謝紅月 潘 鵬 胡 艷 張 瑜 羅云彥 胡旭旭 甄 銳 蔣欽楊 黃艷娜

(廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，南寧530004)

高環(huán)境溫度是影響畜禽生長性能的最重要的氣候因素之一[1]。隨著全球氣候變暖的加劇，高溫成為了影響畜牧業(yè)生產(chǎn)的主要威脅之一[2]。當(dāng)生物體遭受高溫時(shí)，熱休克蛋白(heat shock proteins,HSPs)會(huì)迅速合成[2]。休熱克蛋白按分子質(zhì)量的大小分為熱休克蛋白60(heat shock protein 60，HSP60)、熱休克蛋白70(heat shock protein 70，HSP70)、熱休克蛋白90(heat shock protein 90，HSP90)等。熱休克蛋白在應(yīng)激細(xì)胞的存活和內(nèi)部環(huán)境的穩(wěn)定中起著重要作用[3]。同時(shí)，高溫可作為細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)因子。細(xì)胞凋亡是一個(gè)復(fù)雜的過程。細(xì)胞凋亡反應(yīng)由2個(gè)重要的蛋白質(zhì)家族半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)家族和B淋巴細(xì)胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)蛋白家族調(diào)控[4]。已有研究報(bào)道高溫可導(dǎo)致DNA損傷[5-6]和蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊[7]，可引起組織損傷和細(xì)胞凋亡[8]。然而關(guān)于高溫是否會(huì)引起3T3-L1前體脂肪細(xì)胞的凋亡目前鮮有報(bào)道。

脂肪含量對(duì)畜禽肉質(zhì)的感官品質(zhì)具有十分重要的影響[9]。脂肪沉積過程受到多種轉(zhuǎn)錄因子和脂肪分泌因子的級(jí)聯(lián)調(diào)控，其中調(diào)控脂質(zhì)代謝的相關(guān)基因包括脂肪合成基因過氧化物酶體增殖劑激活受體γ(peroxisome proliferators-activated receptor γ，PPARγ)、脂肪酸合成酶(fatty acid synthase，F(xiàn)AS)、乙酰輔酶A羧化酶(acetyl CoA carboxylase，ACC)、脂肪酸結(jié)合蛋白2(fatty acid-binding protein 2，AP2)、CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋α(CCAAT/enhancer-binding protein α，C/EBPα)等，調(diào)控脂肪分解的相關(guān)基因包括激素敏感脂酶(hormone-sensitive triglayceride lipase，HSL)、脂肪甘油三酯脂酶(adipose triglyceride lipase，ATGL)等。研究發(fā)現(xiàn)35 ℃條件下豬皮下脂肪組織中的脂質(zhì)含量增加[10]。在高溫條件下，肉雞皮下脂肪細(xì)胞中脂肪沉積量顯著提高，脂肪合成相關(guān)基因的mRNA表達(dá)量顯著增加[11]。然而，目前尚不清楚高溫在體外3T3-L1前體脂肪細(xì)胞分化模型中的作用以及對(duì)于脂肪合成與分解相關(guān)基因的影響。因此，本試驗(yàn)旨在研究高溫對(duì)3T3-L1前體脂肪細(xì)胞凋亡和分化過程中脂肪沉積的影響，以期為改善高溫對(duì)動(dòng)物福利及畜禽肉品質(zhì)的影響奠定理論基礎(chǔ)，并為預(yù)防由高溫引起的肥胖提供潛在策略。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

3T3-L1前體脂肪細(xì)胞由廣西大學(xué)遺傳育種實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化

將3T3-L1前體脂肪細(xì)胞懸浮于DMEM(Gibco，美國)和10%胎牛血清(FBS，Gibco，美國)中，在37 ℃、5%二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱中孵育，每2 d更換1次培養(yǎng)基，完全融合后，分別在37.0(對(duì)照)和41.5 ℃(高溫處理)條件下用誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基[10%FBS、90%DMEM、1%青霉素/鏈霉素(Sigma-Aldrich，美國)、1 μmol/L地塞米松(Sigma-Aldrich，美國)、10 μg/mL胰島素(Gibco，美國)和0.5 mmol/L異丁基甲基黃嘌呤(Sigma-Aldrich，美國)]培養(yǎng)細(xì)胞，2 d后用10%FBS、90%DMEM和10 μg/mL胰島素替代分化培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至第6天。

1.3 油紅O染色

誘導(dǎo)分化培養(yǎng)6 d后，吸棄培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗細(xì)胞3次后，用10%的福爾馬林溶液固定細(xì)胞10 min，吸棄固定液，用PBS漂洗細(xì)胞3次，加入稀釋好的油紅O溶液(北京索萊寶科技有限公司)，染色20 min后吸棄染料，最后用PBS將多余染液清洗干凈，置于倒置顯微鏡下觀察并拍照。

1.4 總RNA提取及cDNA合成

使用Trizol法提取3T3-L1前體脂肪細(xì)胞中的總RNA，檢測總RNA的濃度和純度后，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa，大連)說明書反轉(zhuǎn)錄成cDNA。反轉(zhuǎn)錄體系為：gDNA Eraser 1 μL、5×gDNA Eraser Buffer 2 μL、總RNA 1 μg，RNase Free H2O補(bǔ)足體系至10 μL，得到Mix1溶液，42 ℃保溫2 min。在Mix1溶液中加入PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅰ 1 μL、5×PrimeScript Buffer Ⅱ 4 μL、RT Primer Mix 1 μL，RNase Free H2O補(bǔ)足體系至20 μL，37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，獲得cDNA，4 ℃保存。

“**”表示差異極顯著(P<0.01)，“***”表示差異極顯著(P<0.001)。圖3、圖5和圖6同。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)

以cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR，反應(yīng)體系為：TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ(TaKaRa，大連)5 μL、上游引物0.25 μL、下游引物0.25 μL、cDNA 2.5 μL、RNase Free H2O 2 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃延伸30 s，45個(gè)循環(huán)，65 ℃延伸5 s，95 ℃再延伸5 min。以18S rRNA為內(nèi)參，依據(jù)2-△△Ct方法計(jì)算目的基因的mRNA表達(dá)量。每個(gè)樣品重復(fù)3次。本試驗(yàn)用到的實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物見表1。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物

續(xù)表1基因 Genes引物序列Primer sequences (5′—3′)產(chǎn)物長度Product length/bp熱休克蛋白90 HSP90[14]F:GTCTCGTGCGTGTTCATTCAR:CATTAACTGGGCAATTTCTGC116半胱天冬氨酸蛋白酶-3 Caspase-3[15]F:TGTCATCTCGCTCTGGTACGR:AAATGACCCCTTCATCACCA201半胱天冬氨酸蛋白酶-9 Caspase-9[16]F:GGTCACGGCTTTGATGGAGATR:CCACCTCAAAGCCATGGTCTT260B細(xì)胞淋巴瘤-2 Bcl-2[17]F:ATGCCTTTGTGGAACTATATGGCR:GGTATGCACCCAGAGTGATGC120Bcl-2相關(guān)X蛋白 Bax[18]F:TGCAGAGGATGATTGCTGACR:GATCAGCTCGGGCACTTTAG173過氧化物酶體增殖劑激活受體γ PPARγ[19]F:GATGGAAGACCACTCGCATTR:AACCATTGGGTCAGCTCTTG115CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋α C/EBPα[13]F:TGGACAAGAACAGCAACGAGR:TCACTGGTCAACTCCAGCAC127脂肪酸合成酶 FAS[13]F:CCCTTGATGAAGAGGGATCAR:ACTCCACAGGTGGGAACAAG115脂肪酸結(jié)合蛋白2 AP2[13]F:TCAGCGTAAATGGGGATTTGGR:GTCTGCGGTGATTTCATCGGA104乙酰輔酶A羧化酶 ACC[19]F:GGCAGCAGTTACACCACATACR:TCATTACCTCAAAATCTCAGCATAGC169脂肪甘油三酯脂酶 ATGL[19]F:ATGGTGCCCTACACGCTGR:GCCTGTCTGCTCCTTTATCC111激素敏感脂酶 HSL[19]F:CTTTGCGGGTATTCGGGAACAR:ATGCTGCGGCGGTTGGA19218S rRNA[19]F:CCCACGGAATCGAGAAAGAGR:TTGACGGAAGGGCACCA122

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SE)表示，并采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)和LSD法多重比較，P<0.05表示差異顯著，P<0.01和P<0.001表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 高溫對(duì)3T3-L1前體脂肪細(xì)胞分化過程中熱休克蛋白家族基因表達(dá)的影響

本試驗(yàn)檢測了熱休克蛋白家族中具有高度保守性的3個(gè)基因HSP60、HSP70、HSP90的mRNA表達(dá)量。由圖1可知，經(jīng)高溫處理6 d后，HSP60的mRNA表達(dá)量是對(duì)照組的1.69倍(P<0.001)；HSP70的mRNA表達(dá)量是對(duì)照組的6.95倍(P<0.001)；HSP90的mRNA表達(dá)量是對(duì)照組的1.13倍(P<0.01)。結(jié)果表明，3T3-L1前體脂肪細(xì)胞經(jīng)高溫處理后，通過高度誘導(dǎo)熱休克蛋白家族基因的表達(dá)來起到自身保護(hù)的作用。

2.2 高溫對(duì)3T3-L1前體脂肪細(xì)胞凋亡的影響

由圖2可知，高溫處理4 d后，顯微鏡下可觀察到細(xì)胞趨于不規(guī)則形態(tài)，在沒有換液的情況下可見死亡細(xì)胞漂浮于培養(yǎng)基中，在表觀上說明高溫可誘導(dǎo)3T3-L1前體脂肪細(xì)胞凋亡。

圖2 高溫對(duì)3T3-L1前體脂肪細(xì)胞凋亡的影響

2.3 高溫對(duì)3T3-L1前體脂肪細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響

由圖3可知，高溫處理4 d后Caspase-3的mRNA表達(dá)量是對(duì)照組的1.14倍(P<0.01)，Caspase-9的mRNA表達(dá)量是對(duì)照組的1.13倍(P<0.01)，Bcl-2/BaxmRNA比值較對(duì)照組極顯著降低(P<0.001)，說明經(jīng)高溫處理后細(xì)胞發(fā)生凋亡。

圖3 高溫處理4 d后凋亡相關(guān)基因的mRNA表達(dá)量

2.4 高溫對(duì)3T3-L1前體脂肪細(xì)胞成脂分化的影響

高溫處理細(xì)胞后，在顯微鏡下觀察高溫對(duì)細(xì)胞誘導(dǎo)分化的情況。由圖4可知，高溫誘導(dǎo)分化6 d時(shí)，脂滴占據(jù)大部分視野，細(xì)胞的分化程度高于對(duì)照組。油紅O染色后可看到細(xì)胞經(jīng)過高溫處理后脂滴數(shù)量明顯增多。

2.5 高溫對(duì)3T3-L1前體脂肪細(xì)胞分化過程中脂肪合成相關(guān)基因表達(dá)的影響

由圖5可知，經(jīng)高溫處理6 d后，PPARγ的mRNA表達(dá)量是對(duì)照組的1.55倍(P<0.001)；AP2的mRNA表達(dá)量是對(duì)照組的3.41倍(P<0.001)；FAS的mRNA表達(dá)量是對(duì)照組的1.36倍(P<0.001)；ACC的mRNA表達(dá)量是對(duì)照組的1.09倍(P<0.01)；CEBPα的mRNA表達(dá)量是對(duì)照組的1.60倍(P<0.001)。上述結(jié)果表明，經(jīng)過高溫處理后，3T3-L1前體脂肪細(xì)胞中脂肪合成相關(guān)基因的表達(dá)量極顯著上調(diào)。

D6表示高溫處理6 d。圖A為在37.0 ℃條件下分化第6天的3T3-L1前體脂肪細(xì)胞；圖B為在37.0 ℃條件下分化第6天的3T3-L1前體脂肪細(xì)胞的油紅O染色圖；圖C為在41.5 ℃條件下分化第6天的3T3-L1前體脂肪細(xì)胞；圖D為在41.5 ℃條件下分化第6天的3T3-L1前體脂肪細(xì)胞的油紅O染色圖。

圖5 高溫處理6 d后脂肪合成相關(guān)基因的mRNA表達(dá)量

2.6 高溫對(duì)3T3-L1前體脂肪細(xì)胞分化過程中脂肪分解相關(guān)基因表達(dá)的影響

由圖6可知，高溫處理6 d后，ATGL和HSL的mRNA表達(dá)量均下降，其中ATGL的mRNA表達(dá)量較對(duì)照組降低了20%(P<0.001)，HSL的mRNA表達(dá)量較對(duì)照組降低了65%(P<0.001)。上述結(jié)果表明，經(jīng)過高溫處理后，3T3-L1前體脂肪細(xì)胞中脂肪分解相關(guān)基因的表達(dá)量極顯著下調(diào)。

圖6 高溫處理6 d后脂肪分解相關(guān)基因的mRNA表達(dá)量

3 討 論

高溫是畜禽養(yǎng)殖業(yè)遇到的最嚴(yán)重的威脅之一。據(jù)報(bào)道，在熱帶或亞熱帶國家，持續(xù)高溫，特別是夏季高溫，是畜禽生產(chǎn)的不利因素。持續(xù)高溫暴露會(huì)降低采食量[20]、生長性能[21]和肉質(zhì)[22-23]。例如，高溫降低了肌內(nèi)脂肪(IMF)沉積[24]，改變了肉的pH[22]。前體脂肪細(xì)胞起源于多潛能干細(xì)胞，并且尚未積累儲(chǔ)存甘油三酯(TG)。脂肪細(xì)胞由前體脂肪細(xì)胞分化而來，占脂肪組織細(xì)胞總數(shù)的1/3～2/3，脂肪細(xì)胞在脂肪組織的發(fā)育中起著決定性的作用，脂肪組織的發(fā)育情況決定了機(jī)體脂肪的沉積與代謝[25]。因此，在細(xì)胞水平上探究高溫對(duì)細(xì)胞凋亡和脂肪沉積與代謝的影響，能夠更清楚地了解其發(fā)生機(jī)理，可為改善高溫對(duì)畜禽的不利影響以及改善肉品質(zhì)提供科學(xué)理論依據(jù)。

細(xì)胞以多種方式對(duì)高溫做出反應(yīng)，如刺激存活途徑或觸發(fā)受損細(xì)胞的死亡，這些應(yīng)激細(xì)胞的初始反應(yīng)有助于細(xì)胞從應(yīng)激狀態(tài)中恢復(fù)[26]。熱休克蛋白的表達(dá)是機(jī)體對(duì)高溫的第一反應(yīng)。熱休克蛋白是一種參與應(yīng)激反應(yīng)的蛋白質(zhì)，它保護(hù)生物體免受壓力的傷害，幫助它們恢復(fù)，從而提高細(xì)胞存活率[27]。高溫會(huì)導(dǎo)致豬背最長肌HSP70和HSP90基因的表達(dá)量增加[2]。高溫條件下肉雞心臟、肝臟和腎臟中HSP60基因的表達(dá)量均上調(diào)[28]。本試驗(yàn)對(duì)HSP60、HSP70、HSP90 3個(gè)基因mRNA表達(dá)量的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高溫極顯著促進(jìn)3個(gè)熱休克蛋白的合成。此外，Wang等[29]在HepG2細(xì)胞上的研究同樣顯示出高溫對(duì)熱休克蛋白合成的促進(jìn)作用。

Caspase家族參與兩大凋亡級(jí)聯(lián)即死亡受體途徑和線粒體途徑，是細(xì)胞凋亡的最終執(zhí)行者。在線粒體途徑中，通過二聚作用激活啟動(dòng)子Caspase-9，活化的Caspase-9蛋白水解激活了劊子手Caspases-3，Caspase-3通常以32 ku的酶原形式存在于細(xì)胞質(zhì)中，在細(xì)胞凋亡的早期被激活。線粒體的完整性也受Bcl-2蛋白家族的控制。Bcl-2蛋白家族中促凋亡(Bax)和抗凋亡成員(Bcl-2)之間相互作用共同調(diào)控細(xì)胞凋亡[30-31]。Bax通過結(jié)合Bcl-2抑制細(xì)胞凋亡。本試驗(yàn)結(jié)果表明，高溫導(dǎo)致Caspase-9和Caspase-3的mRNA表達(dá)量極顯著上調(diào)，Bcl-2/BaxmRNA比值極顯著下降，說明高溫會(huì)引起3T3-L1前體脂肪細(xì)胞的凋亡。

脂滴是參與脂質(zhì)儲(chǔ)存和動(dòng)員的關(guān)鍵細(xì)胞器[32-33]。幾乎所有的細(xì)菌和真核細(xì)胞都能積累中性脂質(zhì)，并將其儲(chǔ)存在脂滴中。脂滴通常呈球形，含有多種中性脂質(zhì)，并被單層磷脂和外周蛋白所包圍[34]。脂滴參與TG的合成，并且在降解TG方面也有重要作用[35]。同時(shí)脂滴可作為前體脂肪細(xì)胞分化成熟的標(biāo)志。Qu等[36]提出，豬皮下脂肪細(xì)胞在41.5 ℃溫度下會(huì)刺激脂滴的形成，并且增加血清中TG含量。本試驗(yàn)通過油紅O染色發(fā)現(xiàn)，高溫能夠明顯促進(jìn)脂滴的生成，從表觀上證明了高溫對(duì)3T3-L1前體脂肪細(xì)胞成脂分化的促進(jìn)作用。研究表明，PPARγ在3T3-L1前體脂肪細(xì)胞中以低水平表達(dá)，在正常細(xì)胞分化條件下被顯著誘導(dǎo)[13]。C/EBPα作為關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，可促進(jìn)FAS和AP2基因的表達(dá)，從而促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化[37]。在分化末期，參與TG代謝的基因AP2、ACC、FAS的表達(dá)量顯著增加，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的形態(tài)發(fā)生改變和脂質(zhì)積累[38]。高溫可顯著提高肉雞肝臟中ACC、FAS和腹脂中FASmRNA的表達(dá)量[39]。另外，41.5 ℃可促進(jìn)豬皮下脂肪細(xì)胞PPARγ和C/EBPα的mRNA表達(dá)，并且在第6天達(dá)到最大值[36]。細(xì)胞內(nèi)的脂解酶包括ATGL和HSL[40-42]。HSL是第1個(gè)被發(fā)現(xiàn)在哺乳動(dòng)物脂肪組織中水解TG的酶。第2個(gè)被發(fā)現(xiàn)的是ATGL，它是催化TG水解的初始步驟，在小鼠和人類的脂肪組織中高表達(dá)，定位于脂滴上[43-45]。研究發(fā)現(xiàn)，高溫降低了豬皮下脂肪組織中ATGL和HSL的mRNA表達(dá)量[46]。本試驗(yàn)檢測了高溫處理6 d后脂肪合成與分解相關(guān)基因的mRNA表達(dá)量，結(jié)果顯示，高溫處理使得PPARγ、AP2、FAS、C/EBPα和ACC的mRNA表達(dá)量被極顯著上調(diào)，ATGL和HSL的mRNA表達(dá)量被極顯著下調(diào)，說明高溫會(huì)促進(jìn)脂肪合成，抑制脂肪分解，最終導(dǎo)致脂質(zhì)積累。油紅O染色的果與此結(jié)論相一致。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，高溫促進(jìn)了熱休克蛋白的表達(dá)，引起了3T3-L1前體脂肪細(xì)胞的凋亡。高溫刺激了脂滴的生成，促進(jìn)了分化過程中參與脂肪生成的多個(gè)基因的表達(dá)，降低了脂肪分解相關(guān)基因的表達(dá)。這些結(jié)果可為高溫期間的3T3-L1前體脂肪細(xì)胞反應(yīng)提供依據(jù)，并為改善高溫對(duì)畜禽肉品質(zhì)的不良影響奠定理論基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

高溫會(huì)引起3T3-L1前體脂肪細(xì)胞的熱休克反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，促進(jìn)脂肪酸的合成，抑制脂肪酸的分解，增加脂質(zhì)累積。