王 卓 馮培祥 李光玉 司華哲 劉曉穎 姜桂苗 趙付偉 張 婷 劉晗璐*

(1．中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，吉林省特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物分子生物學(xué)省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)春130112； 2．聊城大學(xué)驢產(chǎn)業(yè)科技協(xié)同創(chuàng)新中心，聊城252000；3．國(guó)家膠類(lèi)中藥工程技術(shù) 研究中心，東阿阿膠股份有限公司，聊城252201)

驢為高附加值家畜，驢皮、驢肉、驢奶深受消費(fèi)者喜愛(ài)，驢產(chǎn)品的消費(fèi)潛力為驢特色養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展提供了極大動(dòng)力。在驢的養(yǎng)殖中，斷奶期是非常重要的時(shí)期，飼糧改變、母子分離以及環(huán)境改變等均易導(dǎo)致免疫力降低。此外，斷奶會(huì)導(dǎo)致腸道形態(tài)和功能變化，從而影響小腸的消化和吸收能力[1-2]。

2020年7月1日起我國(guó)飼料生產(chǎn)中開(kāi)始了全面禁止添加抗生素，這意味著依靠抗生素促生長(zhǎng)和預(yù)防腸道性疾病發(fā)生的時(shí)代已經(jīng)結(jié)束，這無(wú)疑將使國(guó)內(nèi)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)鏈產(chǎn)生一定變革。在初生和受應(yīng)激動(dòng)物飼糧中添加直接飼喂微生物(direct-fed microbials，DFM)，可以提高飼料利用率和通過(guò)抑制病原體改善動(dòng)物健康，并具有調(diào)節(jié)免疫功能、提高其他有益微生物的增殖、調(diào)節(jié)胃腸道微生物區(qū)系平衡(GIT)等作用，常被用來(lái)代替或減少抗生素的使用[3-5]。將DFM作為提高動(dòng)物生長(zhǎng)性能和促進(jìn)動(dòng)物健康的功能性食品添加劑的研究也逐漸增加。然而，DFM在食草單胃動(dòng)物驢的研究較少。

乳酸菌是應(yīng)用最為廣泛的DFM之一[6-7]。Canzi等[8]證實(shí)，乳酸菌對(duì)兔微生物區(qū)系平衡的恢復(fù)具有積極作用。本實(shí)驗(yàn)室從健康成年驢腸道內(nèi)分離和鑒定了1株羅伊氏乳桿菌L2-2，經(jīng)過(guò)小鼠安全性驗(yàn)證證實(shí)了該菌的安全性，并且有促進(jìn)小鼠胸腺發(fā)育的作用[9]。因此，本試驗(yàn)旨在研究飼糧添加羅伊氏乳桿菌L2-2對(duì)斷奶驢駒生長(zhǎng)性能、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率、血清免疫球蛋白含量及直腸菌群結(jié)構(gòu)的影響，為驢源微生態(tài)制劑的開(kāi)發(fā)和利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌株

從健康成年驢腸道中分離、篩選、鑒定后得到羅伊氏乳桿菌L2-2，現(xiàn)保藏于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所特種動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼養(yǎng)科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)實(shí)驗(yàn)室。取復(fù)蘇的菌株接種到乳酸細(xì)菌培養(yǎng)基(MRS)固體斜面培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h取出，刮取菌泥，用15%脫脂乳粉作為保護(hù)劑凍干，平板計(jì)數(shù)法測(cè)出有效活菌數(shù)。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物和試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選擇5～6月齡雌性斷奶驢駒10頭，平均體重為(113.05±14.66) kg，隨機(jī)分成2組，每組5個(gè)重復(fù)。對(duì)照組(CT組)喂基礎(chǔ)飼糧；試驗(yàn)組(LR組)在基礎(chǔ)飼糧中添加羅伊氏乳桿菌，按1×1011CFU/kg添加于精飼料中。精飼料每日按照驢駒體重的1.3%定量飼喂，每日07:00和16:00飼喂精飼料，粗飼料(豆秸)自由采食。預(yù)試期7 d，正試期60 d。所有驢單圈飼養(yǎng)。精飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1，粗飼料營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表2。

表1 精飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

表2 粗飼料營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1.3 檢測(cè)指標(biāo)

1.3.1 生長(zhǎng)性能

每天記錄采食量，每15 d晨飼前稱(chēng)量試驗(yàn)驢體重，每隔3 d對(duì)每頭驢精飼料和粗飼料投料量和剩料量進(jìn)行記錄，用于精確計(jì)算試驗(yàn)期間每頭驢采食量、平均日增重(ADG)和料重比(F/G)。

1.3.2 營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率

試驗(yàn)期間連續(xù)3 d每日14:00小心收集每頭驢駒的部分新鮮糞便，避免驢毛、沙粒等污染，收集的糞樣稱(chēng)重后按鮮重的5%加入10%硫酸以避免氮的損失。糞便樣品在80 ℃下殺菌2 h，然后降到65 ℃烘干48 h。分析飼糧和糞便樣品中干物質(zhì)(DM)、有機(jī)物(OM)、粗蛋白質(zhì)(CP)、鹽酸不溶灰分、粗脂肪(EE)、中性洗滌纖維(NDF)、酸性洗滌纖維(ADF)含量[10]。DM、CP、EE、NDF和ADF的表觀消化率采用2 mol/L鹽酸不溶灰分法[11]測(cè)定，通過(guò)以下公式計(jì)算表觀消化率：

D=100-[100×(A/A1)×(B1/B)]。

式中：D為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率；A為飼糧中鹽酸不溶性灰分含量；A1為糞便中鹽酸不溶性灰分含量；B為飼糧中該營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量；B1為糞便中該營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量。

1.3.3 血清免疫球蛋白含量

試驗(yàn)第45天，晨飼前對(duì)驢頸靜脈采血10 mL，加入帶分離膠的促凝采血管中，離心(3 500 r/min，10 min)獲得血清樣本，-20 ℃保存，待分析驢駒的血清免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白M(IgM)含量，使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒測(cè)定，試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.3.4 直腸菌群結(jié)構(gòu)

試驗(yàn)第50天采集直腸內(nèi)容物20 g，無(wú)菌操作下攪拌混勻，取5 g直腸內(nèi)容樣本，使用Fast DNA Spin Kit for Feces試劑盒(美國(guó)MP公司)進(jìn)行微生物組DNA提取。提取后的DNA送往北京諾禾致源科技股份有限公司，使用IonS5TMXL測(cè)序平臺(tái)對(duì)微生物基因組的16S rRNA V3～V4區(qū)進(jìn)行測(cè)序。所用引物為341F(5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′)和806R(5′-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3′)。在進(jìn)行分析之前，用Cutadapt[12](Martin M. 2011)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾和質(zhì)控，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行了均一化處理(normalize)，應(yīng)用Silva132數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行微生物分類(lèi)注釋。使用UPARSE軟件[13]根據(jù)97%的相似度對(duì)序列進(jìn)行操作分類(lèi)單元(OTUs)聚類(lèi)，并在聚類(lèi)的過(guò)程中去除單序列和嵌合體[14]。QIIME 1.9.1用來(lái)計(jì)算α-多樣性指數(shù)(ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)、Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù))[15]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有數(shù)據(jù)采用Independent-Samplest檢驗(yàn)分析差異顯著性。數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼糧添加羅伊氏乳桿菌對(duì)斷奶驢駒生長(zhǎng)性能的影響

如表3所示，對(duì)照組和試驗(yàn)組的15、30、45和60 d體重以及平均日增重、料重比均無(wú)顯著差異(P>0.05)。試驗(yàn)組的粗飼料采食量顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。

表3 飼糧添加羅伊氏乳桿菌對(duì)斷奶驢駒生長(zhǎng)性能的影響

2.2 飼糧添加羅伊氏乳桿菌對(duì)斷奶驢駒營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率的影響

如表4所示，對(duì)照組和試驗(yàn)組的DM、CP、EE、ADF、NDF表觀消化率均無(wú)顯著差異(P>0.05)。與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組的ADF表觀消化率提高了6.2%，NDF表觀消化率提高了3.4%。

表4 飼糧添加羅伊氏乳桿菌對(duì)斷奶驢駒營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率的影響

2.3 飼糧添加羅伊氏乳桿菌對(duì)斷奶驢駒血清免疫球蛋白含量的影響

如表5所示，試驗(yàn)組的血清IgA含量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。對(duì)照組和試驗(yàn)組的血清IgG和IgM含量均無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表5 飼糧添加羅伊氏乳桿菌對(duì)斷奶驢駒血清免疫球蛋白含量的影響

2.4 飼糧添加羅伊氏乳桿菌對(duì)斷奶驢駒直腸菌群結(jié)構(gòu)的影響

如表6所示，對(duì)照組和試驗(yàn)組的覆蓋度指數(shù)均高于0.995，說(shuō)明測(cè)序深度足夠，結(jié)果可呈現(xiàn)99.5%以上的菌群組成。試驗(yàn)組的Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)高于對(duì)照組，Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)低于對(duì)照組，但差異不顯著(P>0.05)。這表明飼糧添加羅伊氏乳桿菌對(duì)斷奶驢駒直腸菌群α-多樣性指數(shù)無(wú)顯著影響。

表6 飼糧添加羅伊氏乳桿菌對(duì)斷奶驢駒直腸菌群α-多樣性指數(shù)影響

按97%相似度聚類(lèi)后得到2 369個(gè)OTUs，對(duì)照組獨(dú)有的OTUs為250個(gè)，試驗(yàn)組獨(dú)有的OTUs為245個(gè)。飼糧添加羅伊氏乳桿菌后，斷奶驢駒直腸菌群組成的門(mén)水平和屬水平上微生物組成如圖1和圖2所示。對(duì)照組和試驗(yàn)組的直腸菌群在門(mén)水平上主要?dú)w類(lèi)為厚壁菌門(mén)[(54.76±10.91)%]、擬桿菌門(mén)[(27.74±12.60)%]和變形菌門(mén)[(10.71±17.00)%]。試驗(yàn)組的擬桿菌門(mén)相對(duì)豐度[(35.97±7.68)%]高于對(duì)照組[(19.52±11.37)%]，對(duì)照組中有2頭斷奶驢駒的變形菌門(mén)相對(duì)豐度高達(dá)36.46%～48.45%，這表明飼糧添加羅伊氏乳桿菌會(huì)提高斷奶驢駒直腸擬桿菌門(mén)相對(duì)豐度，可能會(huì)抑制變形菌門(mén)相對(duì)豐度。在屬水平上，對(duì)照組和試驗(yàn)組中相對(duì)豐度較高的菌群分別為不動(dòng)桿菌屬[(9.07±17.28)%]、土壤芽孢桿菌屬[(4.78±6.00)%]、鏈球菌屬[(6.34±6.63)%]、未鑒定瘤胃球菌科[(3.54±1.96)%]、未鑒定梭菌目[(2.60±4.17)%]。其他菌屬相對(duì)豐度均低于0.1%，在對(duì)照組和試驗(yàn)組的其他菌屬分別占(54.65±28.70)%和(79.30±10.81)%。對(duì)照組中2頭斷奶驢駒的變形菌門(mén)相對(duì)豐度較高，其不動(dòng)桿菌屬相對(duì)豐度也較高，達(dá)到34.35%～48.12%。試驗(yàn)組的厚壁菌門(mén)中未鑒定瘤胃球菌科相對(duì)豐度[(4.82±1.80)%]高于對(duì)照組[(2.26±1.15)%]。對(duì)照組和試驗(yàn)組的直腸菌群在其他屬水平上無(wú)明顯區(qū)別。

CT1～CT5代表對(duì)照組的5頭斷奶驢駒，LR1～LR5代表試驗(yàn)組的5頭斷奶驢駒。圖2同。

圖2 斷奶驢駒直腸菌群屬水平相對(duì)豐度

如圖3所示，主坐標(biāo)分析(PCoA)顯示2個(gè)軸相加解釋79.80%的變量組成，2組之間一些樣品的菌群組成相似，但仍有一些差異，這表明飼糧添加羅伊氏乳桿菌對(duì)斷奶驢駒直腸的菌群組成具有一定影響。

圖3 斷奶驢駒直腸菌群主坐標(biāo)分析

3 討 論

DFM被認(rèn)為可以通過(guò)定性或定量影響宿主腸道微生物群，同時(shí)幫助宿主完成各種生理生化功能[8]。DFM可以為宿主提供大量微生物菌體蛋白，可以改善營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化率，通過(guò)微生物分泌的消化酶和提供維生素B族以及各種酶的輔助因子而提高宿主消化能力[16-18]。而有關(guān)飼喂乳酸菌后對(duì)動(dòng)物益生作用的研究結(jié)果并不一致，這可能與動(dòng)物的品種、狀態(tài)以及菌的功能和來(lái)源有關(guān)。Ellinger等[19]、Abu-Tarboush等[20]、Krehbiel等[3]和Raeth-Knight等[21]報(bào)道，在飼喂乳酸桿菌后DM攝入量、ADG以及飼料轉(zhuǎn)化率沒(méi)有改善。Krehbiel等[3]報(bào)道，飼糧中添加DFM增加了瘤胃中纖維素降解菌的數(shù)量和比例。Giang等[1]報(bào)道，在仔豬斷奶后的前2周補(bǔ)充復(fù)合乳酸菌顯著增加了CP和粗纖維表觀消化率。而本試驗(yàn)結(jié)果表明，飼糧添加羅伊氏乳桿菌后，粗飼料采食量顯著減少，驢駒的生長(zhǎng)性能未受到影響，同時(shí)發(fā)現(xiàn)驢駒的NDF和ADF表觀消化率分別提高了3.4%和6.2%。因此，飼糧添加羅伊氏乳桿菌可以直接或間接增加驢駒對(duì)纖維素的消化率，同時(shí)可增加驢駒的飽腹感，在生產(chǎn)中有利于減少飼料成本的投入。

腸道細(xì)菌通過(guò)代謝產(chǎn)物參與宿主的免疫系統(tǒng)[22]?？诜樗釛U菌可以增強(qiáng)先天免疫反應(yīng)(即增強(qiáng)吞噬作用和自然殺傷細(xì)胞活性)，以及提高人類(lèi)和動(dòng)物中血清IgA含量和減少血清IgE含量[23-24]。血清免疫球蛋白是體液免疫系統(tǒng)的主要成分。本研究也發(fā)現(xiàn)，飼糧添加羅伊氏乳桿菌可以提高斷奶驢駒的血清IgA含量。IgA是黏膜免疫的主要抗體，其主要功能是在非特異性免疫防護(hù)機(jī)制的協(xié)助下減少病原菌。本實(shí)驗(yàn)室也研究發(fā)現(xiàn)，將驢源羅伊氏乳桿菌連續(xù)灌胃小鼠7 d后，羅伊氏乳桿菌可以通過(guò)增加小鼠胸腺指數(shù)來(lái)增強(qiáng)小鼠的免疫功能[9]。

從斷奶驢駒直腸菌群組成的門(mén)水平和屬水平的試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，飼糧添加羅伊氏乳桿菌后，乳桿菌屬相對(duì)豐度并沒(méi)有明顯增加，這可能是直接飼喂裸菌后細(xì)菌經(jīng)過(guò)胃腸液消化并沒(méi)有有效存活，而是通過(guò)細(xì)菌的代謝產(chǎn)物發(fā)揮作用。在模擬胃酸環(huán)境下，單純沒(méi)有被包被的益生菌很難在胃中存活2 h[25]。但我們觀察到飼糧添加羅伊氏乳桿菌后刺激了斷奶驢駒直腸中門(mén)水平上擬桿菌門(mén)和屬水平上未鑒定瘤胃球菌科的增長(zhǎng)。擬桿菌門(mén)是飼料碳水化合物和蛋白質(zhì)的重要降解菌，可促進(jìn)胃腸道免疫系統(tǒng)的發(fā)育[26]。有研究表明，瘤胃球菌科可降解多糖和纖維，產(chǎn)生大量揮發(fā)性脂肪酸(VFA)，這可能有助于通過(guò)增強(qiáng)飽腹感減少食物攝入量[27-29]。本試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)在飼糧添加羅伊氏乳桿菌后斷奶驢駒粗飼料采食量減少，ADF表觀消化率提高，可能與未鑒定瘤胃球菌科相對(duì)豐度增加有關(guān)。瘤胃球菌科已被證明可在體外產(chǎn)生抗炎肽[30]，而且可以降低小牛的腹瀉發(fā)病率和死亡率[31]。此外，瘤胃球菌科的數(shù)量與結(jié)腸炎、絞痛以及應(yīng)激因素如禁食、運(yùn)輸和麻醉有顯著負(fù)相關(guān)[32-34]。本試驗(yàn)中，對(duì)照組2只斷奶驢駒直腸內(nèi)不動(dòng)桿菌的相對(duì)豐度較高。Regalado等[35]研究表明，不動(dòng)桿菌可引起動(dòng)物胃腸炎的發(fā)生。本試驗(yàn)中，試驗(yàn)組并未發(fā)現(xiàn)這樣的個(gè)體，這也從側(cè)面證明了飼糧添加羅伊氏乳桿菌可在一定程度上維持腸道穩(wěn)態(tài)。因此，羅伊氏乳桿菌可能通過(guò)間接增加未鑒定瘤胃球菌科的相對(duì)豐度而預(yù)防和治療腹瀉等胃腸道疾病，關(guān)于這一點(diǎn)還需要進(jìn)一步研究確定。

4 結(jié) 論

研究表明，飼糧添加羅伊氏乳桿菌可以降低斷奶驢駒的粗飼料采食量，提高ADF和NDF表觀消化率，增加血清IgA含量，提高直腸中擬桿菌門(mén)和未鑒定瘤胃球菌科相對(duì)豐度。