敬蓉 馮雁京 劉原 張偉 劉聰蕊 和平 柯蕊 趙玉杰 楊妮

1西安交通大學第二附屬醫(yī)院醫(yī)用超聲研究室710004；2西安交通大學第二附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科710004；3西安交通大學第二附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科710004；4西安交通大學第二附屬醫(yī)院全科醫(yī)學710004；5西安交通大學第二附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學科710004；6西安交通大學第二附屬醫(yī)院急診科710004

鮑曼不動桿菌是一種重要的能引起醫(yī)院獲得性感染的機會性病原體,主要在危重住院患者及其周圍環(huán)境中持續(xù)存在并茁壯成長。據(jù)估計,全世界每年有100萬例鮑曼不動桿菌感染,造成15 000人死亡[1]。特別是多重耐藥鮑曼不動桿菌,其可通過多種機制對多種抗生素產(chǎn)生耐藥性[2],因此臨床抗感染治療面臨很大的挑戰(zhàn)。鮑曼不動桿菌的定植和耐藥性與其生物被膜形成能力密切相關(guān)[3-4]。此外,生物被膜可能在鮑曼不動桿菌與宿主的相互作用中發(fā)揮關(guān)鍵作用,生物被膜的形成也促進醫(yī)療器械相關(guān)感染的發(fā)生[4-5]。

鮑曼不動桿菌在非生物表面形成生物被膜主要由csu A/BABCDE伴侶組裝系統(tǒng)介導[5-7],而其合成菌毛的過程又受Bfm RS雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)調(diào)節(jié)。csu A/BABCDE伴侶組裝系統(tǒng)對鮑曼不動桿菌菌毛形成和生物被膜形成至關(guān)重要[8-10]。研究表明,群體感應(yīng)(quorum sensing,QS)系統(tǒng)可以通過增加BfmS和Bfm R基因的轉(zhuǎn)錄來調(diào)節(jié)細菌生物被膜和菌毛的組裝[11]。而且,QS系統(tǒng)的衰減也會導致其他毒力因子表達減弱[12]。因此,阻斷QS系統(tǒng)可能是對抗QS介導的生物被膜相關(guān)鮑曼不動桿菌感染的一種新策略。

呋喃酮C-30是一種新型鹵代呋喃酮化合物,能阻斷QS系統(tǒng),進而減弱細菌的毒力因子。相關(guān)研究證實,使用呋喃酮C-30可以抑制浮游和生物被膜銅綠假單胞菌中的QS系統(tǒng)[13-15]。然而,呋喃酮C-30對鮑曼不動桿菌QS系統(tǒng)所介導的毒力因子的影響鮮有報道。

本實驗研究了低劑量呋喃酮C-30對鮑曼不動桿菌標準菌株ATCC19606體外模型生物被膜形成和菌毛組裝的影響,從而探索治療鮑曼不動桿菌感染的新的策略。

1 材料與方法

1.1 實驗菌株 鮑曼不動桿菌標準菌株ATCC19606購自美國Type Culture Collection公司。以大腸桿菌ATCC25922和銅綠假單胞菌ATCC27853為質(zhì)控菌株。

1.2 主要試劑與儀器 呋喃酮C-30購自美國QCC公司,PCR反應(yīng)體系和分子標準購自日本Ta KaRa公司,引物合成和序列分析由北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司完成。水解酪蛋白瓊脂(MH瓊脂)購自法國梅里埃公司,麥康凱瓊脂粉購自杭州天和微生物有限公司,溴化乙錠為北京奧科公司產(chǎn)品,結(jié)晶紫購自上海中國遠航化工廠。北京凱元信瑞儀器有限公司Mini SC及SC型電泳槽,美國MJ Research公司PTC-200梯度PCR儀,美國Bio-Rad公司GelDoc2000凝膠成像系統(tǒng),美國ABI公司Step One Plus Real Time PCR擴增儀,日本日立公司透射電子顯微鏡H-7650,德國Implen公司ND-1000分光光度計,德國BMG Lab Technologies公司96孔板酶標儀。

1.3 方法

1.3.1 呋喃酮C-30最低抑菌濃度的測定 根據(jù)臨床和實驗室標準研究所指南(2016年),應(yīng)用微量肉湯稀釋法進行測定。選取呋喃酮C-30的濃度上限為512 mg/L,呋喃酮C-30以2倍的稀釋度(0～512 mg/L)加入96孔聚乙烯板中。再向每個孔中加入100μl鮑曼不動桿菌菌懸液(1.5×108CFU/ml)。孵育24 h后,觀察無肉眼可見細菌生長的最低藥物濃度即為呋喃酮C-30對鮑曼不動桿菌ATCC19606菌株的最低抑菌濃度。

1.3.2 呋喃酮C-30對生物被膜形成的影響 制備鮑曼不動桿菌標準菌株ATCC19606菌懸液(1.5×108CFU/ml),實驗組添加10μmol/L呋喃酮C-30,對照組不加,37℃孵育72 h。每24小時更換1次液體。通過測量結(jié)晶紫的OD590來量化生物被膜的形成。本實驗重復14次。

1.3.3 呋喃酮C-30對菌毛結(jié)構(gòu)的影響 透射電鏡觀察呋喃酮C-30對鮑曼不動桿菌菌毛結(jié)構(gòu)的影響。呋喃酮C-30組將鮑曼不動桿菌菌懸液(1.5×108CFU/ml)接種于含呋喃酮C-30(10μmol/L)的培養(yǎng)基；對照組將細菌懸液接種于不含呋喃酮C-30培養(yǎng)基,37℃孵育24 h。細菌浮游菌懸浮液的離心沉淀物用PBS沖洗并用2.5%戊二醛固定24 h。PBS沖洗干凈后,再將樣品置于2%磷鎢酸溶液中染色。用日立H-7650透射電子顯微鏡觀察樣品。

1.3.4 呋喃酮C-30對蹭行運動的影響 應(yīng)用瓊脂糖平板觀察鮑曼不動桿菌ATCC19606的表面運動性。用牙簽挑取單個菌落,分別穿刺接種到含有(10μmol/L)或不含有呋喃酮C-30的MH瓊脂平板的底部。在37℃孵育24 h后,測量瓊脂和底部界面處蹭行區(qū)的直徑。本實驗重復12次。

1.3.5 PCR法檢測菌毛編碼及調(diào)控基因 按照試劑盒說明,提取鮑曼不動桿菌ATCC19606的DNA。按照相關(guān)文獻[11],合成菌毛編碼csu A/BABCDE及調(diào)控基因Bfm RS的引物。建立PCR反應(yīng)體系(25μl),其中2×Taq Mix 12.5μl,模板DNA 2μl,正向引物(10μmol/L)1μl,反向引物(10μmol/L)1μl,滅菌蒸餾水補足至25μl?？瞻讓φ詹患幽０錎NA,加入2μl滅菌蒸餾水。PCR反應(yīng)條件:94℃酶激活、DNA預變性5 min；94℃變性30 s,58℃退火30 s,72℃延伸30 s,共30個循環(huán)；最后72℃延伸5 min。擴增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠上通過電泳分離,并使用GelDoc2000凝膠成像系統(tǒng)可視化。引物序列見表1。

表1 目的基因引物序列

1.3.6 檢測菌毛編碼及調(diào)控基因m RNA表達水平 根據(jù)PCR結(jié)果,8個基因在鮑曼不動桿菌標準菌株ATCC19606中均表達,應(yīng)用實時PCR法進一步驗證。制備鮑曼不動桿菌標準菌株ATCC19606菌懸液(1.5×108CFU/ml),實驗組添加10μmol/L呋喃酮C-30,對照組不加,37℃孵育72 h,刮取生物被膜菌。使用Trizol法制備RNA,并根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明合成c DNA。反應(yīng)條件如上所述。應(yīng)用實時PCR擴增儀獲取相關(guān)基因的擴增及融解曲線。本實驗重復3次。

1.4 統(tǒng)計學分析 應(yīng)用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計分析,采用兩獨立樣本的t檢驗、完全隨機設(shè)計方差分析方法進行統(tǒng)計檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 呋喃酮C-30的最低抑菌濃度 呋喃酮C-30對鮑曼不動桿菌ATCC19606菌株的最低抑菌濃度為64 mg/L。見圖1。

圖1 96孔板微量肉湯稀釋法測定呋喃酮C-30最低抑菌濃度

2.2 呋喃酮C-30對生物被膜形成的影響 結(jié)晶紫染色法觀察呋喃酮C-30處理后鮑曼不動桿菌生物被膜形成數(shù)量的變化。呋喃酮C-30組吸光度值(0.690±0.104)低于對照組(0.997±0.134),差異有統(tǒng)計學意義(t＝8.118,P＜0.001)。見圖2。

圖2 呋喃酮C-30對鮑曼不動桿菌生物被膜的影響

2.3 呋喃酮C-30對菌毛結(jié)構(gòu)的影響 負染色后,應(yīng)用透射電鏡分別在15 000倍和60 000倍的放大倍數(shù)下觀察呋喃酮C-30組及對照組鮑曼不動桿菌菌毛結(jié)構(gòu)。對照組鮑曼不動桿菌周圍有豐富的菌毛樣結(jié)構(gòu),而呋喃酮C-30組鮑曼不動桿菌周圍沒有明顯的菌毛樣結(jié)構(gòu)。見圖3。

圖3 透射電鏡觀察呋喃酮C-30對鮑曼不動桿菌菌毛結(jié)構(gòu)的影響 A、C:對照組；B、D:呋喃酮C-30組 ×15 000(A、B)×60 000(C、D)

2.4 呋喃酮C-30對蹭行運動的影響 瓊脂糖表面運動實驗結(jié)果顯示,呋喃酮C-30組鮑曼不動桿菌ATCC19606蹭行運動能力減低(圖4)。與對照組[(7.675±1.061)mm]相比,呋喃酮C-30組鮑曼不動桿菌蹭行區(qū)直徑[(5.808±0.474)mm]顯著減小(t＝4.306,P＝0.001)。見圖5。

圖4 表面蹭行運動實驗檢測細菌蹭行運動能力 A:對照組；B:呋喃酮C-30組

圖5 2組鮑曼不動桿菌蹭行區(qū)直徑的比較

2.5 PCR法檢測菌毛編碼及調(diào)控基因 PCR結(jié)果顯示鮑曼不動桿菌標準菌株ATCC19606中8個測試基因均呈陽性(圖6)。內(nèi)參基因16sRNA、菌毛編碼基因csu A/BABCDE以及調(diào)節(jié)基因Bfm RS的擴增曲線和融解曲線如圖7～15所示,提示引物特異性較好。實時PCR結(jié)果如表2及圖16所示,呋喃酮C-30下調(diào)了所有測試基因的表達,尤其是csu A/B、csu E、Bfm R基因的表達水平顯著降低,且差異有統(tǒng)計學意義(P值均＜0.05)。

圖16 實時PCR檢測呋喃酮C-30對菌毛編碼及調(diào)節(jié)基因表達的影響

表2 呋喃酮C-30組菌毛編碼及調(diào)節(jié)基因的相對表達量

圖6 PCR檢測鮑曼不動桿菌標準菌株ATCC19606菌毛編碼及調(diào)節(jié)基因

圖7 16sRNA基因的擴增曲線和融解曲線 A:擴增曲線；B:融解曲線

3 討論

圖8 csu A/B基因的擴增曲線和融解曲線 A:擴增曲線；B:融解曲線

圖9 csu A基因的擴增曲線和融解曲線 A:擴增曲線；B:融解曲線

圖10 csuB基因的擴增曲線和融解曲線 A:擴增曲線；B:融解曲線

圖11 csuC基因的擴增曲線和融解曲線 A:擴增曲線；B:融解曲線

圖12 csuD基因的擴增曲線和融解曲線 A:擴增曲線；B:融解曲線

圖13 csuE基因的擴增曲線和融解曲線 A:擴增曲線；B:融解曲線

圖14 BfmS基因的擴增曲線和融解曲線 A:擴增曲線；B:融解曲線

圖15 Bfm R基因的擴增曲線和融解曲線 A:擴增曲線；B:融解曲線

QS系統(tǒng)是細菌的一個重要調(diào)節(jié)系統(tǒng),細菌利用它來協(xié)調(diào)與某些生物行為有關(guān)的基因的表達,如生物被膜的形成、毒力因子的產(chǎn)生和次級代謝物[16-19]。QS系統(tǒng)能夠使細菌更好地適應(yīng)環(huán)境壓力,提高存活率,因此破壞QS系統(tǒng)可能是治療鮑曼不動桿菌感染的一個新的策略[20-23]。QS系統(tǒng)抑制劑是一類新型的藥物,通過抑制或者下調(diào)細菌QS系統(tǒng),干擾其所調(diào)控的相關(guān)毒力表型的表達,包括細菌菌毛的合成和生物被膜的形成。呋喃酮C-30是根據(jù)天然存在的呋喃酮化合物人工合成的一種QS系統(tǒng)抑制劑,具有較強的QS抑制活性,常用作研究QS抑制的陽性對照[24]。關(guān)于呋喃酮C-30對銅綠假單胞菌的作用已有許多相關(guān)文獻[13,25],但對鮑曼不動桿菌的研究尚未見報道。由于銅綠假單胞菌和鮑曼不動桿菌同屬于革蘭陰性菌,具有相似的生物學特性,因此在本研究中使用呋喃酮C-30干擾鮑曼不動桿菌的QS系統(tǒng),并進一步觀察其對菌毛組裝和生物被膜形成的影響。

本研究觀察了呋喃酮C-30對鮑曼不動桿菌菌毛和生物被膜的影響。結(jié)果表明,呋喃酮C-30能夠顯著抑制細菌菌毛樣結(jié)構(gòu)和生物被膜的形成,并能減弱鮑曼不動桿菌的蹭行運動能力。此外,用呋喃酮C-30處理后,鮑曼不動桿菌的菌毛和生物被膜編碼及調(diào)節(jié)基因表達水平下調(diào)。以上結(jié)果表明呋喃酮C-30可抑制鮑曼不動桿菌標準菌株ATCC19606生物被膜和菌毛相關(guān)基因的表達,尤其是csuE和Bfm R基因的表達,從而導致細菌菌毛合成減少、生物被膜形成和蹭行運動能力降低。

菌毛編碼基因csu A/BABCDE在鮑曼不動桿菌標準菌株ATCC19606生物被膜形成中起重要作用。鮑曼不動桿菌的菌毛參與其生物被膜形成過程,在生物被膜形成的初始階段發(fā)揮作用,可以介導鮑曼不動桿菌在表面的黏附以及微菌落的形成。最近的研究表明,csu E的表達能夠調(diào)節(jié)鮑曼不動桿菌標準菌株ATCC19606形成菌毛和在非生物表面形成生物被膜的能力[7]。此外,菌毛編碼基因csu A/BABCDE的表達由雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)調(diào)節(jié),該系統(tǒng)由BfmS編碼的傳感器激酶和BfmR編碼的反應(yīng)調(diào)節(jié)劑組成[10]。基因轉(zhuǎn)錄和翻譯分析表明,Bfm R的失活可以導致csu操縱子的表達缺失,從而導致細菌在非生物表面菌毛產(chǎn)生和生物被膜形成能力的消失[26]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),用呋喃酮C-30處理后,csuE和Bfm R基因的表達水平顯著降低,從而導致細菌菌毛組裝和生物被膜形成減弱。這一結(jié)果表明呋喃酮C-30可能作用于QS系統(tǒng),然后干擾Bfm RS雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)和菌毛編碼基因csu A/BABCDE,最終導致細菌生物被膜和菌毛的合成減少,蹭行運動能力減弱。

本研究的重點是首次闡明呋喃酮C-30與生物被膜形成減少、菌毛組裝和蹭行運動能力之間的關(guān)系。呋喃酮C-30對鮑曼不動桿菌生物被膜形成的抑制作用主要由csuE和BfmR基因調(diào)節(jié)。但是本研究也具有一定的局限性。首先,在此次研究中僅使用鮑曼不動桿菌的標準菌株,后續(xù)需要研究更多的臨床菌株；其次,筆者尚未探討呋喃酮C-30對鮑曼不動桿菌耐藥性的影響。因此,今后需要更多的實驗來進行闡明。

綜上所述,本研究表明呋喃酮C-30能顯著抑制鮑曼不動桿菌菌毛結(jié)構(gòu)和生物被膜的形成,并削弱細菌的蹭行運動能力。呋喃酮C-30對生物被膜形成的抑制作用主要受csuE和BfmR基因的調(diào)節(jié),故它有可能是治療鮑曼不動桿菌感染的潛在藥物,但仍需要進一步研究來探討其臨床應(yīng)用前景。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突