朱 寧，馬曉珊，陳春麗，陳 怡，朱德康

(南方醫(yī)科大學(xué)南海醫(yī)院，廣東 佛山 528244)

阿爾茨海默病是一種神經(jīng)退行性病變，屬于老年癡呆中常見(jiàn)的疾病類(lèi)型之一[1-2]。在臨床上以認(rèn)知功能下降、記憶力減退、社交存在障礙、精神行為異常等為主要臨床癥狀，其中最為常見(jiàn)的臨床癥狀為認(rèn)知功能障礙。目前，關(guān)于阿爾茨海默病的病理學(xué)研究主要集中在β淀粉樣蛋白(β-amyloid，Aβ)能夠通過(guò)多途徑促使腦組織的氧化應(yīng)激狀態(tài)被激活，產(chǎn)生大量活性氧，抑制多種抗氧化酶，產(chǎn)生多種氧化應(yīng)激產(chǎn)物，誘導(dǎo)基因調(diào)控紊亂、線(xiàn)粒體產(chǎn)能障礙、能量代謝異常及形態(tài)學(xué)改變等多種后續(xù)惡性級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，誘發(fā)機(jī)體衰老和認(rèn)知障礙等疾病[3-4]。近年來(lái)，中醫(yī)藥在預(yù)防、治療阿爾茨海默病方面取得了豐富的理論及臨床經(jīng)驗(yàn)[5-6]。基于此，本研究將探討益智醒腦方對(duì)阿爾茨海默病大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及對(duì)白介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)、白介素-6(Interleukin-6，IL-6)、腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)水平的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 12月齡清潔級(jí)老年Wistar大鼠，雄性，共90只，體重(450±20)g，購(gòu)自于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)為SCXK(京)2012-0001。購(gòu)買(mǎi)后寄養(yǎng)于我校實(shí)驗(yàn)室，分籠飼養(yǎng)，相對(duì)濕度控制在50%～70%，溫度(22±2)℃，在實(shí)驗(yàn)期間自由飲食、攝水。

1.2 儀器及試劑 購(gòu)自安徽淮北正華生物儀器設(shè)備公司生產(chǎn)的ZH0065型Morris水迷宮操作系統(tǒng)；北京六一儀器廠生產(chǎn)的DYY-7C型電泳儀；深圳瑞沃德生物儀器設(shè)備有限公司生產(chǎn)的數(shù)字型單臂腦立體定位儀；Sartorius公司生產(chǎn)的BT125D型萬(wàn)分之一電子天平；德國(guó)Leica公司生產(chǎn)的切片、包埋機(jī)、脫水機(jī)；Nikon公司生產(chǎn)的CI-L型生物顯微鏡。武漢博士德生物工程有限公司生產(chǎn)的HRP標(biāo)記兔抗羊二抗(BA1060)、HRP標(biāo)記羊抗兔二抗(BA1051)、HRP標(biāo)記羊抗小鼠二康(BA1051)、42KD(BM0627)，小鼠單抗β-actin；天津市漢中攝影材料廠生產(chǎn)的顯影定影試劑盒；柯達(dá)生產(chǎn)的XBT-1型X線(xiàn)膠片；Thermo生產(chǎn)的NCI5079型ECL底物液；Cell signaling生產(chǎn)的10176-2-AP型100-140KD，兔單抗ASPP；abcam生產(chǎn)的Ab190684型270KD,兔免單抗SorLA；abcam生產(chǎn)的Ab10099型85KD，羊多抗VPS35；Milli-pore生產(chǎn)的IPVH00010型0.45 μm PVDF膜；fermentas生產(chǎn)的26619-1型10-250KD蛋白marker；北京全式金生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的DM111型14-120KD蛋白maeker；Amresco生產(chǎn)的Amresc00761型TEMED；上海酶聯(lián)生物科技有限公司生產(chǎn)的IL-1β、IL-6、TNF-α試劑盒。

1.3 實(shí)驗(yàn)藥物 益智醒腦方組方，黨參18 g，遠(yuǎn)志、枸杞子、生山楂、炒酸棗仁、茯苓各15 g。上述中藥材均由我院中藥房提供。上述藥材用4500 g水浸泡45 min，先用武火煮沸，文火煎煮30 min，將藥液倒出，備用；取1500 g水進(jìn)行二次煎煮，煮20 min后，將兩次藥液混合，濃縮。得到含生藥量2 g/ml的溶液。鹽酸多奈哌齊片(國(guó)藥準(zhǔn)字H20030583)研末，將其制成0.045 mg/ml濃度的水溶液，保存于4 ℃冰箱內(nèi)備用。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 建立模型：90只大鼠飼養(yǎng)7 d后，隨機(jī)分為六組，分別為高劑量益智醒腦方組(高劑量組)、中劑量益智醒腦方組(中劑量組)、低劑量益智醒腦方組(低劑量組)、正常組、模型組及西藥組，每組15只。其中正常組不做處理，其余各組均行Aβ1-42造模，操作方法：將大鼠麻醉后，備皮，固定，于大鼠頭頂中矢狀線(xiàn)做長(zhǎng)約1.5 cm切口，暴露顱骨及前囟，尋找“人”“十”字縫。根據(jù)腦立體定位圖譜，以“十”字縫交叉點(diǎn)為零坐標(biāo)，選擇前囟后4 mm，左右旁開(kāi)3 mm標(biāo)記，針尖對(duì)準(zhǔn)并鉆孔。取2 μl Aβ1-42，將針直刺入4 mm后，注射及留針各5 min，退針、縫合、消毒、青霉素肌注、保暖待蘇醒。

1.4.2 給藥：造模3 d后，模型組及假手術(shù)組分別灌注等體積生理鹽水，高劑量組、中劑量組、低劑量組各組按人與動(dòng)物表面積折算法按照6.8、3.4、1.7 mg/(kg·d)灌胃，西藥組0.45 mg/(kg·d)灌胃，連續(xù)4周。

1.5 標(biāo)本制備及指標(biāo)檢測(cè)

1.5.1 取材方法：采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)后，禁食12 h，對(duì)體重進(jìn)行測(cè)量，6%水合氯醛麻醉后斷頭，將腦快速置于冰盤(pán)，將海馬分離，稱(chēng)重，勻漿，置入2.5 ml EP管，標(biāo)記，存放于-80 ℃冰箱內(nèi)，備用。

1.5.2 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)：上述給藥結(jié)束后，大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。該實(shí)驗(yàn)分為兩部分包括空間探查和定位航行。將凈水注入池內(nèi)，高出平臺(tái)2 cm，大鼠分別從東、西、南、北四個(gè)方向面向池壁置于水中，觀察90 s，對(duì)90 s內(nèi)大鼠找到平臺(tái)的時(shí)間進(jìn)行記錄，若大鼠未找到平臺(tái)，將其引導(dǎo)至平臺(tái)，停留10 s，待其熟悉周?chē)h(huán)境后，將其身體上的水擦干，保暖。對(duì)大鼠進(jìn)行連續(xù)6 d的訓(xùn)練，第7 天進(jìn)行空間探查實(shí)驗(yàn)，將平臺(tái)撤去，再次根據(jù)上述方法將大鼠從東、西、南、北任意位置置于水中，對(duì)大鼠第1次穿過(guò)原平臺(tái)的時(shí)間、90 s內(nèi)跨越原平臺(tái)次數(shù)等進(jìn)行記錄。

1.5.3 淀粉樣前體蛋白(Amyloid precusor protein，APP)、囊泡分揀蛋白35 (Vacuolar protein sorting-35,VPS35)、SorLA的表達(dá)檢測(cè)：取1/2海馬組織，蛋白濃度采用BCA法測(cè)定。將分離膠和濃縮膠配置，上樣，經(jīng)10%SDS-PAGE電泳。采取濕法轉(zhuǎn)移電泳產(chǎn)物。PVDF膜取封閉液浸泡，搖床封閉2 h。采用TBST稀釋并孵育一抗，4 ℃，孵育12 h。37 ℃搖床孵育二抗2 h。洗去二抗。將過(guò)氧化物酶溶液與增強(qiáng)液混勻，將其滴在PVDF膜上，反應(yīng)，覆膜，采用X線(xiàn)膠片壓片后顯影，掃描膠片，膠片灰度值采用BandScan分析。

1.5.4 海馬炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平檢測(cè)：勻漿后另1/2海馬組織采用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定IL-1β、IL-6、TNF-α水平。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠學(xué)習(xí)記憶力比較 見(jiàn)表1。高劑量組及正常組穿越平臺(tái)次數(shù)均高于模型組、西藥組、中劑量組及低劑量組，其中西藥組穿越平臺(tái)次數(shù)高于模型組、中劑量組及低劑量組，中劑量組穿越平臺(tái)次數(shù)均高于模型組及低劑量組，模型組穿越平臺(tái)次數(shù)均高于低劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；高劑量組逃避潛伏期均低于模型組、正常組、西藥組、中劑量組及低劑量組，其中西藥組逃避潛伏期均低于模型組、中劑量組及低劑量組，中劑量組逃避潛伏期均低于模型組及低劑量組，模型組逃避潛伏期低于低劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。高劑量組穿越平臺(tái)次數(shù)及逃避潛伏期與正常組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 各組大鼠學(xué)習(xí)記憶力比較

2.2 各組大鼠APP、VPS35、SorLA的表達(dá)比較 見(jiàn)表2。正常組APP、VPS35、SorLA的表達(dá)高于高劑量組、模型組、西藥組、中劑量組及低劑量組，其中高劑量組APP、VPS35、SorLA的表達(dá)均高于模型組、西藥組、中劑量組及低劑量組，西藥組APP、VPS35、SorLA的表達(dá)均高于模型組、中劑量組及低劑量組，中劑量組APP、VPS35、SorLA的表達(dá)高于模型組及低劑量組，低劑量組APP、VPS35、SorLA的表達(dá)均高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 各組大鼠APP、VPS35、SorLA的表達(dá)比較

2.3 各組大鼠IL-1β、IL-6、TNF-α水平比較 見(jiàn)表3。正常組IL-1β、IL-6、TNF-α水平均低于高劑量組、模型組、西藥組、中劑量組及低劑量組，其中高劑量組IL-1β、IL-6、TNF-α水平低于模型組、西藥組、中劑量組及低劑量組，西藥組IL-1β、IL-6、TNF-α水平低于模型組、中劑量組及低劑量組，中劑量組IL-1β、IL-6、TNF-α水平低于模型組及低劑量組，低劑量組IL-1β、IL-6、TNF-α水平低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表3 各組大鼠IL-1β、IL-6、TNF-α水平比較(pg/ml)

3 討 論

阿爾茨海默病在中醫(yī)學(xué)中屬于“善忘”“呆病”“癡呆”等范疇[7]，該病病機(jī)為髓海不足，神機(jī)失司，其主要病位在腦，腦的主要生理特征為靈機(jī)記性皆在腦、精明之府、清竅之府、髓之海，諸邪蒙蔽清竅或腦失所養(yǎng)會(huì)導(dǎo)致腦部發(fā)生病變，誘發(fā)阿爾茨海默病。腦與脾腎關(guān)系密切，脾胃為氣血生化之源，脾胃虛弱則氣血生化乏源，精血不足則不能滋養(yǎng)腦髓，腦竅失養(yǎng)誘發(fā)該病；腎藏精，生髓，充于腦，腎精不足則無(wú)力滋養(yǎng)腦髓，其中腎精不足分為腎陰不足及腎陽(yáng)不足，腎陰不足則虛火灼傷津液形成痰，痰瘀結(jié)于腦絡(luò)，阻塞腦絡(luò)，造成腦及肢體功能失調(diào)，誘發(fā)癡呆。故治則為健脾益氣、補(bǔ)腎填精。益智醒腦方中黨參具有補(bǔ)中益氣、生津養(yǎng)血之功效；枸杞子具有滋補(bǔ)肝腎，益精明目之功效；生山楂具有消食健胃、活血化瘀之功效；炒酸棗仁具有寧心安神之功效；遠(yuǎn)志具有安神益智之功效；茯苓具有滲濕利水、健脾和胃、寧心安神之功效。諸藥合用共達(dá)滋補(bǔ)肝腎、健脾和胃、安神益智、寧心安神之功效。據(jù)相關(guān)研究證實(shí)[8]，腦室內(nèi)注入Aβ能夠模擬大鼠的學(xué)習(xí)記憶障礙，導(dǎo)致腦內(nèi)Aβ異常沉積及Tau蛋白的過(guò)度磷酸化及損傷中樞膽堿能系統(tǒng)。故通過(guò)Aβ寡聚體建立阿爾茨海默病大鼠模型，是研究Aβ神經(jīng)毒性和阿爾茨海默病通過(guò)藥物治療的最佳模型[9]。以往已有研究證實(shí)[10-11]，中藥方劑能夠抑制海馬神經(jīng)元凋亡，改善阿爾茨海默病大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。本研究結(jié)果顯示，高劑量組及正常組穿越平臺(tái)次數(shù)高于模型組、西藥組、中劑量組及低劑量組，其中西藥組穿越平臺(tái)次數(shù)高于模型組、中劑量組及低劑量組，中劑量組穿越平臺(tái)次數(shù)高于模型組及低劑量組，模型組穿越平臺(tái)次數(shù)高于低劑量組；高劑量組逃避潛伏期低于模型組、正常組、西藥組、中劑量組及低劑量組，其中西藥組逃避潛伏期低于模型組、中劑量組及低劑量組，中劑量組逃避潛伏期低于模型組及低劑量組，模型組逃避潛伏期低于低劑量組。高劑量組穿越平臺(tái)次數(shù)及逃避潛伏期與正常組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以往研究結(jié)果顯示，提示益智醒腦方能夠改善阿爾茨海默病大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，且改善效果與藥物劑量密切相關(guān)。

SorLA屬于VPS10p受體蛋白家族中的一員，其能夠轉(zhuǎn)運(yùn)細(xì)胞膜和細(xì)胞器之間的物質(zhì)[12]。SorLA主要特點(diǎn)為擁有獨(dú)立的功能模塊，該模塊決定了SorLA能夠分選蛋白質(zhì)，其常存在于大腦皮層的椎體細(xì)胞、海馬及小腦的浦肯野細(xì)胞，廣泛分布于周?chē)椭袠猩窠?jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元。VPS35是逆運(yùn)復(fù)合物中貨物識(shí)別亞單元中的關(guān)鍵組成部分，與阿爾茨海默病的相關(guān)神經(jīng)退行性病理生理改變密切相關(guān)[13]。APP是一種110～130 kDa的Ⅰ型跨膜蛋白，正常生理情況下，其具有營(yíng)養(yǎng)和保護(hù)神經(jīng)的作用。但APP進(jìn)入淀粉樣途徑再經(jīng)β內(nèi)切酶剪切后，會(huì)產(chǎn)生神經(jīng)毒性作用的Aβ。故抑制進(jìn)入淀粉樣蛋白途徑的APP，能夠降低Aβ[14-15]。已有研究證實(shí)[16]，SorLA能夠直接與APP合作并與VPS35組成的Retromer共同參與APP的產(chǎn)生及運(yùn)輸，其受體與APP相結(jié)合后，能夠抑制β-水解酶把APP解成Aβ的可能性。本研究結(jié)果顯示，正常組APP、VPS35、SorLA的表達(dá)高于高劑量組、模型組、西藥組、中劑量組及低劑量組，其中高劑量組APP、VPS35、SorLA的表達(dá)高于模型組、西藥組、中劑量組及低劑量組，西藥組APP、VPS35、SorLA的表達(dá)高于模型組、中劑量組及低劑量組，中劑量組APP、VPS35、SorLA的表達(dá)高于模型組及低劑量組，低劑量組APP、VPS35、SorLA的表達(dá)高于模型組，提示益智醒腦方能夠促使阿爾茨海默病大鼠APP、VPS35、SorLA的表達(dá)恢復(fù)正常。這可能是由于益智醒腦方能夠促使更多的APP通過(guò)VPS35構(gòu)成復(fù)合體轉(zhuǎn)運(yùn)到高爾基體內(nèi)，行二次囊泡運(yùn)轉(zhuǎn)，經(jīng)α分泌酶降解后，降低經(jīng)β分泌酶途徑的APP，抑制Aβ的生成；另外，能夠增多進(jìn)入溶酶體途徑的Aβ，促使Aβ清除。但具體機(jī)制需進(jìn)一步研究證實(shí)。

近年研究證實(shí)[17]，在阿爾茨海默病的病理過(guò)程中炎癥因子介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)發(fā)揮了重要作用。其不僅會(huì)誘發(fā)非特異性炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，且能夠引發(fā)機(jī)體內(nèi)的慢性炎癥，且在炎癥過(guò)程中會(huì)誘導(dǎo)大量Aβ沉積，損傷腦部及神經(jīng)系統(tǒng)，故抑制炎癥反應(yīng)在治療阿爾茨海默病中具有重要意義。IL-1β、IL-6、TNF-α是老年斑附近的小膠質(zhì)細(xì)胞核星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放的最主要的炎癥細(xì)胞因子[18-19]。已有研究證實(shí)[20]，Aβ沉積會(huì)誘發(fā)正常腦組織產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，從而釋放炎癥因子包括IL-1β、IL-6、TNF-α，導(dǎo)致腦內(nèi)炎癥微環(huán)境。本研究結(jié)果顯示，正常組IL-1β、IL-6、TNF-α水平低于高劑量組、模型組、西藥組、中劑量組及低劑量組，其中高劑量組IL-1β、IL-6、TNF-α水平低于模型組、西藥組、中劑量組及低劑量組，西藥組IL-1β、IL-6、TNF-α水平低于模型組、中劑量組及低劑量組，中劑量組IL-1β、IL-6、TNF-α水平低于模型組及低劑量組，低劑量組IL-1β、IL-6、TNF-α水平低于模型組，提示益智醒腦方能夠降低阿爾茨海默病大鼠IL-1β、IL-6、TNF-α水平。其具體原因如下：經(jīng)現(xiàn)代藥理學(xué)證實(shí)，黨參具有改善胃潰瘍、增強(qiáng)胃腸動(dòng)力、抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)糖脂代謝、免疫調(diào)節(jié)及抗腫瘤等作用；遠(yuǎn)志寡糖酯類(lèi)成分具有抗癡呆、抗抑郁、神經(jīng)元保護(hù)等中樞藥理活性，其作用機(jī)制與生物信號(hào)的激活進(jìn)而發(fā)揮相應(yīng)的神經(jīng)保護(hù)作用或者抑制凋亡密切相關(guān)；枸杞子具有降血糖、抗脂肪肝、抗腫瘤、抗動(dòng)脈粥樣硬化、延緩衰老、抗應(yīng)激及增強(qiáng)免疫等作用；生山楂具有降血脂、保肝、降壓、助消化、強(qiáng)心、抗氧化、抗腫瘤、抗菌等作用；炒酸棗仁具有鎮(zhèn)靜催眠、抗焦慮、抗抑郁、抗炎和抗驚厥等廣泛的藥理作用；茯苓具有免疫調(diào)節(jié)、利尿、保肝、抗氧化、抗病毒、抗腫瘤等藥理作用。

綜上所述，益智醒腦方能夠改善阿爾茨海默病大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，調(diào)節(jié)APP、VPS35、SorLA的表達(dá)，降低IL-1β、IL-6、TNF-α水平。