王亮，張懿翔，劉洋

（上海市質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)技術(shù)研究院國家食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心（上海），上海200233）

0 引 言

克羅諾桿菌屬營養(yǎng)要求低，環(huán)境耐受性強(qiáng)，具有較強(qiáng)的耐熱、耐寒和抗干燥能力，廣泛存在于大自然中。生活中的各種食品：餅干、巧克力、堅果、水果等均會受到克羅諾桿菌屬的不同程度的污染[1]，它也是嬰幼兒配方乳粉中常見的革蘭氏陰性致病菌，會對免疫力低下的人群特別是嬰幼兒的健康造成嚴(yán)重危害，可引發(fā)壞死性小腸結(jié)腸炎、菌血癥和新生兒腦膜炎等疾病，甚至可能留下嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥，死亡率高達(dá)高達(dá)40%~80%[2]。

1 克羅諾桿菌屬的分類和致病性

克羅諾桿菌屬的分類經(jīng)歷了4個階段：最初發(fā)現(xiàn)時根據(jù)其能產(chǎn)生黃色素被命名為黃色陰溝腸桿菌，1980年FARMER通過DNA雜交、生化反應(yīng)、抗生素敏感性檢測等發(fā)現(xiàn)它與陰溝腸桿菌有所區(qū)別，因此更名為阪崎腸桿菌(Enterobacter sakazakii)[3]，2007年IVERSEN等利用多種現(xiàn)代分類技術(shù)將其劃分為腸桿菌科下克羅諾桿菌屬，該屬包括6個種[4]。2012年，JOSEPH等在IVERSEN等人的基礎(chǔ)上采用16SrRNA基因序列分析和多位點(diǎn)測序(Multilkocus sequence typing，MLST)技術(shù)，將克羅諾桿菌屬分為7個種分別是：阪崎克羅諾桿菌(Cronobacter sakazakii)、丙二酸鹽克羅諾桿菌(Cronobacter malonaticus)、蘇黎世克羅諾桿菌(Cronobacter turicensis)、莫金斯克羅諾桿菌(Cronobacter muytjensii)、都柏林克羅諾桿菌(Cronobacter dublinensis)、康迪蒙提克羅諾桿菌(Cronobacter condimenti)、尤尼沃斯克羅諾桿菌(Cronobacter universalis)[5]。

克羅諾桿菌屬的7個種都具有致病性，其致病性與類腸毒素、內(nèi)毒素以及外膜蛋白有關(guān)，不同種之間的毒力表型差異較大[6]。據(jù)調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)2012年重慶市旗山村4名兒童因克羅諾桿菌屬引起食物中毒，2013年溫州和上海也有嬰兒疑似感染的病例[7]。2019年10月6日和10月30日，加拿大食品檢驗(yàn)局就疑似克羅諾桿菌屬感染問題分別發(fā)布警告緊急召回President’s Choice低鐵嬰兒配方奶粉和Parent’s Choice嬰兒配方奶粉。目前，克羅諾桿菌屬已被FAO和WHO共同列為A類致病菌，嚴(yán)重威脅著人體的健康，因而建立相關(guān)的檢測方法尤其是快速檢測方法，能夠幫助企業(yè)及時發(fā)現(xiàn)和召回問題產(chǎn)品，對于食品生產(chǎn)環(huán)節(jié)控制及食品安全監(jiān)管及疾病預(yù)防控制等方面都有極其重要的意義。

2 克羅諾桿菌屬的檢測方法和等溫擴(kuò)增技術(shù)

克羅諾桿菌屬的檢測方法主要分為國標(biāo)生理生化檢測和分子核酸檢測兩大類，早期的生理生化檢測方法存在針對性不強(qiáng)、選擇性不佳等諸多問題[8-9]，國際標(biāo)準(zhǔn)化組織和國際乳品聯(lián)合會，不斷優(yōu)化和完善后形成了ISO/TS 22964-2006檢測方法，我國現(xiàn)行的GB 4789.40-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn)克羅諾桿菌屬（阪崎腸桿菌）檢驗(yàn)》也是基于該方法制定而成。常規(guī)生化檢測，需要經(jīng)過培養(yǎng)增菌、分離篩選、生化鑒定等步驟，增菌時間就要2 d之久，整個檢測流程至少5 d以上，流程繁復(fù)且耗時耗力，無法滿足現(xiàn)代對致病菌快速篩查的要求?，F(xiàn)代微生物鑒定已不再局限于觀察菌體形態(tài)結(jié)構(gòu)及生理生化特性，可以從分子遺傳出發(fā)來鑒定微生物種屬。分子核酸檢測具有快速、高效、特異、靈敏度高等特點(diǎn)，主要通過檢測目標(biāo)病原體中的特定DNA或RNA序列來實(shí)現(xiàn)。綜合目前國內(nèi)外研究進(jìn)展，克羅諾桿菌屬檢測用到的目標(biāo)靶基因主要有：16SrRNA、ITS、α-葡萄糖苷酶、外膜蛋白(ompA)、rpoB、gyrB等[10-14]。相關(guān)技術(shù)包括：PCR、RT-PCR（實(shí)時熒光定量PCR）、dd PCR、CRISPR、寡核苷酸DNA微陣列等。

在普通PCR基礎(chǔ)上發(fā)展起來的等溫擴(kuò)增技術(shù)，由于無需熱循環(huán)儀等設(shè)備、靈敏度高以及操作便捷等優(yōu)勢被廣泛應(yīng)用于現(xiàn)場食品、環(huán)境等病原微生物的快速檢測。本文將重點(diǎn)綜述包括環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增、重組酶聚合酶等溫擴(kuò)增、滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)、依賴解旋酶擴(kuò)增在內(nèi)的不同等溫擴(kuò)增技術(shù)的相關(guān)原理及其在克羅諾桿菌屬快速檢測中的應(yīng)用情況，旨在為完善和改進(jìn)克羅諾桿菌屬的快速檢測方法提供相關(guān)理論依據(jù)。

2.1 環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）

LAMP技術(shù)由日本人Notomi在2000年發(fā)明[15]，通過針對目標(biāo)基因的6個區(qū)域設(shè)計4條特異性引物，在鏈置換DNA聚合酶作用下，（60~65℃）條件下完成恒溫擴(kuò)增。具有操作簡單、靈敏度高，但引物設(shè)計復(fù)雜，存在多條引物相互作用以及氣溶膠造成的假陽性問題。李莉,陳澤輝采用LAMP法檢測阪崎克羅諾桿菌，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示LAMP試劑盒對人工污染的嬰兒配方奶粉中的阪崎克羅諾桿菌的檢出限為20 CFU/mL，其靈敏度明顯高于國標(biāo)生化鑒定法，同時該方法從DNA提取到LAMP擴(kuò)增結(jié)束僅需1.5 h[16]，而國標(biāo)生化鑒定法分離培養(yǎng)到鑒定至少需要3 d以上。石偉雄等人采用了實(shí)時熒光環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)，通過在LAMP反應(yīng)體系中加入熒光染料，利用ESE Quant TS-LAMP擴(kuò)增儀實(shí)時收集熒光信號來監(jiān)控LAMP反應(yīng)的進(jìn)程，其檢測阪崎克羅諾桿菌的靈敏度可達(dá)到8×10-2CFU/mL[17]。

2.2 重組酶聚合酶等溫擴(kuò)增技術(shù)（recombinase polymerase amplification，RPA）

RPA技術(shù)通過重組酶與引物結(jié)合形成蛋白-DNA復(fù)合物，一旦同源序列被引物定位即可發(fā)生鏈交換反應(yīng)，DNA合成啟動并進(jìn)行指數(shù)擴(kuò)增[18]。該反應(yīng)只需在37℃條件下進(jìn)行，15 min即可完成。該技術(shù)對PCR抑制劑有一定耐受力，因而被廣泛用于疾病診斷和致病菌的檢測。陳純陽等人將RPA與免疫層析試紙條（lateral flow strip，LF）相結(jié)合，利用生物素和地高辛修飾引物，進(jìn)而形成標(biāo)記的DNA產(chǎn)物，最后擴(kuò)增產(chǎn)物與膠體金標(biāo)記的地高辛抗體及試紙條上固定的鏈霉親和素發(fā)生特異性結(jié)合，只要20 min便可通過肉眼便觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。該方法檢測阪崎克羅諾桿菌菌液的檢出限可達(dá)1.7×102CFU/m L[19]。

2.3 滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)（Rolling circle amplification，RCA）

RCA技術(shù)通過借鑒環(huán)狀質(zhì)粒及病毒的DNA滾環(huán)式自主復(fù)制，其關(guān)鍵步驟在于通過粘性末端或平末端成環(huán)的方式構(gòu)建環(huán)狀DNA模板[20]。Ju Liu等人建立了利用不對稱拖尾PCR（AT-PCR）觸發(fā)滾環(huán)擴(kuò)增（RCA）的雙重信號放大來檢測克羅諾桿菌屬的技術(shù)。首先2個平末端發(fā)卡DNA在T 4DNA連接酶作用下形成啞鈴狀DNA，同時不對稱拖尾PCR形成大量ssDNA，啞鈴狀DNA與ssDNA雜交觸發(fā)RCA反應(yīng)，進(jìn)而形成大量G-四鏈體結(jié)構(gòu)DNA。該結(jié)構(gòu)能與熒光染料硫黃素T(ThT)特異性結(jié)合，通過收集熒光信號得到檢測結(jié)果[21]。Yunzhe Zhang等人在RCA基礎(chǔ)上創(chuàng)新發(fā)明了SRCA技術(shù)，該技術(shù)可實(shí)現(xiàn)引物自身不擴(kuò)增而目的基因擴(kuò)增的效果，具有方法簡單、耗時短，省去了RCA中環(huán)化和連接酶構(gòu)建環(huán)狀DNA鏈的關(guān)鍵步驟，1.5 h即可完成反應(yīng)。由于反應(yīng)中d NTPs在合成DNA鏈時同時形成焦磷酸根離子，和反應(yīng)體系中的鎂離子形成焦磷酸鎂沉淀。結(jié)果可以通過添加熒光染料或離心觀察沉淀，可用于現(xiàn)場快速檢測，在純培養(yǎng)條件下通過肉眼觀察的檢測限為3.4×102CFU/g，染料法的檢測限為3.4×101CFU/g[22]。

2.4 依賴解旋酶擴(kuò)增技術(shù)（Helicase-dependent amplification，HDA）

HDA技術(shù)，2004年紐英倫生物實(shí)驗(yàn)室根據(jù)活體細(xì)胞中DNA解旋酶解開雙鏈DNA進(jìn)行復(fù)制的機(jī)制，設(shè)計了一種新型的DNA體外擴(kuò)增技術(shù)-HAD[23]。HDA反應(yīng)需要DNA解旋酶、DNA聚合酶、輔助蛋白和可選擇的單鏈DNA結(jié)合蛋白（SSB）等多種蛋白相互協(xié)作、共同完成DNA擴(kuò)增。依據(jù)擴(kuò)增過程中解旋酶的不同種類，主要分成以下幾種：常溫HDA（Mesophilic form of HDA，m HDA）；耐熱型HDA（Thermophilic helicase dependent amplification，tHDA）；環(huán)狀HDA（Circular HDA，c HDA）。HDA作為簡單的等溫擴(kuò)增，不需要復(fù)雜的引物，反應(yīng)底物要求低，可以是菌體細(xì)胞、血液樣本等。Xu Di等人采用商品化的tHDA試劑盒，對經(jīng)過二氧化硅包裹的磁性納米粒子快速分離獲得的DNA進(jìn)行特異性擴(kuò)增，最后通過加入熒光染料，檢測熒光信號，3 h內(nèi)便可完成檢測，純培養(yǎng)物的檢測限達(dá)到100 CFU/mL[24]。

表1 近5年包括等溫擴(kuò)增技術(shù)在內(nèi)的分子檢測方法在克羅諾桿菌屬中的具體應(yīng)用

3 發(fā)展趨勢

3.1 縮短目標(biāo)菌富集時間

目前快速檢測在滿足其檢測靈敏度條件下如何壓縮檢測時間實(shí)效快速的目的是未來需要解決的技術(shù)難題之一。常規(guī)進(jìn)行檢驗(yàn)時都需要2 d以上的增菌培養(yǎng)，這雖然一定程度上降低了檢出限并提高了靈敏度，但是耗費(fèi)了大量檢測時間。目前已有相關(guān)方法可以有效縮短甚至不用增菌，如：Qiming Chen等人通過免疫磁珠及磁性納米粒子進(jìn)行快速富集，使用能作用于克羅諾桿菌屬外膜蛋白A（ompA）的多克隆抗體構(gòu)建免疫磁珠，可以迅速分離目標(biāo)克羅諾桿菌屬，有效縮短富集培養(yǎng)時間[27]。Xu Di等人采用二氧化硅包裹的磁性納米粒子分離技術(shù)，無需前期增菌富集。二氧化硅包裹的磁性顆粒具有超順磁性能,可吸附溶液中的核酸分子,在外加磁場作用下將負(fù)載核酸的磁性納米顆?？梢詮臉悠啡芤褐蟹蛛x出來，磁性納米粒子經(jīng)過溶液洗脫便可獲得純化的核酸，該技術(shù)提取DNA時間不到半小時。

3.2 結(jié)果直觀易讀

直接易讀的檢測結(jié)果便于實(shí)驗(yàn)人員快速作出判斷，也是未來快速檢測發(fā)展的方向。對于擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測方法主要有電化學(xué)和光學(xué)檢測，后者適用于現(xiàn)場的快速檢測，等溫擴(kuò)增通?？梢院蜔晒馊玖?、免疫試紙條法、濁度法及比色法聯(lián)用。其中紙質(zhì)材料由于其具有輕、薄、便宜、來源廣泛等特點(diǎn)，由此發(fā)展起來的側(cè)向流層析試紙條技術(shù)和等溫擴(kuò)增等分子檢測手段聯(lián)用被廣泛用于病原微生物的快速檢測領(lǐng)域[28]。姜毓君等人利用免疫磁分離和金納米雜交探針策略，開發(fā)了一種快速和靈敏的可視化檢測嬰幼兒配方乳粉中阪崎克羅諾桿菌的方法，直觀結(jié)果和電泳及紫外掃描光譜結(jié)果一致。

3.3 多重技術(shù)融合

采用兩種及以上檢測技術(shù)聯(lián)用，進(jìn)而放大檢測信號，提高檢測靈敏度和特異性，降低結(jié)果的假陽性。除等溫擴(kuò)增技術(shù)外，CRISPR（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats）作為2017年新問世的檢測技術(shù)被譽(yù)為“下一代的分子檢測技術(shù)”，具有“快速、靈敏、高特異、簡便、低價”的特性，被廣泛應(yīng)用于病毒及病原菌的檢測，其靈敏度與Taqman方法的熒光定量PCR接近[29]。與熒光定量技術(shù)相比，具有無需大型擴(kuò)增檢測設(shè)備、成本低等優(yōu)點(diǎn)。Chen JS等人基于CRISPR法將Cas12a和Cas14蛋白與RPA結(jié)合用于HPV病毒的快速檢測，其靈敏度和特異性都顯著提高，靈敏度達(dá)到了attomolar水平，特異性≤7個堿基[30-31]。所以CRISPR和等溫擴(kuò)增等技術(shù)結(jié)合用于克羅諾桿菌屬的快速檢測也是非常值得研究一個重要方向。

4 結(jié)束語

克羅諾桿菌屬作為一種廣泛分布的食源性致病菌，食品加工的任何環(huán)節(jié)，包括原料的選擇、加工、儲藏、運(yùn)輸、銷售等環(huán)節(jié)都存在潛在污染風(fēng)險。食品尤其是嬰幼兒配方乳粉的質(zhì)量安全一直是整個社會關(guān)注的焦點(diǎn)，這急需科研和檢測人員開發(fā)針對克羅諾桿菌屬等致病微生物的快速、特異、簡單、便捷的檢測技術(shù)。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的不斷進(jìn)步，等溫擴(kuò)增等分子檢測技術(shù)也將不斷迭代更新，如何高效融合各項檢測技術(shù)將是未來致病微生物快速檢測技術(shù)需要探索的方向。