs，獨有51個OTUs，3組共有的OTUs為822個OTUs，如圖14所示。與空白組相比，HMmc組和HQmc組OTUs顯著降低。

3.4.2 3組大鼠樣本腸道菌群的α多樣性分析 如圖15-A～C所示，測序深度足夠反映群落多樣性，同時各組樣本的OTUs數(shù)量接近實際情況。在圖15-C中可明顯看出空白組群落豐富度最高，但均勻度最差；HQmc組群落豐富度下調(diào)，但群落均勻度顯著增加。與空白組比較，HMmc組Simpson和Shannon指數(shù)顯著升高（＜0.05），Chao1與ACE指數(shù)也有所升高。與HMmc組比較，HQmc組Chao1與ACE指數(shù)有所升高，如表6所示。

圖12 熱證模型大鼠樣本腸道菌群β多樣性分析

圖13 熱證模型大鼠樣本腸道菌群PLS-DA判別分析

HMmc-寒證模型組 HQmc-寒證模型淫羊藿組，下圖同

3.4.3 3組大鼠樣本腸道菌群的分類學(xué)組成分析 在門水平上，空白組腸道菌群隸屬于10個門，45個屬；HMmc組腸道菌群隸屬于9個門，54個屬；HQmc腸道菌群隸屬于9個門，53個屬。如圖16所示，空白組、HMmc組和HQmc組具有顯著性差異的有擬桿菌門、厚壁菌門和變形菌門，其中HQmc組擬桿菌門和變形菌門的豐度水平呈上調(diào)趨勢，厚壁菌門呈下調(diào)趨勢。各組門豐度水平排序結(jié)果如下：在擬桿菌門和變形菌門中HQmc組＞HMmc組＞空白組；在厚壁菌門中空白組＞HMmc組＞HQmc組；在空白組中擬桿菌門和變形菌門豐度水平顯著高于HMmc組與HQmc組。結(jié)合圖17、18進一步分析，在屬水平下，與空白組相比，HMmc組中乳桿菌屬（＜0.05）、布勞特氏菌屬（＜0.05）、擬桿菌屬、棒桿菌屬（＜0.01）、粘放線菌屬（＜0.05）、副擬桿菌屬（＜0.05）、支原體屬（＜0.05）的豐度水平顯著下降，顫螺旋菌屬（＜0.01）、厭氧弧菌屬（＜0.01）的豐度水平顯著上升。與HMmc組相比，HQmc組中擬桿菌屬（＜0.05）、普氏菌屬（＜0.01）的豐度水平顯著上升，乳桿菌屬（＜0.05）的豐度水平顯著下降。

圖15 寒證模型大鼠樣本腸道菌群的稀疏曲線(A)、物種累積曲線(B)、豐度等級曲線(C)

表6 寒證模型大鼠菌群微生物多樣性指數(shù)()

與空白組比較：*＜0.05

*< 0.05blank group

3.4.4 3組大鼠樣本腸道菌群的LEfse分析 如圖19所示，在空白組中豐度較高的菌屬有蘇黎世桿菌屬、、芽孢桿菌屬、嗜堿菌屬、、乳桿菌屬、、、、、、、、棒桿菌屬、、、、閻氏菌屬；在HMmc組中豐度較高的菌屬有支原體屬、、顫螺旋菌屬、、；在HQmc組中豐度較高的菌屬有、擬桿菌屬、、厭氧弧菌屬、、丁酸弧菌屬、普氏菌屬、、、、。

圖16 寒證模型大鼠樣本間腸道菌群具有顯著差異的菌門

圖17 寒證模型大鼠樣本腸道菌群在屬水平下豐度分布

3.4.5 3組大鼠樣本腸道菌群的β多樣性分析 通過PCA主成分分析，可考察各樣本組間群落結(jié)構(gòu)的相似性，如圖20所示，空白組與HMmc組的樣本完全分離，HMmc組與HQmc組的樣本基本分離，3組樣本基本存在于各自區(qū)域內(nèi)，表明寒證及淫羊藿提取物對大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了一定影響。

3.4.6 3組大鼠樣本腸道菌群比較分析 如圖21所示，空白組獨自聚集，HMmc組和HQmc組聚集區(qū)域較為一致，且空白組和HMmc組明顯無交叉，表明HMmc組大鼠菌群群落較空白組有明顯變化。HQmc組和HMmc組大鼠腸道菌群交叉較為集中，且HQmc組大部分被HMmc組所包圍，表明HMmc組大鼠腸道菌群多樣性更為豐富。

圖18 寒證模型大鼠樣本屬水平的群落分類豐度分布熱圖

4 討論與結(jié)論

中醫(yī)認為“入腹方知性”，即中藥經(jīng)口服進入人體后會產(chǎn)生不同的療效，藥物療效與所患病癥之間具有緊密聯(lián)系，借此對中藥的寒熱溫涼進行判斷。本研究選取生理狀態(tài)及寒熱模型狀態(tài)大鼠進行實驗，其中寒熱證模型的建立參考既往研究。熱證模型大鼠以優(yōu)樂甲為造模試劑[6]，造模成功后，大鼠出現(xiàn)體溫升高、大便干燥等癥狀，與實熱證表現(xiàn)的身熱煩躁、大便秘結(jié)、小便短赤等臨床癥狀相符合；寒證模型采用在0 ℃冰水游泳的方式造模[7]，造模成功后，大鼠出現(xiàn)寒顫、蜷縮少動、反應(yīng)遲鈍、大便稀、小便清等癥狀，與中醫(yī)寒證癥狀具有一致性。為模擬服藥過程，實驗采取ig方式給予各組大鼠生品淫羊藿提取物。

本課題組前期基于實驗動物基礎(chǔ)代謝和能量代謝[8]，對炮制前后淫羊藿的藥性歸屬進行了初步研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)生品淫羊藿可顯著降低實驗動物的氧氣吸入量、二氧化碳呼出量及自主活動系數(shù)，并顯著降低大鼠血清中甲狀腺素與促甲狀腺激素的含量；而炮制后的淫羊藿可使實驗動物的產(chǎn)熱量顯著升高，明顯增加大鼠血清中甲狀腺素、琥珀酸脫氫酶、促甲狀腺激素、三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）酶的含量及總抗氧化能力，誘導(dǎo)ATP酶的產(chǎn)生，同時促進ATP氧化分解產(chǎn)生能量，表明生品淫羊藿與炮制品淫羊藿可對機體產(chǎn)生相反的作用。本實驗基礎(chǔ)代謝實驗結(jié)果表明，生品淫羊藿可顯著降低熱證模型大鼠的CO2呼出量，并回調(diào)熱證模型大鼠的產(chǎn)熱量及能量轉(zhuǎn)化率，表明該藥對熱證模型各指標(biāo)具有一定改善作用；但生品淫羊藿干預(yù)寒證模型大鼠后，使其顯著降低的基礎(chǔ)代謝各項指標(biāo)均發(fā)生了同向變化，表明該藥對寒證模型作用較小，結(jié)合前期研究結(jié)果推測生品淫羊藿的藥性偏寒涼。腸道菌群研究結(jié)果表明，生品淫羊藿對不同模型大鼠腸道菌群的OTUs數(shù)量具有不同的調(diào)節(jié)趨勢，可使生理狀態(tài)大鼠腸道菌群OTUs數(shù)量顯著降低；生品淫羊藿干預(yù)熱證模型大鼠后，可明顯回調(diào)熱其顯著下降的OTUs數(shù)量；寒證模型大鼠總體及獨有的OTUs數(shù)量顯著下降，生品淫羊藿對其總體OTUs數(shù)量影響不明顯，但可顯著回調(diào)其獨有的OTUs數(shù)量。同時各組樣本的α多樣性指數(shù)也發(fā)生不同變化，生品淫羊藿使生理狀態(tài)大鼠的Chao1與Shannon指數(shù)顯著升高；在熱證模型實驗中，模型組大鼠的Chao1和ACE指數(shù)有所下降，生品淫羊藿給藥后可回升相應(yīng)指數(shù)，表明該藥可回調(diào)熱證模型大鼠的群落豐富度；在寒證模型實驗中，模型組大鼠腸道菌群的Chao1、ACE、Simpson與Shannon指數(shù)均有所升高，生品淫羊藿干預(yù)后，使寒證模型的Chao1與ACE指數(shù)發(fā)生同向變化，結(jié)合其OTUs數(shù)量進一步分析可知生品淫羊藿雖然對寒證模型的OTUs總量影響較小，但可增加寒證模型大鼠的菌群物種數(shù)，即提高寒證模型的群落豐富度。這些變化表明，生品淫羊藿可抑制生理狀態(tài)大鼠腸道菌群多樣性，回調(diào)熱證模型大鼠腸道菌群多樣性，同向調(diào)節(jié)寒證模型大鼠腸道菌群多樣性，因此推測生品淫羊藿可能具有與熱相反的藥性。

圖19 寒證模型大鼠樣本腸道菌群的LEfSe多級物種差異判別分析

圖20 寒證模型大鼠樣本腸道菌群β多樣性的PCA

圖21 寒證模型大鼠樣本腸道菌群PLS-DA判別分析

另外，通過研究不同分類水平下具有顯著性差異分類單元的豐度變化，發(fā)現(xiàn)在門水平下各模型大鼠腸道菌群主要以擬桿菌門、厚壁菌門與變形菌門為主，生品淫羊藿可使熱證模型大鼠腸道菌群的擬桿菌門豐度水顯著增加，并下調(diào)厚壁菌門的豐度水平，同時使寒證模型大鼠腸道菌群中變形菌門的豐度水平顯著升高。已有研究表明，厚壁菌門與擬桿菌門間的比值與機體健康狀態(tài)密切相關(guān)，兩者比值降低更有利于維持宿主健康。擬桿菌可參與多糖代謝與膽汁酸和類固醇代謝，厚壁菌門可幫助機體從食物中獲得能量[9]，同時2個菌門在腸道中均可代謝碳水化合物產(chǎn)生短鏈脂肪酸，包括丁酸鹽和丙酸鹽，二者可參與機體的脂質(zhì)代謝與葡萄糖代謝[10-11]，對維持機體健康具有重要意義。主要菌門豐度水平的變化結(jié)果提示，生品淫羊藿通過調(diào)節(jié)擬桿菌門與厚壁菌門的豐度水平對熱證模型各指標(biāo)起到一定改善作用，可幫助熱證模型大鼠恢復(fù)并維持健康狀態(tài)，同時厚壁菌門豐度水平的降低提示生品淫羊藿可抑制細胞獲取食物中的能量，降低細胞能量儲藏。

綜上所述，結(jié)合3組實驗所得的基礎(chǔ)代謝實驗結(jié)果與腸道菌群多樣性研究結(jié)果，從腸道菌群的角度出發(fā)推測生品淫羊藿的藥性偏向寒涼，該判斷與課題組前期實驗結(jié)果具有一致性。而《中國藥典》2020年版中記載淫羊藿的藥性為溫，與本實驗所得出的結(jié)果不一致，其原因可能是《中國藥典》中收錄的該藥材為炙淫羊藿（生品淫羊藿切絲后加入已加熱融化的羊脂油中，文火炒至均勻有光澤后取出放涼）。羊脂油性溫，經(jīng)其炮制后淫羊藿的藥性發(fā)生改變，由寒涼轉(zhuǎn)為溫性，溫腎助陽之力增強。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Categorization of drug property ofbased on changes of intestinal microbial flora diversity in physiological and cold-heat syndrome rats

LU Fang1, YAN Jing-si2, LIU Shu-min3

1. School of Continuing Education, Heilongjiang University of Traditional Chinese Medicine, Harbin 150040, China 2. Graduate School of Heilongjiang University of Traditional Chinese Medicine, Harbin 150040, China 3. Institute of Traditional Chinese Medicine, Heilongjiang University of Chinese Medicine, Harbin 150040, China

To explore the effects of crudeon the changes of intestinal flora in physiological state, cold-heat syndrome model rats based on high-throughput sequencing technology, in order to determine the cold and heat properties of.Forty SD rats were randomly divided into three parts, including physiological state rats, heat syndrome model rats, and cold syndrome model rats. Ten rats in physiological state were randomly divided into two groups, including control group andadministration group (SmQ); Fifteen heat syndrome model rats were randomly divided into three groups, including control group, heat syndrome model group (RmcM) andadministration group (RmcQ); Fifteen cold syndrome model rats were randomly divided into three groups including control group, cold syndrome model group (HMmc), andadministration group (HQmc). The heat and cold syndrome model were modeled with 120 mg/kg Euthyrox and ice water at 0℃. Theadministration group was given the extract (10 mL/kg) from the 1st d of modeling, and the control group was treated with equivalent normal saline for 15 d. Finally fresh rat faeces were taken for analysis of intestinal flora diversity.can cause changes in the number of OTUs, the diversity of alpha and the abundance of main bacteria in the intestinal flora of rats with different syndromes. By analyzing the diversity of beta, it can be found that there were significant differences in the structure of the flora between different samples, and the structure of the flora between the same samples was similar, indicating that the samples obtained from the experiment can be used to analyze the changes in the intestinal flora. At the phylum level, the relative abundance of Bacteroidesphylum in theadministration group increased significantly, and the relative abundance of Firmicutesphylum decreased significantly. Combining the functions of the phylum can infer the property of.The analysis of the diversity of the intestinal flora of rats with different syndromes shows that the property ofmaybe belong to the cold property, which provides a theoretical basis for clinical rational use of drugs.

; intestinal flora; traditional Chinese medicine property; high-throughput sequencing; syndrome

R285

A

0253 - 2670(2021)13 - 3954 - 12

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.13.019

2020-11-24

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃（“973”計劃）：利水功效古存今失中藥的藥性研究（2013CB531804）；黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)優(yōu)秀創(chuàng)新人才項目（2018RCL13）

盧 芳，女，博士，副研究員，從事中藥藥性理論及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究。E-mail: lufang_1004@163.com

劉樹民，男，博士生導(dǎo)師，教授，從事中藥藥性及中藥毒性研究。Tel: (0451)82193278 E-mail: keji-liu@163.com

[責(zé)任編輯 潘明佳]