丁嘉怡，郭慧玲，羅一鳴，康文林，李 康，李谷月

（江西農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院，南昌 330045）

Bcl-2蛋白是到現(xiàn)今為止研究最為深入的抗凋亡蛋白之一，可以與促凋亡蛋白結合，抑制促凋亡蛋白的寡聚及之后的MOMP（mitochondrial outer membrane permeabilization）發(fā)生，進而阻斷線粒體途徑的凋亡［1］。近些年的研究表明，通過線粒體途徑介導的細胞凋亡主要由Bcl-2蛋白家族成員之間復雜的相互作用進行調(diào)控［2］。除此之外，Bcl-2可能參與了Bax誘導凋亡的下調(diào)途徑且與細胞色素C的釋放無關［3-4］，Bax蛋白與Bcl-2蛋白以不同比例形成異二聚體可能決定了細胞凋亡的敏感性［5］，Bcl-2/Bax比值增大，會激發(fā)線粒體膜電位下降或丟失，從而促進細胞凋亡的發(fā)生［6］。

有研究發(fā)現(xiàn)Bcl-2基因不僅能調(diào)控凋亡，還可通過結合細胞自噬的關鍵調(diào)控因子Beclin1對細胞自噬起到調(diào)控作用［7］。劉會娟等［8］指出，Bcl-2蛋白影響Ca2+在細胞內(nèi)的分布，Ca2+能夠激活核酸內(nèi)切酶，而Beclin1及Ca2+信號通路參與自噬調(diào)節(jié)［9-10］，Beclin1的表達明顯上調(diào)和胞內(nèi)Ca2+濃度升高會導致自噬增強［11］。此外也有報道，Bcl-2家族蛋白的抑制可引起細胞過多死亡，細胞死亡依賴于自噬機制，這可能是平衡自噬活動的重要機制之一［12-13］。這說明Bcl-2在細胞凋亡與自噬過程中發(fā)揮交叉性作用。

對Bcl-2蛋白的抑制表達以及影響細胞死亡的作用研究是最近幾年的研究熱點。在哺乳動物中，一些Caspase蛋白酶形成了蛋白水解級聯(lián)反應，Bcl-2蛋白通過阻止導致Caspase蛋白酶激活的步驟阻止細胞死亡，排除了Bcl-2蛋白和Bcl-XL（B-Cell Leukemia/Lymphoma 2 XL）通過在Caspase蛋白酶的下游起作用來防止細胞死亡的可能性［14-15］，其可能通過組織結構損傷途徑將細胞凋亡信號下傳。

本試驗通過應用生物信息分析預測及算法配合，預測牛的Bcl-2基因及其編碼蛋白的性質(zhì)、結構和功能，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 基因序列

牛源Bcl-2基因序列（編號NC_037351.1）及編碼蛋白的氨基酸序列（編號NP_001159958.1），自NCBI網(wǎng)站上獲得。

1.2 測定項目與方法

采用BioEdit軟件進行牛Bcl-2基因序列預測分析，分析目標基因序列組成。采用NCBI在線網(wǎng)站Bcl-2基因進行核酸基本分析，對Bcl-2基因所在基因組數(shù)據(jù)進行預測。采用NCBI上的BLAST工具包進行核苷酸的初步同源性分析。

采用NCBI在線程序預測牛Bcl-2基因所編碼的氨基酸序列，采用BioEdit軟件分析目標氨基酸組成。使用NCBI-BLAST進行牛Bcl-2蛋白同源性比對。運用在線工具ExPASy-ProtParam tool預測氨基酸與水結合的性質(zhì)。將TMHMM Server v.2.0與SPLIT 4.0工具聯(lián)合使用進行蛋白質(zhì)跨膜區(qū)預測。根據(jù)SignalP 4.1 Server對蛋白質(zhì)的信號肽區(qū)域進行預測。運用在線工具PSORTⅡ進行Bcl-2蛋白分子亞細胞位點的預測。利用NCBI的CD-Search對Bcl-2蛋白的結構域預測分析。利用在線工具PSIpred-MEMSAT 3預測Bcl-2蛋白二級結構。運用SWISS-MODEL工具依據(jù)同源建模法構建出Bcl-2蛋白三級結構模型。

2 結果與分析

2.1 牛Bcl-2基因的基因分析

2.1.1 牛Bcl-2基因序列預測分析運用BioEdit軟件分析目標基因序列的組成。預測到Bcl-2基因長792 bp，單鏈分子質(zhì)量為241 755.00 Da，雙鏈分子質(zhì)量為483 515.00 Da。4種堿基含量分別為A，17.17%；C，32.70%；G，32.32%；T，17.80%；G+C，65.03%；A+T，34.97%。該核苷酸序列中C含量最高，A含量最少，見表1。牛Bcl-2基因核苷酸預測見圖1。

圖1 牛Bcl-2基因核苷酸預測

2.1.2 牛Bcl-2基因的核酸基本分析使用NCBI在線網(wǎng)站進行Bcl-2核酸基本分析，對Bcl-2基因所在基因組數(shù)據(jù)進行預測，結果見圖2。結果表明，預測Bcl-2基因在24號染色體上，外顯子計數(shù)為7。

圖2 牛Bcl-2基因的核酸基本分析

2.1.3 牛Bcl-2基因的同源性比對使用NCBIBLAST工具包進行核苷酸的初步同源性分析。將牛與已公布的抹香鯨（登錄號XM_007105114.3）、小鰛鯨（登錄號XM_007192009.1）、虎鯨（登錄號XM_004268067.2）、太平洋短吻海豚（登錄號XM_027118704.1）、長肢領航鯨（登錄號XM_030868121.1）、非洲野驢（登錄號XM_014843802.1）、山羊（登錄號KJ782301.1）、牦牛（登錄號MK050976.1）、北美野牛（登錄號XM_010854740.1）、印度牛（登錄號XM_019986619.1）、馬鐵菊頭蝠（登錄號XM_033087566.1）Bcl-2基因序列同源性比對，結果見圖3。結果表明，該核苷酸序列高度保守，與牦牛（登錄號MK050976.1）同源性相似度在99.86%。

圖3 Bcl-2基因序列同源性比較

2.2 牛Bcl-2蛋白結構與功能分析

2.2.1 牛Bcl-2氨基酸序列的組成分析使用NCBI在線程序預測牛Bcl-2氨基酸序列，測得牛Bcl-2蛋白包含229個氨基酸，結果見圖4。

圖4 牛Bcl-2氨基酸序列

采用BioEdit軟件分析目標氨基酸的組成，并運用在線工具ExPASy-ProtParam tool分析Bcl-2蛋白基本理化性質(zhì)，結果見表2。該蛋白質(zhì)的公式為C1132H1717N311O316S9，原子總數(shù)為3 485，理論pI為6.65，蛋白質(zhì)半衰期為30 h，不穩(wěn)定性指數(shù)為58.20，將蛋白質(zhì)分類為不穩(wěn)定。脂肪指數(shù)為76.77，親水性平均值（GRAVY）為-0.133。氨基酸殘基數(shù)為229個，分子質(zhì)量為25 026.10 Da。其中丙氨酸（Ala）占26個，是占比最大的，為11.35%；其他依次是甘氨酸（Gly）、亮氨酸（Leu）、脯氨酸（Pro），這三種氨基酸含量分別占比9.61%、9.17%、9.17%；最少的是胱氨酸（Cys），僅占0.87%。帶負電荷的殘基總數(shù)（Asp+Glu）為21，正電荷殘基總數(shù)（Arg+Lys+His）為27。消光系數(shù)以L/（g·cm）為單位，在280 nm的水中測量。假設所有對Cys殘基形成胱氨酸，外系數(shù)45 045 Abs 0.1%（=1 g/L）1.800，假設所有Cys殘基均減少，外系數(shù)44 920 Abs 0.1%（=1 g/L）1.795。理論等電點為6.65，脂肪指數(shù)為76.77，GRAVY為-0.133，不穩(wěn)定指數(shù)為58.20，半衰期為30 h，說明Bcl-2為酸性不穩(wěn)定親水蛋白。

表2 牛Bcl-2氨基酸的組成

2.2.2 牛Bcl-2蛋白氨基酸序列同源性分析使用NCBI-BLAST進行牛Bcl-2蛋白同源性比對。將牛Bcl-2蛋白與亞洲水牛（登錄號XP_020761266.1）、山羊（登錄號NP_001301142.1）、綿羊（登錄號XP_011959221.3）、白尾鹿（登錄號VFV45177.1）、西班牙猞猁（登錄號XP_032167375.1）、家貓（登錄號XP_023096959.1）、金錢豹（登錄號XP_019319377.1）、港海豹（登錄號XP_032278690.1）、白鼬（登錄號XP_025742125.1）、北海狗（登錄號XP_006064629.1）的Bcl-2蛋白進行同源性比對，結果見圖5。結果表明，與亞洲水牛的蛋白序列同源性最高，達到99.56%。

圖5 Bcl-2氨基酸序列同源性預測

2.2.3 牛Bcl-2氨基酸分子的親水性、疏水性分析運用在線工具ExPASy-ProtParam tool分析預測氨基酸與水結合的性質(zhì)，結果見圖6。結果表明，牛Bcl-2蛋白在第96，97位氨基酸處有最小值，GRAVY值為-2.700，在第213，214位氨基酸處有最大值，GRAVY值為2.422，疏水性氨基酸明顯少于親水性氨基酸，說明牛Bcl-2蛋白為親水性蛋白。

圖6 牛Bcl-2蛋白質(zhì)疏水性分析

2.2.4 牛Bcl-2蛋白質(zhì)跨膜區(qū)分析運用TMHMMServer v.2.0與SPLIT 4.0兩個工具對Bcl-2蛋白質(zhì)跨膜區(qū)進行聯(lián)合預測，結果見圖7。預測結果表明，預測的跨膜螺旋數(shù)量為1；跨膜螺旋氨基酸殘基數(shù)量的期望值為21.922 9（n≥18），可能含跨膜螺旋或者含有信號肽，因此Bcl-2蛋白有跨膜區(qū)；Bcl-2蛋白的前60個氨基酸中跨膜螺旋的氨基酸量的期望值為0.000 79；Bcl-2蛋白的1～203位氨基酸位于細胞膜內(nèi)，204～225位氨基酸形成一個典型的跨膜螺旋區(qū)，227～229位氨基酸位于細胞膜表面，證明Bcl-2蛋白為跨膜蛋白。

圖7 牛Bcl-2蛋白質(zhì)跨膜區(qū)SPLIT 4.0預測分析

2.2.5 牛Bcl-2蛋白信號肽預測根據(jù)SignalP 4.1 Server對蛋白質(zhì)的信號肽區(qū)域進行預測，結果見圖8。結果表明：該條氨基酸序列沒有信號肽；牛Bcl-2蛋白C得分峰值位于第47，66，67位氨基酸，均為0.111；S得分峰值位于第55位氨基酸，為0.115；Y得分峰值位于第68位氨基酸，為0.107。根據(jù)上述預測結果判斷，Bcl-2蛋白不存在信號肽，為非分泌蛋白。

圖8 牛Bcl-2蛋白信號肽預測圖

2.2.6 牛Bcl-2蛋白分子亞細胞位點預測運用在線工具PSORTⅡ進行Bcl-2蛋白分子亞細胞位點預測，結果見表3。結果表明，Bcl-2蛋白有26.15%分布于細胞質(zhì)，21.7%分布于分泌系統(tǒng)的囊泡、13.0%分布于核，13.0%分布于線粒體，8.7%分布于質(zhì)膜，4.3%分布于細胞骨架，4.3%分布于液泡，4.3%分布于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、4.3%分布于高爾基體。

表3 牛Bcl-2蛋白分子亞細胞位點預測結果 %

2.2.7 牛Bcl-2蛋白結構域分析利用NCBI的CD-Search對Bcl-2蛋白的結構域進行預測分析，結果見圖9。結果表明，Bcl-2蛋白有Bcl-2家族蛋白典型結構域和BH1-BH3結合位點。

圖9 牛Bcl-2蛋白保守結構域分析

2.2.8 牛Bcl-2蛋白二級結構預測分析運用在線工具PSIpred-MEMSAT 3對Bcl-2蛋白二級結構進行預測，結果見圖10。結果表明，預測Bcl-2蛋白由51.53%的α-螺旋、6.99%的β-轉角、6.55%的延伸鏈與34.93%的無規(guī)卷曲組成，有7個α-螺旋，6個β-轉角。

圖10 牛Bcl-2蛋白二級結構預測

2.2.9 牛Bcl-2蛋白三級結構預測分析運用SWISS-MODEL工具按同源建模法構建出Bcl-2蛋白三級結構模型。對Bcl-2蛋白進行同源建模和三維結構預測，預測有3個模型，有2個模型描述為Bcl-2頡頏劑，1個模型為Bcl-2，見圖11。Bcl-2蛋白和模板1gjh.1.A進行比較，GMQE為0.56，QMEAN為0.11，寡聚狀態(tài)為單體，無配體，生物單位低聚狀態(tài)為異二聚體，四級結構質(zhì)量估計（QSQE）為0.00，有92.39%的氨基酸序列一致，并且預測的三級結構結果與二級結構預測結果基本一致。

圖11 牛Bcl-2蛋白三級結構預測結果

3 結論與討論

1）本試驗中，分析目標基因組成，得出該核苷酸序列中C含量最高，A含量最少，DNA序列較穩(wěn)定。經(jīng)同源性分析該基因同系物，牛的直系同源是人類與小鼠，同屬于哺乳動物，具有高度保守性。與已公布的幾種動物Bcl-2基因序列進行同源性比對，得出牛與牦牛Bcl-2基因序列同源性最高，與其他品種牛也有較高的同源性；不同動物Bcl-2蛋白進行同源性比對，測得與亞洲水牛的蛋白序列同源性最高。牦牛與牛同屬哺乳綱偶蹄目牛科，但對屬于牛屬還是牦牛屬未有定論，不過長期以來中國用牦牛與普通牛進行雜交，現(xiàn)存牦牛的起源和形成在一定程度上吸收了普通牛的基因，其他品種的牛也與普通牛有較近的親緣關系，所以Bcl-2基因具有高度保守性。

2）Bcl-2基因含有3個外顯子，經(jīng)剪切產(chǎn)生出2個開放閱讀框，分別編碼Bcl-2a和Bcl-2β蛋白。本試驗結果表明，牛Bcl-2基因可編碼229個氨基酸殘基構成的可溶酸性蛋白質(zhì)，分子質(zhì)量為25 026.10 Da，含1個跨膜區(qū)，不含信號肽，非分泌蛋白，有3種三級結構模型，預測為跨膜性結構蛋白。不穩(wěn)定性指數(shù)為58.20，將蛋白質(zhì)分類為不穩(wěn)定，預測Bcl-2蛋白通過共價鍵的形成與斷裂產(chǎn)生不同的構型，或是通過聚集、表面吸附等方式在雙向調(diào)節(jié)細胞凋亡上有重要作用。賈浩等［16］通過蛋白穩(wěn)定常數(shù)（PSI）評價人類胞內(nèi)蛋白壽命，結果表明，短半衰期的蛋白質(zhì)絕大多數(shù)定位于細胞膜或膜性囊泡結構上，與預測Bcl-2蛋白亞位點位置相同，但其半衰期偏長，為30 h。Bcl-2基因可延長細胞存活時間且具備抗細胞凋亡的作用，在多種腫瘤中作為重要的凋亡抑制基因得到研究［17］，Bcl-2蛋白的半衰期可向減少方向研究以應用于腫瘤治療方面。

3）根據(jù)程金娜等［18］的研究，Bcl-2家族的三維結構主要為6～7個長度不一的疏水性α-螺旋，有利于Bcl-2成員之間的疏水性接觸，促進異源二聚化作用，這與本試驗預測的Bcl-2蛋白二級結構與三級結構類似。牛Bcl-2蛋白的1～203位氨基酸位于細胞膜內(nèi)，此部分大多為親水性氨基酸；204～225位氨基酸之間形成一個典型的跨膜螺旋區(qū)，227～229位氨基酸位于細胞膜表面，此部分主要由疏水性氨基酸構成，預測胞外疏水區(qū)結構是反應的主要區(qū)域，可能與接收胞外信號，使得跨膜區(qū)疏水區(qū)域發(fā)生改變來控制膜的通透性有關。研究表明，Bcl-2基因蛋白家族的結構主要由位于羧基端的跨膜結構域（transmembrane region，TM）和數(shù)量不等（1～4個）的Bcl-2同源結構域（Bcl-2 homology，BH）兩大結構域組成。BH-4作為抗凋亡蛋白特有的結構域，缺失可導致抗凋亡蛋白功能的喪失，而被認為是死亡結構域的BH-3與促進凋亡有關［19-21］。該結構在家族成員的相互作用中起重要作用，Bcl-2蛋白可能通過疏水結構域與促凋亡蛋白的BH-3結合起頡頏作用，且Bcl-2蛋白的BH-3結構域與beclin1結合后形成復合物，降低脂質(zhì)激酶Vps34活性，抑制beclin 1介導自噬的功能［22］。

4）細胞凋亡主要通過半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶Caspase途徑和組織結構損傷兩種途徑將死亡信號下傳（downstream），后者以線粒體功能障礙為主要特征。根據(jù)Bcl-2蛋白分子亞細胞位點預測結果，除分布在細胞質(zhì)中，還主要分布于分泌系統(tǒng)的囊泡、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)這些含有膜的細胞器上，以酸性親水的跨膜蛋白形式存在。預測其可能通過控制膜的通透性、維護線粒體的完整性以抑制細胞凋亡，或是在凋亡信號作用下改變構型、異位并插入線粒體外膜發(fā)揮促凋亡活性［23-26］。吳開年等［27］的研究表明，Bcl-2蛋白對線粒體外膜和內(nèi)膜的通透性進行控制，抑制了細胞線粒體膜電位的降低、細胞色素C和凋亡起始因子的釋放以及Caspase蛋白酶的激活，從而抑制凋亡。

以上研究結果為開展牛Bcl-2基因和蛋白功能及其作用機制奠定了基礎。

4 致謝

江西農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院黃璐佳碩士對研究給予了幫助，謹致謝意！