鄭 鵬，馮 瑞，秦 雪，李 琦，王春安

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，哈爾濱 150030；2.黑龍江昇太牧業(yè)發(fā)展有限公司，黑龍江蘭西 151500）

睪丸曲細(xì)精管是雄性動(dòng)物產(chǎn)生配子（精子）的器官，在曲細(xì)精管內(nèi)主要有支持細(xì)胞和生殖細(xì)胞組成［1-2］。在動(dòng)物生長發(fā)育過程中，支持細(xì)胞逐漸發(fā)育成熟，形成血睪屏障，使曲細(xì)精管內(nèi)維持一個(gè)精子發(fā)生的特殊內(nèi)環(huán)境，生殖細(xì)胞逐漸分化形成生殖干細(xì)胞、不同類型的精原細(xì)胞、初級(jí)精母細(xì)胞、次級(jí)精母細(xì)胞、精細(xì)胞、精子［3-4］。初情期后，曲細(xì)精管內(nèi)的結(jié)構(gòu)和功能已經(jīng)基本完善，生精上皮處于不同發(fā)育階段的生精細(xì)胞不斷分裂，源源不斷產(chǎn)生精子。但初情期前，支持細(xì)胞形成血睪屏障和生殖干細(xì)胞的遷移、增殖與分化的機(jī)制還不是很清楚。

為此，本試驗(yàn)選取不同日齡的民豬睪丸，通過制作組織學(xué)切片和免疫熒光染色，研究支持細(xì)胞發(fā)育和血睪屏障形成的形態(tài)學(xué)變化，為豬睪丸生殖生理的研究和應(yīng)用提供理論和實(shí)踐依據(jù)，同時(shí)為民豬公豬保種提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及采樣

7，30，60，70，90，110日齡民豬，來源于黑龍江昇太牧業(yè)發(fā)展有限公司蘭西縣民豬保種場(chǎng)。豬保定后，用碘酒消毒下腹部，無菌取出雙側(cè)睪丸，剪去脂肪墊，用37℃生理鹽水沖洗睪丸。取睪丸組織小塊，迅速放入固定液中固定。固定液包括4%甲醛-PBS和pH值為7.2的2.5%戊二醛。

1.2 光學(xué)顯微鏡的組織學(xué)觀察與測(cè)量

取睪丸組織小塊，迅速放入4%甲醛-PBS固定液中固定，24 h后用紗布包好，編號(hào)，按照常規(guī)的石蠟切片步驟制作切片［5］，對(duì)組織切片進(jìn)行全切片掃描，然后使用CaseViewer 2.4 RTM切片圖像處理軟件進(jìn)行觀察及測(cè)量。

1.3 電子顯微鏡的組織學(xué)觀察

將樣品放入pH值7.2的2.5%戊二醛中固定，并置于4℃冰箱中保存24 h。然后按照常規(guī)的電子顯微鏡切片步驟制作切片：PBS沖洗—四氧化鋨固定—PBS沖洗—乙醇逐級(jí)脫水—丙酮置換—環(huán)氧樹脂浸透—包埋—切片。用ULTRACUT-E型超薄切片機(jī)切片，切片厚度為5 000～7 000 nm。用檸檬酸鉛、醋酸雙氧鈾在25℃下對(duì)切片染色40 min，用雙蒸水沖洗干凈后放入培養(yǎng)皿中待檢。電鏡切片的觀察與顯微攝影采用Mic H-7650型電子顯微鏡［2-3］。

1.4 免疫熒光染色

將載玻片上的切片用二甲苯及梯度乙醇處理，接著置于0.1 mmol/L的EDTA（pH值9.0）中，88℃處理10 min，以修復(fù)抗原。處理好的切片用2%BSA在37℃條件下封閉30 min，每張切片加200μL稀釋到適當(dāng)濃度的第一抗體（1∶500，兔抗多克隆抗體Connexin-43、Occludin、ZO-1、KRT-18），37℃孵育1 h，PBS洗3次。每張切片加200μL稀釋的第二抗體（1∶200，紅色熒光標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體），室溫孵育40 min，PBS洗3次。熒光顯微鏡下觀察及拍照［6-7］。

2 結(jié)果

2.1 民豬睪丸的光鏡組織學(xué)觀察

7日齡民豬睪丸：曲細(xì)精管直徑為58～60μm，每個(gè)切面有20～23個(gè)支持細(xì)胞、1～3個(gè)生殖細(xì)胞。支持細(xì)胞呈圓形，附著在基膜上，細(xì)胞核呈圓形或橢圓形，生殖細(xì)胞處于向基膜遷移的狀態(tài)，有的生殖細(xì)胞已經(jīng)附著到基膜上，細(xì)胞著色較淺，細(xì)胞形態(tài)明顯大于支持細(xì)胞，細(xì)胞質(zhì)偏向基膜生長，見圖1A。30日齡民豬睪丸：曲細(xì)精管直徑為62～65μm，每個(gè)切面有22～25個(gè)支持細(xì)胞、4～6個(gè)生殖細(xì)胞。支持細(xì)胞的細(xì)胞核呈長橢圓形，有的細(xì)胞核位置移向管腔，見圖1B。大部分生殖細(xì)胞附著在基膜上，或兩個(gè)生殖細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)緊密連接在一起。60日齡民豬睪丸：曲細(xì)精管直徑為80～90μm，生殖細(xì)胞和支持細(xì)胞鑲嵌排列，支持細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)特別發(fā)達(dá)，細(xì)胞質(zhì)相連，開始形成血睪屏障。有的部位出現(xiàn)兩層細(xì)胞，每個(gè)切面有9～11個(gè)生殖細(xì)胞，見圖1C。70日齡民豬睪丸：曲細(xì)精管直徑為90～110μm，出現(xiàn)2～3層的細(xì)胞，管腔中央是支持細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞質(zhì)相連，支持細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)邊緣開始出現(xiàn)初級(jí)精母細(xì)胞，見圖1D。90日齡民豬睪丸：曲細(xì)精管直徑為130～150μm，基膜處2～3層細(xì)胞排列整齊的，支持細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)發(fā)達(dá)，伸向管腔，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)附著初級(jí)精母細(xì)胞，有的部位有精細(xì)胞，見圖1E。110日齡民豬睪丸：曲細(xì)精管直徑為180～210μm，管腔內(nèi)有多層生殖細(xì)胞，并出現(xiàn)精細(xì)胞和變形的精子，見圖1F、圖1G。

2.2 生殖細(xì)胞遷移到基膜的電鏡觀察

生殖細(xì)胞遷移到基膜的過程中，首先是細(xì)胞質(zhì)伸出偽足，進(jìn)入支持細(xì)胞之間的空隙，逐漸附著到基膜上，轉(zhuǎn)變?yōu)樯掣杉?xì)胞，附著基膜時(shí)生殖細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的線粒體特別發(fā)達(dá)，見圖2A、B，并進(jìn)行有絲分裂。生殖細(xì)胞不斷遷移，占據(jù)支持細(xì)胞的空間，將支持細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)擠壓向管腔中心側(cè)，伴隨著生殖細(xì)胞的分裂，有的支持細(xì)胞的細(xì)胞核被擠壓在基膜上，見圖2C、圖2D。

圖2 30日齡民豬睪丸生殖細(xì)胞遷移到基膜的透射電鏡觀察

2.3 支持細(xì)胞發(fā)育的電鏡觀察

生殖細(xì)胞遷移到基膜后，不斷分裂增殖，占據(jù)更多的空間，將支持細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)推向管腔中心方向或擠壓在基膜，支持細(xì)胞之間形成連接，將不同類型的生殖細(xì)胞隔離開來，見圖3A。同時(shí)，支持細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)大面積擴(kuò)張，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的線粒體特別發(fā)達(dá)，見圖3B，隨著生殖細(xì)胞的不斷增殖與分裂，生殖細(xì)胞數(shù)量不斷增多，分別形成精原細(xì)胞、精母細(xì)胞、精細(xì)胞，生殖細(xì)胞之間僅剩下支持細(xì)胞與支持細(xì)胞之間的膜相連，見圖3C、圖3D。在整個(gè)曲細(xì)精管內(nèi)，隨著生殖細(xì)胞的周期性變化，生殖細(xì)胞之間支持細(xì)胞的連接呈現(xiàn)不同的變化，形成明顯的血睪屏障結(jié)構(gòu)，見圖3E、圖3F。

圖3 90，110日齡民豬睪丸支持細(xì)胞發(fā)育的透射電鏡觀察

2.4 免疫熒光染色觀察

7日齡睪丸的免疫熒光染色結(jié)果見圖4。圖4顯示：未成熟支持細(xì)胞的Connexin-43、Occludin、KRT-18染色結(jié)果呈陰性，ZO-1染色結(jié)果呈陽性；精原細(xì)胞的Connexin-43、Occludin染色結(jié)果呈陰性，KRT-18染色結(jié)果呈弱陽性，ZO-1染色結(jié)果呈陽性；間質(zhì)細(xì)胞的Connexin-43、Occludin、KRT-18、ZO-1染色結(jié)果呈陽性。30日齡和7日齡睪丸的免疫熒光染色的鑒定結(jié)果一致，未列出。

圖4 7日齡民豬睪丸曲細(xì)精管的免疫熒光染色結(jié)果

3 討論

支持細(xì)胞血睪屏障的形成是維持精子發(fā)生的重要內(nèi)環(huán)境［8］。家畜出生后，曲細(xì)精管內(nèi)的支持細(xì)胞處于未成熟狀態(tài)，均勻生長在基膜上，生殖細(xì)胞大部分處于曲細(xì)精管中心，屬于性原細(xì)胞或生殖干細(xì)胞，之后逐漸向基膜遷移，并附著到基膜上，轉(zhuǎn)變?yōu)榫杉?xì)胞。精原干細(xì)胞在分裂過程中，還會(huì)形成不同類型的A型精原干細(xì)胞，然后產(chǎn)生初級(jí)精母細(xì)胞［3-4］。在精原細(xì)胞進(jìn)行有絲分裂的過程中，支持細(xì)胞不斷成熟分化，形成發(fā)達(dá)的細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞質(zhì)之間形成血睪屏障的結(jié)構(gòu)，保證初級(jí)精母細(xì)胞減數(shù)分裂和精子的形成［9-10］。本試驗(yàn)采用組織學(xué)切片進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)生殖干細(xì)胞向基膜遷移時(shí)利用細(xì)胞質(zhì)向支持細(xì)胞的空隙內(nèi)進(jìn)行遷移，細(xì)胞質(zhì)具有一定的極性并且此部位的線粒體增多，會(huì)進(jìn)行一系列的生化反應(yīng)，具體的機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。當(dāng)生殖干細(xì)胞遷移結(jié)束后，線粒體均勻分布。支持細(xì)胞在發(fā)育過程中，主要是細(xì)胞質(zhì)的擴(kuò)張，兩個(gè)支持細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)之間進(jìn)行多處連接，平面上呈類似網(wǎng)格狀，立體上多個(gè)支持細(xì)胞相互連接，各級(jí)的生殖細(xì)胞能夠穿過支持細(xì)胞之間的連接。支持細(xì)胞之間的連接構(gòu)成多個(gè)微環(huán)境，保證生殖細(xì)胞的有絲分裂、減數(shù)分裂、精細(xì)胞變形等過程，而且能夠吞噬凋亡的細(xì)胞、細(xì)胞質(zhì)等。據(jù)此推斷曲細(xì)精管內(nèi)支持細(xì)胞和生殖細(xì)胞的模型結(jié)構(gòu)為種子-土壤模型，即支持細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)立體生長，相互連接，形成生殖細(xì)胞生長的支撐結(jié)構(gòu)和環(huán)境。生殖細(xì)胞類似一粒種子，先鉆入支持細(xì)胞空隙，然后向基膜運(yùn)行；同時(shí)支持細(xì)胞立體生長，把生殖細(xì)胞包圍在里面，隨著生殖細(xì)胞的分裂，支持細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)逐漸向上生長，形成更厚的支持細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)層。精細(xì)胞變形過程中，逐漸長出支持細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)層，在形成精子后脫離支持細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)，游離到管腔內(nèi)，見圖5。R.L.Brinster等［11］通過小鼠腹腔內(nèi)注射白消安，消除內(nèi)源性精子發(fā)生，制作曲細(xì)精管內(nèi)只有支持細(xì)胞的受體鼠模型，組織學(xué)結(jié)果顯示，曲細(xì)精管內(nèi)支持細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)相連，并有許多空泡樣結(jié)構(gòu)，這一結(jié)果也證實(shí)了支持細(xì)胞之間會(huì)形成多個(gè)連接和腔室，將不同階段的生殖細(xì)胞隔離開來。

圖5 曲細(xì)精管內(nèi)的種子-土壤立體模型結(jié)構(gòu)

民豬是中國東北地區(qū)的一個(gè)古老的地方豬種，具有產(chǎn)仔多、肉質(zhì)好、抗寒、耐粗飼、繁殖力高、性成熟早的突出優(yōu)點(diǎn)，是受保護(hù)的國家級(jí)地方品種。家畜的初情期和精子的產(chǎn)生是相伴發(fā)生的事件，初情期的出現(xiàn)又受到品種、營養(yǎng)、飼養(yǎng)條件等因素的影響［12］，飼料營養(yǎng)水平高、環(huán)境條件舒適，會(huì)促使家畜的初情期提前和曲細(xì)精管內(nèi)精子提前發(fā)生。此外，相同條件下不同個(gè)體之間也會(huì)存在一定差異，導(dǎo)致不同個(gè)體的曲細(xì)精管內(nèi)產(chǎn)生精子的時(shí)間不一樣［13-14］。在本試驗(yàn)中即使同一個(gè)個(gè)體，不同的曲細(xì)精管內(nèi)生殖細(xì)胞的增殖分化、產(chǎn)生精子的時(shí)間也不一致，這也可能是導(dǎo)致曲細(xì)精管內(nèi)上皮波和源源不斷產(chǎn)生精子的原因。

Connexin-43、Occludin、ZO-1是構(gòu)成血睪屏障的重要蛋白，KRT-18是未成熟支持細(xì)胞的標(biāo)志物［6-9］。本試驗(yàn)計(jì)劃使用4種抗體染色，觀察血睪屏障形成的形態(tài)變化，然而使用Connexin-43、Occludin、KRT-18、ZO-1對(duì)7，30日齡民豬睪丸的曲細(xì)精管進(jìn)行免疫熒光染色，結(jié)果4種蛋白中沒有支持細(xì)胞特異性的染色。Connexin-43、Occludin可能在未成熟支持細(xì)胞不表達(dá)，KRT-18在未成熟支持細(xì)胞沒有染色，在生殖細(xì)胞卻呈微弱染色；ZO-1在支持細(xì)胞和生殖細(xì)胞都著色。說明使用Connexin-43、Occludin、KRT-18、ZO-1染色無法專一性鑒定民豬支持細(xì)胞的發(fā)育和血睪屏障的形成，因此試驗(yàn)中沒有繼續(xù)對(duì)其他日齡的曲細(xì)精管進(jìn)行染色。

4 結(jié)論

民豬支持細(xì)胞血睪屏障的形成在60～90日齡之間，90日齡之后血睪屏障已經(jīng)具備了完整的功能，能夠支持精子發(fā)生。