瞿 胤，張志君，蘆亞峰，鄭 德，陸 宏，楊 巍

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院，上海201202)

肛門直腸瘺簡稱肛瘺，是指肛門周圍的膿腫潰破或切口引流引起的病變，與膿腫是同一種疾病的兩個(gè)階段[1-2]。肛瘺臨床表現(xiàn)為流膿、疼痛、瘙癢等局部癥狀，且反復(fù)發(fā)作，嚴(yán)重影響患者身心健康和生活質(zhì)量[3-4]。目前，治療手段主要以手術(shù)為主，但術(shù)后也存在創(chuàng)面愈合周期長的難題。中醫(yī)外敷藥物治療瘡瘍由來已久[5]。大量臨床數(shù)據(jù)表明，促愈熏洗方對于肛瘺術(shù)后的創(chuàng)面修復(fù)有良好的療效[6-7]。陳剛等[8]構(gòu)建全層皮膚缺損模型大鼠，發(fā)現(xiàn)促愈熏洗方可抑制炎癥因子水平，促進(jìn)創(chuàng)面的愈合，但其具體作用機(jī)制尚不完全清楚。研究表明，轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)/Smad3信號(hào)通路在創(chuàng)面愈合、瘢痕形成過程中有重要作用[9]。基于此，本研究將從TGF-β1/Smad3信號(hào)通路方面，探究促愈熏洗方在肛瘺術(shù)后創(chuàng)面大鼠模型中的創(chuàng)面修復(fù)效果及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：健康SD大鼠，雄性，清潔級，6～8周齡，體重(200±20)g，由上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(滬)2019-0005。每日更換飼料，自由攝食飲水，室溫22～24 ℃，相對濕度40%～60%。

1.1.2 藥物制備：促愈熏洗方由蒲公英、苦參、 當(dāng)歸、虎杖和五倍子組成：蒲公英、虎杖各30 g，五倍子15 g，苦參、當(dāng)歸各9 g，用水煎煮2次，3 h/次，第1次10倍量水，第2次為5倍量水，去渣存液。

1.1.3 主要試劑與儀器：高錳酸鉀(吉林省東盟制藥)，ELISA試劑盒(南京森貝伽)，蛋白抗體(美國Abcam)；激光多普勒血流儀(英國Moor Instruments)，多功能酶標(biāo)儀(美國Bio-Rad)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組：40只大鼠隨機(jī)分為對照組、肛瘺模型組、促愈熏洗方組和高錳酸鉀組(陽性對照)，每組10只。各組大鼠分籠飼養(yǎng)，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d。

1.2.2 造模與處理：參照文獻(xiàn)采用綜合法建立肛瘺術(shù)后創(chuàng)面大鼠模型[10]，腹腔注射100 mg/kg氯胺酮麻醉大鼠，剃除肛門部手術(shù)區(qū)毛發(fā)備皮并消毒，于肛管旁作直徑2.5 cm圓形皮膚傷口，同時(shí)切開肛管，傷口深達(dá)肌肉層約0.3 cm，止血后在創(chuàng)面加1 ml糞液，并用油紗、敷料和膠帶固定48 h，若傷口有膿性分泌物、糞臭味，提示造模成功。對照組大鼠制作相同的肛門部肌層傷口，但不敷糞液。促愈熏洗方組取藥劑以1∶4稀釋后擦洗大鼠創(chuàng)面，紗布包扎，2次/d。高錳酸鉀組以1∶5000稀釋后擦洗創(chuàng)面，紗布包扎，2次/d。對照組和模型組以生理鹽水擦洗，紗布包扎，2次/d。各組大鼠均連續(xù)干預(yù)14 d。

1.2.3 創(chuàng)面觀察及局部血流監(jiān)測：于術(shù)后3 d和藥物干預(yù)結(jié)束后，采用透明格子膠片測量局部創(chuàng)面面積，創(chuàng)面愈合率=(原始創(chuàng)面面積術(shù)后3 d-當(dāng)前創(chuàng)面面積藥物干預(yù)結(jié)束)/原始創(chuàng)面面積術(shù)后3 d×100%。應(yīng)用激光多普勒血流儀，記錄隨機(jī)3處創(chuàng)面血流情況，并經(jīng)Power Lab Chart數(shù)據(jù)采集分析系統(tǒng)計(jì)算3處創(chuàng)面血流值，取均值為最終結(jié)果。

1.2.4 新生毛細(xì)血管數(shù)檢測：藥物干預(yù)結(jié)束后，取大鼠肛管相近處的肉芽組織，經(jīng)甲醛固定后制成石蠟切片，進(jìn)行免疫組化染色，以CD31抗體標(biāo)記新生毛細(xì)血管，200倍鏡下計(jì)數(shù)棕色新生毛細(xì)血管數(shù)。

1.2.5 血管生長相關(guān)因子和炎癥因子檢測：藥物干預(yù)結(jié)束后，取大鼠肛管相近處的肉芽組織，勻漿分離上清，采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)，操作嚴(yán)格參照ELISA 試劑盒說明，檢測血管生長因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)、促血管生成素Ⅱ(Angiotensin Ⅱ，Ang-Ⅱ)、胰島素樣生長因子1受體(Insulin-like growth factor 1，IGF-1R)、血小板源生長因子(Platelet derived growth factor，PDGF)、白細(xì)胞介素及腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的含量。

1.2.6 TGF-β1/Smad3信號(hào)通路蛋白表達(dá)檢測：藥物干預(yù)結(jié)束后，取大鼠肛管相近處的肉芽組織，加入RIPA裂解液勻漿提取蛋白，各組取等量蛋白進(jìn)行10%SDS-PAGE凝膠分離，轉(zhuǎn)膜后置于脫脂牛奶中封閉2 h，再加入各目的蛋白一抗(TGF-β1 1∶1500、Smad3 1∶1000、p-Smad3 1∶1000)，4 ℃孵育過夜，次日加入相應(yīng)的蛋白二抗(1∶8000)，室溫下孵育1 h，最后暗室曝光掃描條帶，目的蛋白的相對表達(dá)量=目的蛋白條帶灰度值/β-actin蛋白條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠創(chuàng)面情況比較 見表1。與對照組比較，肛瘺模型組創(chuàng)面愈合率、局部血流量和新生毛細(xì)血管數(shù)均降低(P<0.05)；與肛瘺模型組比較，促愈熏洗方組和高錳酸鉀組創(chuàng)面愈合率、局部血流量和新生毛細(xì)血管數(shù)均升高(P<0.05)，且促愈熏洗方組高于高錳酸鉀組(P<0.05)。

表1 各組大鼠創(chuàng)面情況比較

2.2 各組大鼠肉芽組織血管相關(guān)生長因子水平比較 見表2。與對照組比較，肛瘺模型組肉芽組織中VEGF、Ang-Ⅱ、IGF-1R及PDGF表達(dá)均降低(P<0.05)；與肛瘺模型組比較，促愈熏洗方組和高錳酸鉀組VEGF、Ang-Ⅱ、IGF-1R及PDGF表達(dá)均升高(P<0.05)，且促愈熏洗方組高于高錳酸鉀組(P<0.05)。

表2 各組大鼠肉芽組織血管相關(guān)生長因子水平比較

2.3 各組大鼠肉芽組織炎癥因子水平比較 見表3。與對照組比較，肛瘺模型組肉芽組織中IL-6、IL-12、IL-1β及TNF-α表達(dá)均升高(P<0.05)；與肛瘺模型組比較，促愈熏洗方組和高錳酸鉀組IL-6、IL-12、IL-1β 及TNF-α表達(dá)均降低(P<0.05)，且促愈熏洗方組低于高錳酸鉀組(P<0.05)。

表3 各組大鼠肉芽組織炎癥因子水平比較

2.4 各組大鼠肉芽組織TGF-β1/Smad3信號(hào)通路表達(dá)比較 見表4(圖1)。與對照組比較，肛瘺模型組肉芽組織中TGF-β1、p-Smad3/Smad3表達(dá)均下調(diào)(P<0.05)；與肛瘺模型組比較，促愈熏洗方組和高錳酸鉀組TGF-β1、p-Smad3/Smad3表達(dá)均上調(diào)(P<0.05)，且促愈熏洗方組高于高錳酸鉀組(P<0.05)。

表4 各組大鼠肉芽組織TGF-β1/Smad3信號(hào)通路表達(dá)比較

A：對照組；B：肛瘺模型組；C：促愈熏洗方組；

3 討 論

由于肛瘺術(shù)后創(chuàng)口為開放性創(chuàng)口，容易被糞便污染，延長創(chuàng)口愈合時(shí)間，部分患者愈合時(shí)間可能超過4周。目前對于創(chuàng)面愈合延遲的機(jī)制研究較多，普遍認(rèn)為創(chuàng)面的反復(fù)污染引起的持續(xù)性炎癥反應(yīng)，不利于細(xì)胞增殖和組織重塑[11]。因此，減輕炎癥反應(yīng)刺激，促進(jìn)肛周組織細(xì)胞增殖，是促進(jìn)肛瘺術(shù)后創(chuàng)口愈合的重要因素。本研究采用綜合法建立肛瘺術(shù)后創(chuàng)面大鼠模型，符合臨床病理特點(diǎn)[12]。

中醫(yī)認(rèn)為，肛瘺是肛癰潰后余毒結(jié)滯，或臟腑素虛，復(fù)感外邪，腑氣壅阻，化腐成膿而成[13]。促愈熏洗方由蒲公英、苦參、 當(dāng)歸、虎杖和五倍子組成，方中以苦參為君藥，有清熱燥濕之效，臣以虎杖、蒲公英祛風(fēng)利濕、清熱解毒，佐以當(dāng)歸補(bǔ)血活血，五倍子收濕斂瘡，諸藥合用共奏清熱燥濕、活血化瘀之功，可針對肛瘺術(shù)后創(chuàng)面修復(fù)的治療?！夺t(yī)學(xué)流源論》[14]中記載“外科之法最重外治”，表明外治法是中醫(yī)治療皮膚創(chuàng)面類疾病的重要方法。本研究結(jié)果顯示，促愈熏洗方可明顯加速模型大鼠創(chuàng)面的愈合，與既往臨床研究成果相符[15]。

炎癥反應(yīng)與創(chuàng)口血運(yùn)在創(chuàng)面愈合中占據(jù)重要地位。創(chuàng)面愈合過程中，中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等炎性細(xì)胞會(huì)浸潤至損傷部位，分泌合成大量炎性因子IL-6、IL-12、IL-1β及TNF-α等，爆發(fā)級聯(lián)式炎癥反應(yīng)，接著進(jìn)入創(chuàng)傷修復(fù)的細(xì)胞增殖和組織重塑階段，而血管新生是這一階段的關(guān)鍵[16-17]。VEGF、PDGF、表皮生長因子、胰島素樣生長因子等是創(chuàng)傷后愈合最重要的生長因子，而Ang-Ⅱ在創(chuàng)傷后病理性血管生成中有重要的促進(jìn)作用[18-19]。本研究結(jié)果顯示，肛瘺模型大鼠創(chuàng)口局部血流量和新生毛細(xì)血管數(shù)減少，肉芽組織中VEGF、Ang-Ⅱ、IGF-1R及PDGF表達(dá)降低，IL-6、IL-12、IL-1β及TNF-α表達(dá)升高，經(jīng)促愈熏洗方治療后上述指標(biāo)明顯改善，表明促愈熏洗方可降低炎癥因子水平，減輕創(chuàng)面損傷，還可促進(jìn)血管生長相關(guān)因子，加快創(chuàng)面局部血運(yùn)重建，為組織修復(fù)提供營養(yǎng)條件。

TGF-β1被認(rèn)為是成纖維細(xì)胞的強(qiáng)效趨化因子，不僅可調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白合成和降解，還可刺激肉芽組織的形成[20]。創(chuàng)口愈合過程中，TGF-β1可活化TGF-β1受體激酶的底物Smad3，將TGF-β1傳遞至核內(nèi)直接作用于DNA，調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄[21]。本研究中，肛瘺模型大鼠肉芽組織中TGF-β1/Smad3活性明顯受到抑制，經(jīng)促愈熏洗方治療后TGF-β1/Smad3上調(diào)，提示促愈熏洗方可能通過TGF-β1/Smad3信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞增殖，加速創(chuàng)面的愈合。

綜上所述，促愈熏洗方可有效促進(jìn)肛瘺術(shù)后創(chuàng)面大鼠模型的創(chuàng)面愈合，改善局部血流，可能與通過活化TGF-β1/Smad3信號(hào)通路，促進(jìn)血管生長相關(guān)因子表達(dá)，抑制炎癥因子表達(dá)有關(guān)。但促愈熏洗方是否有其他途徑促進(jìn)大鼠肛門部創(chuàng)面愈合，還需要大量實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探究，以期為促愈熏洗方的臨床應(yīng)用提供科學(xué)數(shù)據(jù)支撐。