胡佳慧， 王海丞， 黃 潔， 周笑天， 王佐林

（上海牙組織修復(fù)與再生工程技術(shù)研究中心，同濟(jì)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，同濟(jì)大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔種植科，上海 200072）

種植體的存留率與種植體周軟硬組織的狀態(tài)密切相關(guān)，良好的三維植入位置有利于種植體周軟硬組織保持長(zhǎng)期穩(wěn)定。種植體的三維位置包括種植體的唇（頰）舌向[1]、冠根向、近遠(yuǎn)中向[2]。對(duì)于連續(xù)植入的種植體，相鄰2個(gè)種植體間的間距是需要慎重考慮的。Grunder等[3]提出，當(dāng)相鄰的種植體間距≥3 mm時(shí)，種植體間的骨高度與種植體平臺(tái)水平能保持一致，間距＜3 mm時(shí)，則會(huì)發(fā)生骨吸收，繼而造成種植體間齦乳頭退縮。Tarnow等[4]的研究指出，種植體與基臺(tái)連接后，由于生物學(xué)寬度的建立會(huì)產(chǎn)生1.3～1.4 mm的水平性骨吸收，種植體間距過(guò)小時(shí)會(huì)發(fā)生水平性骨吸收的重疊，進(jìn)一步引起嵴頂骨高度的下降。

2018年牙周共識(shí)會(huì)議[5]將種植體周炎定義為以菌斑為始動(dòng)因素的種植體周黏膜炎癥伴持續(xù)進(jìn)展的種植體周骨組織喪失。菌斑生物膜是公認(rèn)的種植體周炎的始動(dòng)因素[6]。菌斑的積累會(huì)造成種植體周?chē)M織的感染,出現(xiàn)局部炎癥現(xiàn)象。臨床對(duì)種植體周炎的診斷主要通過(guò)臨床評(píng)價(jià)指標(biāo)和影像學(xué)結(jié)果來(lái)綜合評(píng)判。目前，種植體周炎的最新臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)為種植體周軟組織有紅腫熱痛、溢膿等炎癥表現(xiàn)，探診出血（BOP），探診深度（PD）較基線值增加或PD≥6 mm及影像學(xué)檢查顯示有骨喪失或骨喪失較基線值≥2 mm[7]。

本實(shí)驗(yàn)按照不同種植體間距在比格犬下頜骨上連續(xù)植入種植體，通過(guò)觀察種植體周軟硬組織的變化，驗(yàn)證不同種植體間距與種植體周炎的相關(guān)性，為臨床工作提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、材料和設(shè)備

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物12月齡健康成年雄性比格犬6只（上海甲干生物科技有限公司，中國(guó)），體質(zhì)量約為12 kg。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)材料種植體（Straumann公司,瑞士）；舒泰50（25 mg/mL唑拉西泮+25 mg/mL替來(lái)他明，Virbac公司,法國(guó)）；陸眠寧Ⅱ（主要成分為鹽酸賽拉嗪，其他成分包括乙二胺四乙酸、鹽酸二氫埃托啡和氟哌啶醇，華牧公司，中國(guó)）；Willanms O型牙周探針（康橋公司，中國(guó)）；阿替卡因腎上腺素注射液、4%多聚甲醛溶液（上?？缮锟萍加邢薰荆袊?guó)）；0.9%氯化鈉溶液、青霉素G鈉（上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，中國(guó)）；樹(shù)脂包埋劑（Kulzer公司，德國(guó)）；Van Gieson（VG）染色液（Solarbio公司,美國(guó)）。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)備和軟件 錐形束CT（CBCT；J.Morita公司，日本）；導(dǎo)板設(shè)計(jì)軟件、光學(xué)掃描儀（3Shape Dental System公司，丹麥）；X線片機(jī)（Dentsply Rinn公司，瑞士）；硬組織切片機(jī)（Exakt300CP公司，德國(guó)）；硬組織磨片機(jī)（Exakt400CS公司，德國(guó)）；體視顯微鏡、照相系統(tǒng)（Nikon公司,日本）。

1.2 方法

1.2.1 犬下頜牙的拔除與數(shù)字化導(dǎo)板的設(shè)計(jì)肌內(nèi)注射舒泰50（0.08 mL/kg）和陸眠寧Ⅱ（0.01 mL/kg），對(duì)6只比格犬行全身麻醉后，拔除其雙側(cè)下頜第二前磨牙至第一磨牙，復(fù)位，縫合（圖1A、1B）。 拔牙后6周拍攝CBCT，同時(shí)精確制取犬上下頜石膏模型，并用光學(xué)掃描儀掃描獲取口腔內(nèi)軟硬組織信息，在導(dǎo)板設(shè)計(jì)軟件中對(duì)種植體的三維位置進(jìn)行設(shè)計(jì)，最終完成并3D打印手術(shù)導(dǎo)板（圖1C、1D）。每一側(cè)連續(xù)植入4枚種植體，并設(shè)置3個(gè)分組，分別為1、2、3 mm的種植體間距。種植體間距定義為2枚植體平臺(tái)外側(cè)緣水平連線的距離。間距位置采用隨機(jī)交叉分組設(shè)計(jì)。

1.2.2 種植手術(shù)過(guò)程拔牙8周后，提前對(duì)比格犬禁水、禁食12 h以上，麻醉方法同1.2.1。數(shù)字化外科導(dǎo)板引導(dǎo)下進(jìn)行種植窩的預(yù)備。每側(cè)平行植入連續(xù)的4枚大顆粒噴砂酸蝕 （sandblasted,large-grit and acid-etched,SLA）表面處理種植體（3.3 mm×8.0 mm），初期穩(wěn)定性均在30～35 N·cm。修整牙槽嵴頂，使種植體平臺(tái)與牙槽嵴頂保持水平，所有種植體均為非潛入式愈合，選擇不同高度的愈合帽確保穿齦高度位于齦上1 mm，并避免與對(duì)頜牙的咬合接觸。用3-0編織縫合線縫合創(chuàng)口。詳見(jiàn)圖1E～1I。術(shù)后連續(xù)7 d肌內(nèi)注射青霉素G鈉（80萬(wàn)U/d），給予軟食。術(shù)后2周拆線。

圖1 比格犬種植模型構(gòu)建流程Figure 1 Procedures of constructing implantation model in beagle dogs

1.2.3 臨床牙周指標(biāo)的記錄術(shù)后2周末為觀察基線點(diǎn)，此時(shí)種植區(qū)域軟組織的術(shù)后反應(yīng)消退，黏膜無(wú)紅腫，傷口達(dá)到一期愈合。測(cè)量并對(duì)比術(shù)后2周、3個(gè)月時(shí)的種植體周臨床牙周指數(shù)，包括菌斑指數(shù)（PI）、探診深度（PD）、探診出血（BOP）陽(yáng)性率。檢測(cè)位點(diǎn)如圖2A、2B所示。其中，PI分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)為無(wú)菌斑（0分）；菌斑肉眼不可見(jiàn)，用探針尖的側(cè)面可刮出菌斑（1分）；菌斑明顯可見(jiàn)（2分）；大量菌斑積聚（3分）。PD是指種植體周的齦溝深度，即齦溝底到牙齦頂點(diǎn)的距離。當(dāng)種植體周?chē)M織健康時(shí)，通常認(rèn)為生理性種植體周PD不應(yīng)超過(guò)3 mm，一般PD≥5 mm表明種植體周?chē)M織可能出現(xiàn)炎癥。BOP分為陽(yáng)性和陰性，具體操作方法為將牙周探針輕探入齦溝或牙周袋內(nèi)，取出探針，10～15 s后觀察有無(wú)牙齦出血，有出血為陽(yáng)性，無(wú)出血為陰性，注意探診壓力不應(yīng)超過(guò)0.25 N。將術(shù)后3個(gè)月時(shí)的PD按照<3 mm、3～5 mm、≥5 mm進(jìn)行分級(jí)，并統(tǒng)計(jì)位點(diǎn)頻數(shù)，同時(shí)對(duì)術(shù)后3個(gè)月時(shí)各分組中出現(xiàn)PD≥5 mm、BOP陽(yáng)性及PI≥2的檢測(cè)位點(diǎn)頻數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和比較。

1.2.4 菌斑的采集和分析術(shù)后3個(gè)月時(shí)進(jìn)行齦周菌斑的采集，以愈合帽頰舌向作為中軸，每間距組取愈合帽靠近間距側(cè)周?chē)木哂洖?個(gè)位點(diǎn)。用干棉球擦拭牙面，隔濕，用金屬牙齦刮治器小心刮取愈合帽對(duì)應(yīng)區(qū)域的菌斑，取出后立即置入含150 μL磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）的無(wú)菌凍存管內(nèi)。將樣本標(biāo)記后于干冰上保存，并于48 h內(nèi)進(jìn)行16S rRNA基因測(cè)序分析。經(jīng)過(guò)微生物組總DNA提取、聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增、文庫(kù)構(gòu)建、上機(jī)測(cè)序和數(shù)據(jù)分析的一系列過(guò)程，最終得到不同分類(lèi)水平的菌群豐度分析結(jié)果，對(duì)菌屬水平的結(jié)果進(jìn)行分析并篩選出排名前100的具有組間表達(dá)差異且與牙周炎癥發(fā)展密切相關(guān)的菌屬。

1.2.5 影像學(xué)觀察和測(cè)量于種植術(shù)后1、2、3個(gè)月時(shí)采用X線片平行投照技術(shù)對(duì)術(shù)區(qū)進(jìn)行影像學(xué)成像，并使用Image J軟件對(duì)數(shù)字化圖像進(jìn)行測(cè)量。種植體間的骨吸收分為2個(gè)部分測(cè)量，分別為邊緣骨吸收（marginal bone resorption，MBR）與嵴頂骨吸收（crestal bone resorption，CBR）。記錄每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各個(gè)位點(diǎn)的MBR和CBR，同時(shí)統(tǒng)計(jì)術(shù)后3個(gè)月時(shí)各分組MBR≥2 mm的位點(diǎn)頻數(shù)。種植體MBR定義為種植體肩臺(tái)（或種植體基臺(tái)連接處）到種植體骨結(jié)合界面最冠方點(diǎn)之間的距離，CBR定義為連接2個(gè)種植體平臺(tái)外側(cè)點(diǎn)的連線中心點(diǎn)到骨嵴頂?shù)拇咕€距離。所有數(shù)據(jù)由同一測(cè)量者不同日重復(fù)測(cè)量3次所得。

1.2.6 硬組織切片和VG染色種植術(shù)后3個(gè)月，將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處死，4%多聚甲醛溶液行內(nèi)固定。樣本經(jīng)過(guò)乙醇梯度脫水后進(jìn)行硬組織切片，最終得到的硬組織切片厚度約為50 μm，按1∶9的比例混合復(fù)紅染色液和PA溶液，配制成VG染色液，根據(jù)切片的著色程度染色0.5～3.0 min；棄去染色液，用95%的乙醇急速分化約數(shù)秒鐘；用二甲苯對(duì)組織進(jìn)行透明，用中性樹(shù)脂封片，體視顯微鏡下觀察并拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 25.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，對(duì)于連續(xù)變量資料選用單因素方差分析（one-way ANOVA test），對(duì)于二分類(lèi)變量資料采用卡方檢驗(yàn)分析，對(duì)于等級(jí)變量資料采用Kruskal-Wallis法秩和檢驗(yàn)分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床觀察與臨床牙周指數(shù)結(jié)果

種植術(shù)后3個(gè)月，臨床檢查可見(jiàn)種植體周角化黏膜質(zhì)地堅(jiān)韌，呈淡粉色，愈合帽周?chē)胁煌穸燃懊娣e的菌斑、軟垢附著，1 mm組間隙內(nèi)較2 mm組、3 mm組有更多的黃白色軟垢堆積。

術(shù)后3個(gè)月時(shí)，3組種植體周PD、BOP、PI結(jié)果均較基線點(diǎn)增加。術(shù)后3個(gè)月時(shí)的統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果顯示，1 mm組的PD明顯大于2 mm組和3 mm組，2 mm組和3 mm組PD的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；相較于2 mm和3 mm組，1 mm組的PD在≥5 mm的級(jí)別中頻數(shù)最多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。術(shù)后3個(gè)月時(shí)，1 mm組的BOP陽(yáng)性率最高，為81%，且明顯大于2 mm組和3 mm組。術(shù)后3個(gè) 月 時(shí)，1 mm組 的PI明 顯大于2 mm組和3 mm組；PI≥2分的位點(diǎn)頻數(shù)也明顯多于其余2組，在PI為2的分級(jí)中，3組頻數(shù)無(wú)明顯差異，而在PI為3的分級(jí)中，1 mm組的頻數(shù)明顯高于2 mm組和3 mm組。詳見(jiàn)圖2和表1。

圖2 臨床觀察和臨床牙周指數(shù)Figure 2 Clinical observation and clinical periodontal indexes

2.2 影像學(xué)觀察與測(cè)量

術(shù)后X線片示，術(shù)后3個(gè)月時(shí)，1 mm組種植體間的骨嵴頂高度較其他2組明顯下降，種植體螺紋與骨交界面影像致密，種植體中下段骨組織影像較致密，靠近嵴頂?shù)墓蔷壝芏容^周?chē)琴|(zhì)低。影像學(xué)測(cè)量結(jié)果示，同一間距組的CBR和MBR均隨著時(shí)間延長(zhǎng)而增加，而隨著間距從1 mm到3 mm，骨吸收的量呈逐漸減少的趨勢(shì)。無(wú)論是CBR還是MBR，1 mm組的骨吸收量均大于2 mm組和3 mm組，且在各時(shí)間點(diǎn)的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但2 mm組與3 mm組在各時(shí)間點(diǎn)的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。詳見(jiàn)圖3。同時(shí)，統(tǒng)計(jì)第3個(gè)月時(shí)各個(gè)分組的MBR，結(jié)果顯示，1 mm組中，MBR≥2 mm的頻數(shù)明顯多于3 mm組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而2 mm與3 mm組間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1）。

表1 臨床牙周指數(shù)和骨吸收量的頻率分布[n（%）]Table 1 Frequency distribution of sites with clinical periodontal indexes and bone resorption[n（%）]

圖3 X線片和骨吸收量的測(cè)量Figure 3 X-ray radiograph and measurement of bone resorption

2.3 菌斑群落結(jié)構(gòu)和多樣性分析結(jié)果

菌斑群落結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示，在菌屬的水平上，總體樣本中排名前5的分別是卟啉菌屬（Porphyromonas）、密螺旋體屬（Treponema）、蒼白桿菌屬（Ochrobactrum）、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）、梭桿菌屬（Fusobacterium）。在3組樣本表達(dá)相對(duì)豐度排名前100的菌屬中，篩選出了4種有表達(dá)差異且與牙周疾病發(fā)展較密切的菌屬，分別是密螺旋體屬（Treponema）、坦納菌屬 （Tannerella）、普氏菌屬（Prevotella）和鏈球菌屬（Streptococcus）。其中，1 mm組的密螺旋體屬（Treponema）、坦納菌屬（Tannerella）和普氏菌屬（Prevotella）含量明顯高于3 mm組，1 mm組的鏈球菌屬（Streptococcus）含量明顯少于3 mm組，2 mm和3 mm組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。詳見(jiàn)圖4。

圖4 種植體間距內(nèi)微生物群落結(jié)構(gòu)分析Figure 4 Microbial community structure analysis of different distance groups

2.4 組織學(xué)觀察結(jié)果

VG染色結(jié)果顯示，3組的種植體和骨組織之間均形成了大面積的緊密接觸。1 mm組種植體-骨交界點(diǎn)到種植體肩臺(tái)的距離較2 mm組和3 mm組大，3 mm組骨嵴頂位置最高，且嵴頂骨皮質(zhì)延續(xù)。1 mm組間距內(nèi)骨小梁相對(duì)2 mm組和3 mm組稀疏，且1 mm組軟組織內(nèi)膠原纖維較少見(jiàn)，2 mm組軟組織內(nèi)膠原纖維排列散在、稀疏，而3 mm組軟組織內(nèi)膠原纖維排列有序、致密，并可見(jiàn)越隔纖維結(jié)構(gòu)。詳見(jiàn)圖5。

圖5 VG染色的組織學(xué)觀察Figure 5 Histological observation by VG staining

3 討論

目前，關(guān)于種植體間距對(duì)骨吸收的影響尚未有共識(shí)性的結(jié)論。Scarano等[8]在實(shí)驗(yàn)中將種植體間距分為2、3、4、5 mm組，除了2 mm組與3 mm組的比較外，其他分組間垂直性骨吸收的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但亦有相關(guān)綜述得出垂直性骨吸收與種植體間距沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)關(guān)聯(lián)的結(jié)論，而且最主要體現(xiàn)在2 mm與3 mm間距的比較中[9]。造成這種爭(zhēng)議可能與不同實(shí)驗(yàn)種植體-基臺(tái)連接方式、動(dòng)物模型或觀察時(shí)間等因素的不一致有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)影像學(xué)測(cè)量結(jié)果表明，CBR和MBR在1 mm組中明顯大于在2 mm組和3 mm組中，而2 mm組與3 mm組的差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí)1 mm組的MBR在≥2 mm級(jí)別的頻數(shù)均明顯高于其他2組，組織學(xué)觀察結(jié)果也說(shuō)明1 mm組的骨吸收最嚴(yán)重。本實(shí)驗(yàn)從骨吸收的角度上說(shuō)明了種植體間距越小，種植體周的炎癥程度就越重，相對(duì)于2 mm和3 mm組，1 mm組更有可能發(fā)生種植體周炎。

我們推測(cè)，本實(shí)驗(yàn)中造成1 mm組骨吸收最明顯的原因主要有兩點(diǎn)。第一，與1 mm組的PI最大有關(guān)，當(dāng)2枚植體距離越近，該位點(diǎn)的口腔自潔能力就越差，菌斑在此大量聚集。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，菌斑的積聚可形成上皮下結(jié)締組織內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，最終的炎性浸潤(rùn)表現(xiàn)與天然牙炎癥表現(xiàn)類(lèi)似[10]，從而加劇種植體間的骨吸收。第二，種植體間距小造成的水平性骨吸收在間距內(nèi)發(fā)生重疊，導(dǎo)致垂直骨高度下降。Tarnow等[4]的回顧性臨床試驗(yàn)表明，種植體間距＜3 mm時(shí)，水平性骨吸收會(huì)造成更進(jìn)一步的嵴頂骨吸收。此外，種植體間距過(guò)小還可能會(huì)造成間距內(nèi)骨組織微結(jié)構(gòu)的改變，包括骨髓腔的減小和骨礦化程度的降低，以及間距內(nèi)血管體積密度的減小[11-12]，這些因素都可能會(huì)削弱骨組織對(duì)炎癥的自身抵抗能力，造成更明顯的骨吸收。骨吸收造成的深種植體周袋也會(huì)進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)菌的定植和繁殖，最終導(dǎo)致種植體周炎的發(fā)生。

PD、PI、BOP都是用于診斷牙周炎和種植體周炎的常用指標(biāo)，BOP陽(yáng)性是種植體周黏膜炎的主要表現(xiàn)之一[13]。在評(píng)價(jià)種植體周健康狀況時(shí)，只有當(dāng)PD變深時(shí)才有參考價(jià)值[7]。PI用來(lái)反映口腔衛(wèi)生狀況，PI越高表明牙周炎癥程度越重。本實(shí)驗(yàn)中，術(shù)后3個(gè)月時(shí)，1 mm組的PD、BOP、PI明顯高于2 mm組和3 mm組，而且統(tǒng)計(jì)PD≥5 mm、BOP陽(yáng)性及PI≥2的位點(diǎn)頻數(shù)后發(fā)現(xiàn)，1 mm組的位點(diǎn)頻數(shù)最高，表明1 mm組較其他2組更容易積聚菌斑，種植體周軟組織的炎癥程度也更嚴(yán)重，而2 mm組和3 mm組之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這從軟組織的角度上說(shuō)明了1 mm的種植體間距更容易發(fā)生菌斑的積聚和種植體周的軟組織炎癥。

有報(bào)道指出，從種植體周炎位點(diǎn)分離的主要細(xì)菌為革蘭陰性桿菌和螺旋體[14]，而健康的種植體周球菌的數(shù)量占據(jù)優(yōu)勢(shì)。與牙周炎最密切相關(guān)的“紅色復(fù)合體”[15]包括牙齦卟啉單胞菌、福塞斯坦納菌、齒垢密螺旋體，這些特定細(xì)菌的增殖可能會(huì)改變特定部位的微生物生態(tài)，導(dǎo)致種植體周炎癥的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)中，在種植體周組織炎癥程度更高的1 mm組中，密螺旋體屬、坦納菌屬和普氏菌屬的相對(duì)豐度較其他2組更高，而鏈球菌屬的相對(duì)豐度較其他2組低。這說(shuō)明種植體間距過(guò)小不僅會(huì)增加間距內(nèi)的菌斑積累量，還可能會(huì)影響一部分與牙周炎癥相關(guān)細(xì)菌的相對(duì)表達(dá)量，進(jìn)而打破宿主和微生物間的動(dòng)態(tài)平衡，造成種植體周組織的破壞。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)證明，相對(duì)于2 mm組和3 mm組，1 mm組PI更大，且發(fā)生了更明顯的軟組織炎癥和骨吸收，而2 mm組和3 mm組PI較小，并未發(fā)生明顯的骨吸收。因此，1 mm間距更容易發(fā)生種植體周炎。種植體間距越小，越容易增加種植體周菌斑的附著，應(yīng)注重口腔衛(wèi)生的維護(hù)，同時(shí)對(duì)種植體周菌斑實(shí)施有效的控制措施，才能減少和阻斷種植體周疾病的發(fā)生。