周浩，劉繼超，趙軍英，喬為倉，劉璐，鄭健強(qiáng)，陳歷俊

（1.北京三元食品股份有限公司，北京100163;2.大連工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，遼寧大連116034）

0 引 言

乳業(yè)是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)和食品工業(yè)重要組成部分，是健康中國、強(qiáng)壯民族不可或缺的產(chǎn)業(yè)。目前我國已躋身世界乳品生產(chǎn)和消費(fèi)大國之列，據(jù)相關(guān)機(jī)構(gòu)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，中國乳牛最高存欄量曾達(dá)到1 700萬頭，2019年存欄維持在500余萬頭；2018年牛乳年產(chǎn)量達(dá)3 750萬t，乳制品消費(fèi)量接近4 000萬t。低效的家庭飼養(yǎng)逐漸被高效的規(guī)?；B(yǎng)殖替代，截至2019年全國64%牧場形成規(guī)?；B(yǎng)殖，奶牛存欄量從幾百頭到上萬頭不等。幾乎所有牧場都實(shí)現(xiàn)機(jī)械化，并且隨著人工智能的發(fā)展，智能養(yǎng)殖、智慧農(nóng)牧等概念也不斷被提出。而隨著養(yǎng)殖方式的改變，各種問題也接踵而來。高度集中的飼養(yǎng)方式導(dǎo)致傳染病發(fā)生率提高，作為治療首選的抗生素在畜牧養(yǎng)殖業(yè)中大量使用，使得環(huán)境中耐藥微生物及耐藥基因數(shù)量急劇增加并隨食物鏈等途徑不斷擴(kuò)散。微生物耐藥即微生物進(jìn)化過程中對(duì)抗菌藥物耐受性的增強(qiáng)，不但會(huì)影響藥物的療效增加治療成本，還可能對(duì)人體免疫機(jī)制及其它生理特性造成影響。隨著我國乳品需求的增加，乳品安全問題成為關(guān)注焦點(diǎn)，而要提高乳品品質(zhì)，原料奶生產(chǎn)環(huán)節(jié)不容忽視。本文主要針對(duì)牧場乳牛養(yǎng)殖中抗生素使用及其所導(dǎo)致的耐藥性擴(kuò)散問題，就生鮮乳中耐藥微生物、耐藥基因影響現(xiàn)狀，以及牧場中主要存在問題和相關(guān)防治途徑進(jìn)行論述，旨在為牧場中抗生素使用和耐藥微生物防治提供參考。

1 微生物耐藥性產(chǎn)生及現(xiàn)狀

1.1 微生物耐藥性產(chǎn)生

1.1.1 乳品中微生物耐藥性產(chǎn)生原因

生鮮乳極富營養(yǎng)，所以比其它食品更易受到微生物污染，加之生產(chǎn)環(huán)節(jié)復(fù)雜繁多，牛奶衛(wèi)生質(zhì)量極易受到各種因素影響[1-2]。牧場是生鮮乳生產(chǎn)中微生物污染的一個(gè)主要環(huán)節(jié)，見表1。有證據(jù)表明，生鮮乳中主要致病微生物之一的李斯特菌可在農(nóng)場擠奶設(shè)備上聚集[3]，并且其在生產(chǎn)設(shè)備上形成的生物膜（BBF）還是罐裝牛奶中單核增生李斯特菌的潛在污染源[4]。由于生物膜膜內(nèi)基因元件轉(zhuǎn)移[5]、滲透屏障[6]、內(nèi)部環(huán)境改變[7]和群體感應(yīng)（QS）系統(tǒng)調(diào)節(jié)[8]等機(jī)制的影響，其在微生物耐藥性產(chǎn)生過程中也起到很大作用[9]。其次由于生物安保不完善等問題導(dǎo)致子宮炎、乳房炎等疾病發(fā)病率提高，在治療過程中大量使用甚至是濫用抗生素。而微量抗生素的使用就可能在微生物耐藥性的發(fā)展和傳播中發(fā)揮重要作用[10]，1928年發(fā)現(xiàn)青霉素后幾年內(nèi)由于抗生素的使用金黃色葡萄球菌就進(jìn)化出了專門降解抗生素的β-內(nèi)酰胺酶[11]。部分牧場在對(duì)畜群日常管理中無法嚴(yán)格把控各類藥物的用法用量，造成抗生素的過量投放，而有研究表明多種抗生素的聯(lián)合使用可能會(huì)對(duì)其它敏感抗生素耐藥性造成影響[12]。此外一些中小型牧場缺乏成型的抗性檢驗(yàn)環(huán)節(jié)，難以有效應(yīng)對(duì)耐藥微生物的不斷更替。

表1 牧場中可能導(dǎo)致微生物污染及其耐藥性的主要因素

1.1.2 抗生素使用現(xiàn)狀

我國畜牧養(yǎng)殖業(yè)中濫用抗生素的問題較為嚴(yán)重，2012年奶牛畜禽抗生素支出在20億元以上，其導(dǎo)致養(yǎng)殖動(dòng)物及相關(guān)環(huán)境中存在大量耐藥基因以及耐藥細(xì)菌，可能對(duì)生態(tài)環(huán)境、食品安全和人類健康造成威脅[13]。雖然目前歐美等國家已嚴(yán)格限制了畜牧養(yǎng)殖業(yè)中抗生素的使用[14]，我國抗生素用量也呈逐年降低的趨勢(shì)，見表2。但許多發(fā)展中國家抗生素使用量仍快速增長，2000年至2015年間全球抗生素用量增加了65%，且增長速度呈上升趨勢(shì)[15]。

表2 部分國家抗生素使用總量分布情況[16-17]

1.2 微生物耐藥現(xiàn)狀

1.2.1 耐藥微生物危害現(xiàn)狀

目前，耐藥微生物（ARB）導(dǎo)致全球每年超70萬人死亡，其中美國每年發(fā)生280余萬例耐藥菌感染，導(dǎo)致3.5萬例死亡[18]；歐盟每年至少2500名患者死于耐藥菌感染。并且“緊急威脅”耐藥微生物數(shù)量已增加至5種，包括碳青霉烯類耐藥腸桿菌、耐藥性淋球菌、艱難梭狀芽胞桿菌、碳青霉烯類耐藥不動(dòng)桿菌和耳念珠菌。其中碳青霉烯類耐藥不動(dòng)桿菌是世界衛(wèi)生組織列出的1類病原體，兩年間其耐藥率在英國兩所醫(yī)院內(nèi)增加了30%[19]。隨著碳青霉烯類抗生素臨床上的廣泛使用和過度治療，其耐藥范圍已擴(kuò)展至亞洲、歐洲以及非洲等多個(gè)地區(qū)[20]。

生鮮乳生產(chǎn)加工過程中不可避免會(huì)受到外界環(huán)境影響，而由于畜牧業(yè)抗生素的大量使用，乳品成為耐藥微生物重要傳播媒介，其隨食物鏈傳播過程中可能對(duì)生物腸道菌群豐度及耐藥性等造成影響[21-23],并通過影響菌群所介導(dǎo)的脂肪酸代謝等免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)因子而干擾抗體對(duì)流感疫苗反應(yīng)[24]，還可間接增加結(jié)腸癌發(fā)生率[25]，對(duì)人體健康造成威脅。已有研究表明，牧場中超級(jí)細(xì)菌之一耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）菌株檢出率較高，并且其耐藥基因（ARGs）檢出率顯著高于甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌（MSSA）菌株，見表3，多位點(diǎn)序列分型中還出現(xiàn)MRSA-IV型菌株[26-29]。由于乳品中金黃色葡萄球菌等有害微生物耐藥性的增強(qiáng)，其三年間對(duì)澳大利亞、中國和瑞士等國家共造成200余例奶源性微生物感染事件的爆發(fā)[30]。即便是高溫滅菌（UHT）乳，其殘留的少量芽孢在特定環(huán)境下仍有可能繼續(xù)繁殖。采用巴氏殺菌的低溫奶和發(fā)酵乳，耐藥微生物及耐藥基因通過食物鏈進(jìn)入人體的可能性更大[31]。

表3 金黃色葡萄球菌部分耐藥基因及其作用機(jī)制[32-35]

1.2.2 傳播現(xiàn)狀

微生物耐藥機(jī)制主要分為遺傳學(xué)機(jī)制和生化機(jī)制兩個(gè)方面，遺傳學(xué)機(jī)制中獲得性耐藥基因是主要傳播因素，其在牧場中轉(zhuǎn)移現(xiàn)象可影響乳品中耐藥微生物及耐藥基因含量[36-37]。隨著多黏菌素在畜牧養(yǎng)殖業(yè)中廣泛使用，當(dāng)下被普遍認(rèn)為是對(duì)抗耐藥細(xì)菌“最后防線”的多黏菌素mcr-1耐藥基因或已通過食物鏈傳播到中國健康人腸道菌群中[38]。美國CDC抗生素耐藥問題高級(jí)顧問Michael Craig曾說過：“細(xì)菌非常聰明，學(xué)習(xí)能力超強(qiáng)”，在實(shí)驗(yàn)條件下，大腸桿菌對(duì)達(dá)到最低致死濃度1000倍的抗生素產(chǎn)生耐藥性僅需10 d[39]。但在牧場中耐藥基因也不是無限制傳播，其受制于生態(tài)屏障并由種屬進(jìn)化關(guān)系所主導(dǎo)[40]。在對(duì)耐藥基因轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究中通過活細(xì)胞顯微鏡發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞中一個(gè)微小結(jié)構(gòu)AcrAB-TolC多藥物外排泵在耐藥基因轉(zhuǎn)移過程中起到關(guān)鍵作用[41]，它在多數(shù)微生物中廣泛存在通過短暫阻隔為攜帶有耐藥基因質(zhì)粒爭取時(shí)間，介導(dǎo)了固有和獲得性多藥耐藥[42]。已知外排泵系統(tǒng)主要包括耐藥結(jié)節(jié)化細(xì)胞分化（RND）外排泵家族、主要易化因子超家族（MFS）、多重藥物與毒性化合物外排家族（MATE）、小多重耐藥外排泵家族（SMR）和ATP連接盒轉(zhuǎn)運(yùn)體家族（ABC）等[43]。即便是達(dá)到商業(yè)無菌的乳制品，由于基因在生物死后短時(shí)間內(nèi)所維持的活性[44]，仍有可能在多藥物外排泵的幫助下影響腸道內(nèi)細(xì)菌在基因水平上的藥物抵抗機(jī)制。

2 乳品微生物耐藥性檢測(cè)及預(yù)防途徑

2.1 微生物耐藥性檢測(cè)

目前對(duì)可培養(yǎng)微生物耐藥表型傳統(tǒng)檢測(cè)方法如表4，主要包括肉湯稀釋法、瓊脂稀釋法、E-test試紙法，K-B法、全自動(dòng)儀器分析法等。隨著分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)展耐藥基因檢測(cè)常用PCR技術(shù)，較為便捷可靠，但對(duì)耐藥基因可檢測(cè)種類有局限性。而宏基因組學(xué)[45]憑借其可基于序列或功能篩選分析某種功能基因，并進(jìn)一步深度測(cè)序的特性，是目前較有效的耐藥微生物基因組分析手段?；跍y(cè)序技術(shù)的應(yīng)用，對(duì)于大量耐藥基因的快速檢測(cè)方法[46]也日趨成熟。

表4 微生物藥物敏感性檢測(cè)常規(guī)方法特點(diǎn)

2.2 生鮮乳中微生物耐藥主要預(yù)防途徑

生產(chǎn)加工是導(dǎo)致生鮮乳中耐藥微生物污染的主要因素之一，應(yīng)注重加強(qiáng)人員技術(shù)培訓(xùn)以及污染防控措施改進(jìn)。若條件允許可針對(duì)整條生產(chǎn)鏈設(shè)置相應(yīng)的監(jiān)控環(huán)節(jié)，例如ATP熒光檢測(cè)[51]、微生物測(cè)試片[52]以及全自動(dòng)監(jiān)測(cè)與采樣系統(tǒng)[53]等生產(chǎn)鏈污染程度監(jiān)控快檢技術(shù)的應(yīng)用。此外乳牛養(yǎng)殖中治療各種疾病也會(huì)導(dǎo)致大量抗生素使用，乳房炎就是主要疾病之一。一方面要合理使用抗生素并加強(qiáng)監(jiān)管[54]；另一方面為避免將來無藥可治，需不斷尋求新的解決方法，深入研究細(xì)菌耐藥機(jī)制尤為關(guān)鍵。如生物膜、主動(dòng)外排系統(tǒng)、滅活酶產(chǎn)生、膜通透性改變、作用靶位改變[55]以及其它新發(fā)現(xiàn)的耐藥機(jī)制如耐藥癌細(xì)胞對(duì)脂質(zhì)過氧化酶4（GPX 4）的依賴[56]等都需要更加深入的進(jìn)行解析。

實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)注重降低乳房炎患病率并尋找其它抗生素替代品及替代治療方式減少抗生素使用，加強(qiáng)消毒管理并在飼料中添加富硒益生菌[57]降低患病率、對(duì)癥下藥控制抗生素使用、利用空氣凈化恒溫恒濕等智能化養(yǎng)殖設(shè)備等都能有效緩解這一問題。此外，罌粟科植物提取物博落回（MCE）中含有的芐基異喹啉生物堿的有效成分，是一種促生長抗生素的潛在替代品[58]。在國外乳房炎治療中，對(duì)于由大腸桿菌等引起的環(huán)境乳房炎還提倡自愈，但由于地域差異，這一方法并不適合國內(nèi)乳房炎治療。對(duì)于一些癥狀較輕的牛只還可采用疫苗、非淄類藥物以及催產(chǎn)素促進(jìn)致病菌外排。在非洲等地區(qū)還會(huì)采用人工多次放空乳房的方式進(jìn)行治療。國內(nèi)治療及預(yù)防乳房炎的方法主要包括疫苗、中草藥[59]及抗生素等。其中中草藥療法見效慢，治療不及時(shí)等問題還有待改進(jìn)。目前國內(nèi)只正式批準(zhǔn)了抗生素作為治療乳房炎的方法，因此，相關(guān)政策有待改進(jìn)。

此外，還有噬菌體對(duì)病原微生物的裂解作用[60]、乳區(qū)注入生物氧（臭氧）滅活病原微生物[61]、影響細(xì)菌協(xié)同工作的胞外聚合物（EPS）生物膜抑制劑[62]、針對(duì)耐藥菌感染多株細(xì)菌聯(lián)合的微生態(tài)療法[63]和針對(duì)耐藥微生物群體感應(yīng)（QS）系統(tǒng)的抑制劑中斷療法[64]等多種抗生素替代治療方式，但實(shí)際療效還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。整體來看，雖然目前對(duì)奶牛乳房炎等疾病的治療方法種類較多，但實(shí)際生產(chǎn)中仍然對(duì)抗生素有很強(qiáng)依賴性，無法完全根治牧場中微生物耐藥性加劇的問題。

3 總結(jié)與展望

生產(chǎn)生活中抗生素的大量使用導(dǎo)致微生物耐藥性增強(qiáng)威脅人類健康。對(duì)于微生物耐藥各國都在積極尋求解決方法，但尚無一個(gè)明確有效的方案。目前，畜牧養(yǎng)殖業(yè)中仍然對(duì)抗生素有較強(qiáng)依賴性。隨著各國畜牧養(yǎng)殖業(yè)飼養(yǎng)規(guī)模的擴(kuò)大，耐藥微生物種類及其藥物抵抗機(jī)制趨于復(fù)雜化，對(duì)人類威脅不斷增加。因此，在實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)著重于采取減少病原微生物感染的有效措施，建立完善的抗生素使用標(biāo)準(zhǔn)，加快微生物耐藥機(jī)制研究及抗生素替代品開發(fā)，建立耐藥微生物的全程控制技術(shù)。通過先進(jìn)技術(shù)手段最大程度減緩微生物耐藥性增強(qiáng)，減少其通過食物鏈傳遞對(duì)人類健康的危害，也為耐藥微生物防治對(duì)策的制定提供理論支撐。