陳毅堅(jiān)，張建前，胡秋月，楊發(fā)濤，呂吉升，杜剛

（云南民族大學(xué)民族醫(yī)藥學(xué)院，昆明650500）

0 引 言

乳酸菌是乳桿菌屬、乳球菌屬等革蘭氏陽(yáng)性菌的統(tǒng)稱[1-2]。它們?cè)诰S持機(jī)體的生態(tài)平衡、調(diào)節(jié)免疫等生理機(jī)能方面有重要調(diào)節(jié)作用[3-4]。

現(xiàn)已有酵母菌參與發(fā)酵乳共發(fā)酵，乳酸菌與酵母菌共生機(jī)制的研究報(bào)告[5-6]，但乳酸菌和食用酵母菌混菌發(fā)酵乳品風(fēng)味物質(zhì)的研究報(bào)道較少。風(fēng)味物質(zhì)是區(qū)別不同食品質(zhì)量特征的指標(biāo)之一[7]。不同乳制品中的乳酸、芳香類風(fēng)味物質(zhì)賦予乳制品獨(dú)特的風(fēng)味[8]。乳制品研究主要集中于發(fā)酵條件[9]、發(fā)酵劑的使用[10]、色素使用[11]等方面，開(kāi)展乳酸菌與食用酵母菌混菌發(fā)酵的乳制品中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的研究，分析兩種益生菌混菌發(fā)酵與乳酸菌單菌發(fā)酵乳制品在風(fēng)味物質(zhì)上的區(qū)別，為不同益生菌混菌發(fā)酵型乳制品的風(fēng)味物質(zhì)變化提供基礎(chǔ)研究資料。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材料和試劑

（1）乳酸菌來(lái)源于市售7種酸奶，酵母菌來(lái)源于1種自釀甜米酒。

（2）分離培養(yǎng)基和分子實(shí)驗(yàn)材料。乳酸細(xì)菌培養(yǎng)基（MRS）用于分離酸奶樣品中的乳酸菌（MRS固體培養(yǎng)基）和增菌培養(yǎng)（MRS液體培養(yǎng)基），馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）用于甜米酒樣品中酵母菌的分離(PDA固體培養(yǎng)基）和增菌培養(yǎng)(PDA液體培養(yǎng)基），酵母浸出粉葡萄糖培養(yǎng)基（YPD液體培養(yǎng)基）用于提取DNA的乳酸菌和酵母菌菌體的培養(yǎng)Q 5超保真DNA聚合酶（紐英倫生物技術(shù)北京有限公司），TE緩沖液，1×CTAB緩沖液，1×TAE緩沖液。

乳酸菌的PCR擴(kuò)增引物為16SP1和16SP2[12]，酵母菌的PCR擴(kuò)增引物為26S NL1和26S NL4[13]，4種引物均合成于昆明碩擎生物技術(shù)有限公司。

表1 PCR擴(kuò)增的引物序列

1.2 儀器

高壓蒸氣滅菌鍋，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；超凈工作臺(tái)，蘇凈集團(tuán)安泰公司；離心機(jī)，湖南湘立科學(xué)有限公司；恒溫干燥培養(yǎng)箱，廣東省醫(yī)療器械廠；恒溫?fù)u床，上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司；電子天平，上海奕宇電子科技有限公司；光學(xué)顯微鏡，寧波舜宇儀器有限公司；電泳儀，北京六一生物科技有限公司；EN 61326-PCR儀，北京泰克儀器有限公司；WD-9413B凝膠成像分析儀，北京六一生物科技有限公司；75μm CAR/PDMS萃取纖維頭，美國(guó)Supelco公司；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（DB-FFAP石英毛細(xì)柱），美國(guó)Perkin Elmer公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌與酵母菌的分離純化及鑒定

1.3.1.1 乳酸菌與酵母菌的分離純化

采用樣品稀釋梯度涂布平板方法，將7種酸奶樣品和1種甜米酒樣品的10-2、10-3、10-44個(gè)梯度稀釋液分別涂布于事先備好的MRS、PDA平板上，酸奶樣品涂布的MRS固體平板培養(yǎng)基，置于37℃的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)；自釀甜米酒樣品涂布的PDA固體培養(yǎng)基，置于28℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；定期觀察菌落的生長(zhǎng)狀況，并挑選符合乳酸菌和酵母菌菌落特征的菌株進(jìn)行純化，獲得的疑似乳酸菌用MRS液體培養(yǎng)基增菌培養(yǎng)，疑似酵母菌用PDA液體培養(yǎng)基增菌培養(yǎng)。之后將獲得的菌株保藏于4℃的低溫環(huán)境中。

1.3.1.2 乳酸菌與酵母菌的形態(tài)學(xué)觀察

將獲得的平板培養(yǎng)物進(jìn)行形態(tài)特征的觀察，并記錄特征。對(duì)酸奶樣品中分離純化得到的菌株革蘭氏染色，鏡檢記錄細(xì)胞顯微結(jié)構(gòu)和染色情況；甜米酒樣品中分離得到的菌株，用2%的伊紅染液染色，鏡檢細(xì)胞顯微結(jié)構(gòu)和細(xì)胞的染色情況。

1.3.1.3 乳酸菌與酵母菌的分子鑒定

（1）乳酸菌和酵母菌DNA的提取。將分離純化獲得的疑似乳酸菌菌株RSJ-1和酵母菌菌株JMJ-1活化好后分別接種于YPD液體培養(yǎng)基中，37℃的恒溫培養(yǎng)3~4 d后轉(zhuǎn)入新的YPD液體培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)，再取繼代培養(yǎng)的菌體分別提取DNA，保藏于-20℃的冰箱中保藏。其中，菌株RSJ-1中的DNA用熱裂解法[14]提取，菌株JMJ-1中的DNA用CTAB法提取。

（2）乳酸菌與酵母菌的PCR擴(kuò)增。以Q 5超高保真DNA聚合酶進(jìn)行菌株特定序列的PCR擴(kuò)增，酸奶樣品中RSJ-1菌株的擴(kuò)增引物為16SP1和16S P2；甜米酒樣品JMJ-1菌株的擴(kuò)增引物為26S NL1和26S NL4。PCR的擴(kuò)增體系和循環(huán)條件如表2和表3所示。

表2 PCR的擴(kuò)增體系

表3 PCR的循環(huán)體系

（3）乳酸菌與酵母菌的分子鑒定。菌株RSJ-1和JMJ-1在PCR擴(kuò)增后，配制0.1%的瓊脂凝膠進(jìn)行PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳儀檢測(cè)分析，對(duì)PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物條帶進(jìn)行瓊脂凝膠回收送樣測(cè)序，測(cè)序由昆明碩擎生物技術(shù)有限公司代理完成。

1.3.2 乳酸菌與酵母菌混菌發(fā)酵乳制品風(fēng)味物質(zhì)的研究

（1）樣品制作。用上述分離獲得的乳酸菌菌株RSJ-1制作單菌發(fā)酵乳制品對(duì)照樣品，同時(shí)也用菌株RSJ-1與JMJ-1制作混菌乳制品樣品。

（2）樣品的預(yù)處理。取10 g乳制品對(duì)照樣品和10 g混菌發(fā)酵乳制品樣品分別加入20 mL的頂空瓶中，分別加入3 g NaCl和攪拌子，密封頂空瓶瓶口，于40℃的恒溫水浴中平衡10 min。將萃取纖維頭插入頂空瓶中吸附30 min（萃取纖維頭不接觸樣品），從頂空瓶中拔出萃取頭，將其插入氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀中，啟動(dòng)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測(cè)[15-17]。

（3）單菌發(fā)酵乳制品對(duì)照樣品與混菌發(fā)酵乳制品樣品的GC/MS測(cè)定。①GC/MS的參數(shù)條件。氣相色譜條件[18-19]：程序升溫為初始溫度40℃，維持2 min，以5℃/min的速度上升至200℃，繼續(xù)以10℃/min的速度上升至240℃，維持2 min。進(jìn)樣口溫度250℃，傳輸線溫度200℃，以氦氣為載氣，分流進(jìn)樣，分流比為50∶1，柱流量1 mL/min，總流量為2 mL/min。質(zhì)譜條件：電離方式EI，電子能量70 eV；離子源溫度180℃，質(zhì)量掃描范圍m/z35-500。②數(shù)據(jù)處理。以參考文獻(xiàn)及標(biāo)準(zhǔn)圖譜的結(jié)果進(jìn)行核對(duì)，得出相應(yīng)的鑒定結(jié)果，對(duì)得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行分類整理，分析出單菌和混菌發(fā)酵乳制品中風(fēng)味物質(zhì)的變化情況[20-21]。

2 結(jié)果和分析

2.1 乳酸菌與酵母菌的分離純化及鑒定結(jié)果

從酸奶樣品中共分離得到了6株菌株，分別編號(hào)為RSJ-1、RSJ-2、RSJ-3、RSJ-4、RSJ-5、RSJ-6；甜米酒樣品中分離得到1株菌株，編號(hào)為JMJ-1；經(jīng)過(guò)菌株形態(tài)學(xué)觀察，所獲菌株特征符合乳酸菌與酵母菌特征，初步鑒定為乳酸菌和酵母菌。選取乳酸菌菌株RSJ-1和酵母菌菌株JMJ-1用于后續(xù)研究，兩株菌的形態(tài)特征見(jiàn)圖1。

圖1 分離獲得的菌株菌落和細(xì)胞形態(tài)特征

圖1 中，（a）分離自酸奶樣品的乳酸菌菌株RSJ-1的菌落形態(tài)；（b）乳酸菌菌株RSJ-1細(xì)胞形態(tài)(16*100×)；(c)分離自甜米酒樣品的酵母菌菌株JMJ-1的菌落形態(tài)；(d)酵母菌菌株JMJ-1的細(xì)胞形態(tài)(16*100×)。

2.2 乳酸菌與酵母菌的分子鑒定結(jié)果

分離獲得的乳酸菌菌株RSJ-1和酵母菌菌株JMJ-1，PCR結(jié)果顯示RSJ-1菌株的DNA的長(zhǎng)度為1401 bp（堿基對(duì)），進(jìn)化樹(shù)分析的結(jié)果顯示該菌株歸屬于乳酸菌屬；自釀甜米酒樣品中分離得到的JMJ-1菌株的DNA的長(zhǎng)度在為585 bp（堿基對(duì)），進(jìn)化樹(shù)分析的結(jié)果顯示該菌種歸屬于酵母菌屬。PCR擴(kuò)增圖見(jiàn)圖2、圖3，分子進(jìn)化樹(shù)圖見(jiàn)圖4、圖5。

圖2 酸奶樣品菌株RSJ-1的PCR擴(kuò)增凝膠圖

圖3 自釀甜米酒樣品菌株JMJ-1的PCR擴(kuò)增凝膠圖

圖4 菌株RSJ-1的基于16SrRNA基因序列的分子進(jìn)化樹(shù)

圖5 菌株JMJ-1基于26SrRNA基因序列的分子進(jìn)化樹(shù)

2.3 乳酸菌與酵母菌混菌發(fā)酵乳制品風(fēng)味物質(zhì)的測(cè)定結(jié)果

2.3.1 乳酸菌單菌發(fā)酵和乳酸菌與酵母菌混菌發(fā)酵乳制品樣品制作

采用乳酸菌單菌發(fā)酵和乳酸菌與酵母菌混菌發(fā)酵制作的乳制品品質(zhì)特征見(jiàn)表4。

表4 乳酸菌與酵母菌混菌發(fā)酵乳制品試驗(yàn)結(jié)果

2.3.2 兩種樣品的GC/MS測(cè)定結(jié)果

乳酸菌單菌發(fā)酵乳制品樣品和乳酸菌酵母菌混

菌發(fā)酵乳制品樣品的GC/MS的檢測(cè)結(jié)果顯示，單菌發(fā)酵樣品中共檢測(cè)出40種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，混菌樣品中共檢測(cè)出24種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。GC/MS測(cè)定結(jié)果如圖6和圖7所示。單菌發(fā)酵乳制品與混菌發(fā)酵乳制品樣品的揮發(fā)性物質(zhì)及其相對(duì)含量表見(jiàn)表5。

表5 單菌發(fā)酵乳制品對(duì)照樣品與混菌發(fā)酵乳制品樣品的揮發(fā)性物質(zhì)及其相對(duì)含量

圖6 單菌發(fā)酵對(duì)照樣品的GC/MS結(jié)果

圖7 混菌發(fā)酵乳制品樣品的GC/MS結(jié)果

2.3.3 兩種樣品揮發(fā)性成分的分析

單菌發(fā)酵對(duì)照樣品和混菌發(fā)酵樣品的GC/MS檢測(cè)結(jié)果顯示，兩種乳制品樣品的揮發(fā)性成分主要為酸類、醇類、酯類、酮類、醛類和烴類物質(zhì)。

（1）酸類。單菌發(fā)酵對(duì)照樣品中檢測(cè)出14種酸類物質(zhì)，混菌發(fā)酵樣品中檢測(cè)出9種酸類物質(zhì)，兩種發(fā)酵乳制品樣品中都產(chǎn)生了乳酸、辛酸、癸酸、十二酸和十四酸5種酸類物質(zhì)，其中，單菌對(duì)照樣品中乳酸的相對(duì)含量達(dá)到了3.4，遠(yuǎn)高于混菌發(fā)酵乳制品樣品中的乳酸含量，乳酸是乳制品產(chǎn)生酸味的主要物質(zhì)。

（2）醇類。單菌發(fā)酵的對(duì)照樣品中僅產(chǎn)生了3-呋喃甲醇一種醇類物質(zhì)，而混菌發(fā)酵樣品中產(chǎn)生了3-甲基丁醇、2，3-丁二醇、2-呋喃甲醇和苯乙醇四種醇類物質(zhì)，3-呋喃甲醇、3-甲基丁醇和2，3-丁二醇的相對(duì)含量都達(dá)到了1.1以上，其中的3-甲基丁醇的相對(duì)含量達(dá)到了5.6，苯乙醇相對(duì)含量達(dá)到了2.82，說(shuō)明加入酵母菌促進(jìn)了發(fā)酵乳制品中醇類物質(zhì)的產(chǎn)生，并極大地提升了3-甲基丁醇含量，是乳制品產(chǎn)生酒香味的主要物質(zhì)之一。

（3）酯類。兩種發(fā)酵乳制品樣品中共檢測(cè)出7種酯類物質(zhì)，單菌發(fā)酵樣品中檢測(cè)出6種酯類物質(zhì)，混菌樣品中檢測(cè)出2種酸類物質(zhì)，僅有癸酸乙酯為兩種乳制品樣品都產(chǎn)生的酯類物質(zhì)，并且7種酯類物質(zhì)的相對(duì)含量都小于1，酯類的產(chǎn)量較低。

（4）酮類。單菌發(fā)酵對(duì)照樣品中檢測(cè)出6種酮類物質(zhì)，混菌發(fā)酵樣品中檢測(cè)出3種酮類物質(zhì)，兩種樣品產(chǎn)生不同的酮類物質(zhì)，且酮類物質(zhì)的相對(duì)含量都小于1，酮類的產(chǎn)量較低。

（5）醛類。兩種發(fā)酵乳制品樣品中共檢測(cè)出7種醛類物質(zhì)，單菌發(fā)酵對(duì)照樣品中檢測(cè)出7種醛類物質(zhì)，混菌樣品中檢測(cè)出其中的3種醛類物質(zhì)，兩種發(fā)酵乳制品樣品中5-羥甲基糠醛的相對(duì)含量都大于1，相對(duì)含量較高，混菌發(fā)酵樣品中的5-羥甲基糠醛含量約為單菌發(fā)酵對(duì)照樣品中的3倍。

（續(xù)表5）

（6）烴類。單菌發(fā)酵對(duì)照樣品中檢測(cè)出6種烴類物質(zhì)，混菌發(fā)酵樣品中檢測(cè)出3種烴類物質(zhì)，其中的2，2-對(duì)二苯酚丙烷在兩種發(fā)酵乳制品樣品中相對(duì)含量大于1，單菌發(fā)酵對(duì)照樣品中2，2-對(duì)二苯酚丙烷的含量約為混菌發(fā)酵樣品中的3倍。

3 結(jié) 論

本研究用乳酸菌單菌發(fā)酵乳制品和乳酸菌酵母菌的混菌發(fā)酵乳制品試驗(yàn)比較可看出，兩種方式產(chǎn)生的風(fēng)味物質(zhì)均較多，均含有酸類、醇類、酯類、酮類、醛類、烴類，加入酵母菌的混菌發(fā)酵可降低產(chǎn)酸量，增加醇類風(fēng)味成分物質(zhì)如苯乙醇、3-甲基丁醇的含量，產(chǎn)生種類較多的酯類，形成含量較高的5-羥甲基糠醛，2，2-對(duì)二苯酚丙烷等醛類，烴類風(fēng)味物質(zhì)，研究結(jié)果可為采用不同益生菌混菌發(fā)酵加工乳制品的方法提供借鑒。