趙 曼 楊國雨 劉永需 劉 磊* 李福昌*

(1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山東省動物生物工程與疾病防治重點(diǎn)實驗室，泰安271018； 2.青島康大食品有限公司，青島266555)

鋅是動物機(jī)體必不可少的礦物元素，廣泛分布于動物體內(nèi)各組織中，在體內(nèi)眾多的生理代謝活動中發(fā)揮作用[1]。研究發(fā)現(xiàn)，鋅不僅參與了動物機(jī)體內(nèi)多種酶的代謝[2]，而且還與動物生長、繁殖、免疫等多種生理過程密切相關(guān)[3]。另外，鋅是很多功能蛋白如受體、核蛋白、金屬硫蛋白等的重要組成成分。由于鋅在生物機(jī)體內(nèi)發(fā)揮的功能非常廣泛，被稱為“生命元素”[4]。Attia等[5]研究發(fā)現(xiàn)，鋅可提高動物的肉品質(zhì)，并可促進(jìn)動物皮毛的生長。白玉恒等[6]研究結(jié)果表明，在陜北白絨山羊飼糧中添加70 mg/kg鋅可顯著促進(jìn)羊絨再生，提高產(chǎn)絨性能。隨著飼糧中鋅水平的提高，藍(lán)狐的絨毛長度和針毛長度逐漸增加[7]。同時，也有研究表明，飼糧中缺鋅會導(dǎo)致動物被毛生長緩慢，降低毛質(zhì)并影響毛皮的經(jīng)濟(jì)價值[8]。而飼糧中嚴(yán)重缺鋅時則會影響動物對氮和硫的吸收，進(jìn)而嚴(yán)重影響被毛生長，甚至出現(xiàn)掉毛以及皮膚損傷等現(xiàn)象[9]。本課題組前期研究結(jié)果表明，飼糧中添加不同水平鋅雖然對生長獺兔的末期體重(FBW)、平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)和料重比(F/G)均沒有顯著影響，但飼糧中添加40、80 mg/kg鋅顯著提高了生長獺兔的皮板厚度、被毛生長及皮張面積[10]。由此可以看出，目前研究者關(guān)于鋅對動物毛皮生長影響的研究結(jié)果比較相似，認(rèn)為鋅可以促進(jìn)動物毛皮生長。中國是家兔生產(chǎn)大國，兔皮和兔毛是兔產(chǎn)業(yè)中十分重要的部分，毛囊密度決定了兔皮品質(zhì)和兔毛產(chǎn)量。雖然通過已有研究可知毛皮動物飼糧中的鋅對被毛的生長和再生發(fā)揮著重要作用，但關(guān)于鋅對毛囊發(fā)育的調(diào)控機(jī)制還不明確。鑒于此，本試驗通過在基礎(chǔ)飼糧添加不同水平的鋅，研究飼糧中鋅添加水平對獺兔毛囊發(fā)育及相關(guān)基因表達(dá)的影響，以期闡明飼糧中鋅對獺兔毛囊發(fā)育的影響機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗動物分組及飼養(yǎng)管理

飼養(yǎng)試驗在山東農(nóng)業(yè)大學(xué)南校區(qū)科技試驗站進(jìn)行。選取160只3月齡的健康獺兔，采用單因素隨機(jī)區(qū)組設(shè)計，將試驗獺兔隨機(jī)分為4組，每組40個重復(fù)，每個重復(fù)1只。在基礎(chǔ)飼糧中以硫酸鋅的形式添加鋅制備試驗飼糧，4組獺兔分別飼喂鋅添加水平為0、40、80、120 mg/kg的試驗飼糧，飼糧中鋅含量實測值分別為9.7、49.4、87.0和127.4 mg/kg?；A(chǔ)飼糧參照NRC(1977)[11]生長兔飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)配制而成，其飼料組成及營養(yǎng)水平見表1?；A(chǔ)飼糧中氨基酸含量為參考《中國飼料成分及營養(yǎng)價值表(2007年第18版)》[12]中各飼料原料氨基酸含量所得計算值。試驗前將試驗環(huán)境徹底清洗消毒，采用常規(guī)免疫程序，試驗兔單籠飼養(yǎng)，期間保持自然采光、通風(fēng)，07:30和16:30各飼喂1次，自由采食和飲水。飼養(yǎng)試驗開展日期為2017年10月9日至2017年12月4日，共56 d，其中預(yù)試期7 d，正試期49 d。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1.2 樣品采集及制備

在飼養(yǎng)試驗結(jié)束后，每組隨機(jī)選取8只試驗兔。在試驗兔的肩、背、臀處分別采集皮膚組織樣品，一部分立即置于液氮中保存，用于基因表達(dá)的測定；一部分置于多聚甲醛溶液中固定，用于毛囊密度(肩、背、臀處的平均值)的測定。

1.3 毛囊密度測定

將采集的皮膚組織樣品采用蘇木精-伊紅(HE)染色法染色制作石蠟切片[13]，并在顯微鏡下進(jìn)行圖像觀察與分析，計算毛囊密度[14]。

1.4 總RNA的提取與基因表達(dá)

表2 反轉(zhuǎn)錄體系組成

表3 相關(guān)基因的引物序列

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)用平均值、均方根誤差表示，采用SAS 9.1.3統(tǒng)計軟件的ANOVA程序進(jìn)行單因素方差分析，采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼糧中鋅添加水平對生長獺兔毛囊密度的影響

由表4可知，與對照組相比，飼糧中添加40和80 mg/kg鋅時獺兔的毛囊密度顯著升高(P<0.05)，飼糧中添加120 mg/kg鋅對獺兔的毛囊密度無顯著影響(P>0.05)。

表4 飼糧中鋅添加水平對生長獺兔毛囊密度的影響

2.2 飼糧中鋅添加水平對生長獺兔毛囊發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)的影響

由表5可知，與對照組相比，飼糧中鋅添加水平為40和80 mg/kg時獺兔的神經(jīng)誘導(dǎo)蛋白(Noggin)基因的相對表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，骨形態(tài)發(fā)生蛋白4(BMP4)基因的相對表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，而飼糧中鋅添加水平為120 mg/kg時獺兔的Noggin基因的相對表達(dá)量無顯著變化(P>0.05)，BMP4基因的相對表達(dá)量顯著升高(P<0.05)。飼糧中添加不同水平鋅對獺兔的胞外基質(zhì)蛋白多糖(Versican)、堿性磷酸酶(ALP)、肝細(xì)胞生長因子(HGF)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(BMP2)和胰島素樣生長因子-1(IGF-1)基因的相對表達(dá)量均沒有顯著影響(P>0.05)。

表5 飼糧中鋅添加水平對生長獺兔毛囊發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)的影響

3 討 論

3.1 飼糧中鋅添加水平對生長獺兔毛囊密度的影響

已有研究結(jié)果證明，鋅可以在轉(zhuǎn)錄水平上直接作用于基因調(diào)節(jié)蛋白，從而調(diào)控基因的特異性表達(dá)[16]。在動物毛囊的生長過程中，鋅通過調(diào)節(jié)毛囊發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)和催化動物機(jī)體毛囊生長，從而調(diào)控被毛的生長發(fā)育[17]。閆海亮[18]研究發(fā)現(xiàn)，在獺兔飼糧中添加蛋氨酸鋅能夠提高獺兔的被毛密度及被毛質(zhì)量。本課題組前期研究結(jié)果也表明，在生長獺兔飼糧中以硫酸鋅形式添加鋅顯著促進(jìn)了獺兔被毛的生長[10]。同時，鋅在其他毛皮動物上也有相似的結(jié)果，補(bǔ)充鋅后顯著提高了山羊的產(chǎn)毛量，促進(jìn)了其被毛生長[19-21]。藍(lán)狐[7]、銀狐[22]的針毛長度、絨毛長度也隨飼糧中鋅添加水平的提高而有所增加。Plonka等[23]利用C57BL/6小鼠毛發(fā)研究模型進(jìn)行試驗后發(fā)現(xiàn)，大劑量口服鋅能夠顯著抑制小鼠毛發(fā)生長。本試驗結(jié)果與前人的研究結(jié)果一致，表明適宜劑量的鋅能夠促進(jìn)動物的毛囊發(fā)育，這可能與下文提到的適宜劑量的鋅促進(jìn)獺兔毛囊發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)有關(guān)。

3.2 飼糧中鋅添加水平對生長獺兔毛囊發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)的影響

Versican主要存在于細(xì)胞外基質(zhì)中，是一種大分子質(zhì)量的硫酸軟骨素蛋白多糖，在細(xì)胞黏附、遷移、增殖和分化中起重要作用[24]。有研究表明，Versican參與毛發(fā)形態(tài)的發(fā)生、毛發(fā)生長的維持和毛發(fā)再生的啟動等過程[25]。Soma等[26]研究發(fā)現(xiàn)Versican在毛囊真皮乳頭的不同生長階段表達(dá)量不同，在生長期表達(dá)量增加，而在退化期表達(dá)量明顯下降。近期的研究表明，在臨床中口服Versican蛋白聚糖的提取物可顯著減少脫發(fā)，促進(jìn)毛發(fā)生長[27]。ALP可作為毛乳頭誘導(dǎo)毛囊形成能力的一項重要指標(biāo)。有研究表明，小鼠真皮毛乳頭細(xì)胞中高表達(dá)ALP能誘導(dǎo)毛囊的再生重建[28]。鋅是ALP活性中心的組成成分，并參與ALP的激活。有研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)鋅后顯著增強(qiáng)了獺兔[29]與雛鴨[30]血清中ALP的活性，在300、500、800 mg/kg的高鋅范圍內(nèi)，高鋅組奶牛血清ALP活性也得到顯著提高[31]。HGF是一種多肽類的生長因子，研究表明HGF能夠明顯促進(jìn)體外培養(yǎng)毛囊的生長發(fā)育[32]。Jindo等[33]的研究發(fā)現(xiàn)，在體外培養(yǎng)小鼠觸須毛囊的試驗中，10 μg/mL HGF對小鼠毛發(fā)生長有明顯的促進(jìn)作用，DNA合成能力增強(qiáng)。過表達(dá)HGF的轉(zhuǎn)基因小鼠的毛囊數(shù)量呈現(xiàn)顯著增加，毛囊發(fā)育提前，退化期顯著推遲[34]。本試驗中，飼糧中添加不同水平鋅對生長獺兔Versican、ALP、HGF基因的相對表達(dá)量均無顯著影響，這些基因都參與毛囊生長發(fā)育過程，該結(jié)果表明鋅促進(jìn)獺兔毛囊發(fā)育可能并不是通過Versican、ALP、HGF基因發(fā)揮調(diào)節(jié)作用來實現(xiàn)的。IGF-1被證明能夠與其結(jié)合蛋白相互作用進(jìn)而刺激毛囊增殖，維持毛發(fā)的初期生長[35]。飼糧中添加43.57 mg/kg鋅后顯著升高了鵝毛囊中IGF-1基因的表達(dá)量[17]。補(bǔ)充乳酸鋅后肉兔血清中IGF-1基因的表達(dá)量也得到提高[36]。本試驗中，飼糧中添加不同水平鋅對生長獺兔IGF-1基因的相對表達(dá)量沒有產(chǎn)生顯著影響，這與上述前人的研究結(jié)果不一致。動物對不同鋅源的生物學(xué)利用率不同，在不同組織中的消化吸收效率也有很大差異[37]，而飼糧中的鈣、植酸等營養(yǎng)成分也會影響機(jī)體對鋅的吸收[38]，這可能是造成研究結(jié)果不一致的原因。而鋅對不同物種的靶向調(diào)控機(jī)制不同，且不同組織中的毛囊增殖能力和毛囊生長的調(diào)控機(jī)制也存在差異，具體原因仍需進(jìn)一步探究。骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)信號通路在毛囊形態(tài)發(fā)生發(fā)育過程中起抑制性作用，被稱為毛囊生長期啟動的抑制劑[39]，主要通過抑制毛囊基板的形成而使毛囊由退行期向休止期轉(zhuǎn)化[40]。研究發(fā)現(xiàn)，BMP2基因在低被毛密度獺兔中的表達(dá)量顯著高于高被毛密度獺兔[41]，而休止期的絨山羊皮膚毛囊中BMP2基因的表達(dá)量是興盛期的27.8倍，BMP2能夠抑制內(nèi)蒙古絨山羊毛囊發(fā)育，主要在絨山羊皮膚毛囊的毛干周圍發(fā)揮作用[42]。由此可見，BMP2在毛囊生長周期的不同階段特異性表達(dá)，能夠維持毛囊處于休止期，從而影響毛囊的形態(tài)發(fā)生。BMP4基因在出生后毛囊發(fā)育過程中主要起抑制作用[43]，毛囊細(xì)胞保持在休止期的關(guān)鍵就在于BMP4基因?qū)γ壹?xì)胞生長的抑制[44]。Noggin是目前已確認(rèn)的參與神經(jīng)元再生的重要蛋白，可以誘導(dǎo)神經(jīng)元的再生[45]。Botchkarev等[46]研究表明，Noggin在機(jī)體胚胎時期的毛囊真皮毛乳頭中表達(dá)，能夠激活毛囊上皮細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)毛囊的生長。Noggin的缺失會減慢毛囊的生長周期和減少毛囊數(shù)量[47-48]。Noggin是BMP的拮抗體，可以與BMP2和BMP4結(jié)合，從而抑制BMP信號通路[49-50]。在胚胎期的毛囊形成初期，Noggin能夠解除毛囊基板細(xì)胞中BMP對緊鄰的毛囊上皮細(xì)胞中Wnt信號的抑制作用，進(jìn)而激活毛囊基板上皮細(xì)胞的增殖[51]。Noggin對BMP的負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用誘導(dǎo)了胚胎期的毛囊形成和胚后的毛囊生長[52]。有研究表明添加鋅離子能顯著提升小鼠成骨細(xì)胞中BMP2基因的表達(dá)[53]。本試驗結(jié)果顯示，補(bǔ)鋅對生長獺兔毛囊中BMP2基因的相對表達(dá)量無顯著影響。這與前人的研究結(jié)果不一致，表明參與毛囊發(fā)育的BMP2基因可能并不是鋅在獺兔中起作用的靶基因，鋅是通過調(diào)控BMP4與Noggin基因?qū)ΛH兔毛囊發(fā)育進(jìn)行調(diào)控的。綜上所述，補(bǔ)鋅能夠增加獺兔毛囊密度的作用機(jī)制可能是通過下調(diào)BMP4基因的表達(dá)，進(jìn)而減少對毛囊生長的抑制，上調(diào)毛囊中Noggin基因的表達(dá)，Noggin分泌到鄰近的毛囊上皮細(xì)胞，并與BMP4相結(jié)合，從而激活毛囊上皮細(xì)胞的增殖。

4 結(jié) 論

以硫酸鋅形式在3～5月齡生長獺兔飼糧中添加40或80 mg/kg鋅時，可通過上調(diào)Noggin基因的表達(dá)，下調(diào)BMP4基因的表達(dá)，減少對毛囊生長的抑制并激活毛囊上皮細(xì)胞增殖，從而促進(jìn)毛囊的形成和發(fā)育。