龐揚海，甄振鵬*，高裕鋒，黃敏興，余構(gòu)彬

(1廣東省科學(xué)院生物工程研究所，廣東廣州510316；2中國輕工業(yè)甘蔗制糖工程技術(shù)研究中心，廣東廣州510316)

0 引言

我國是食糖消費大國[1-2]，食糖在生產(chǎn)過程中經(jīng)過煮煉環(huán)節(jié)[3]，容易發(fā)生美拉德反應(yīng)。4-甲基咪唑(4-Methylimidazole, 4-MEI)和2-甲基咪唑(2-Methylimidazole, 2-MEI)均是美拉德反應(yīng)的副產(chǎn)物，同時也是神經(jīng)毒素類物質(zhì)，可能誘發(fā)腫瘤、癌癥以及白血病等疾病[4]。2004年，美國國家毒理學(xué)規(guī)劃處(NTP)通過毒理學(xué)動物實驗驗證了4-MEI和2-MEI具有致癌性[5]。2011年，4-MEI和2-MEI被國際癌癥機(jī)構(gòu)(IARC)納入2B級致癌化合物的清單[6]。因此建立食糖中4-MEI和2-MEI的檢測方法，對食糖風(fēng)險評估有非常重要的作用。

目前，食品中4-MEI和2-MEI的檢測方法有包括液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[7-11]、液相色譜法[12-14]、氣相色譜[15]和氣相色譜-質(zhì)譜法[16-17]等。但采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)檢測食糖基質(zhì)中4-MEI和2-MEI含量的檢測方法目前鮮有報道。高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法具有靈敏度高和準(zhǔn)確性可靠的特點[18]，適用于食糖中痕量4-MEI和2-MEI的檢測。因此本研究將探討采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法建立適用于檢測食糖中4-MEI和2-MEI含量的方法，并應(yīng)用此方法檢測市面上銷售的食糖中4-MEI和2-MEI的含量。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

AB 5500 Q-Trap高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國AB SCIEX公司)；UPC-I-60L超純水機(jī)(成都超純科技有限公司)；CL5R大容量冷凍離心機(jī)(湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司)；Multi Reax渦旋振蕩器(德國海道爾夫公司)；AutoEVA-20Plus全自動平行濃縮儀(睿科儀器(廈門)有限公司)；ZEALWAY超聲波清洗機(jī)(致微廈門儀器有限公司)；JE3002GE百分之一電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；XPE105十萬分之一電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)。

4-MEI (99.66%，德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司)；2-MEI (99.90%，北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司)；甲醇(色譜純，德國默克股份兩合公司)；乙腈(色譜純，德國默克股份兩合公司)；甲酸(分析純，廣州化學(xué)試劑廠)；氨水(分析純，廣州化學(xué)試劑廠)；乙醇(分析純，天津富宇精細(xì)化工有限公司)；乙酸銨(分析純，廣州化學(xué)試劑廠)；0.22 μm有機(jī)相濾膜(彼西絡(luò)科技(廣州)有限公司)；MCX固相萃取柱(3 mL，60 mg，美國沃特世公司)；PCX固相萃取柱(3 mL，60 mg，天津博納艾杰爾科技有限公司)；SCX固相萃取柱(6 mL，500 mg，美國賽默飛世爾科技公司)。食糖樣品均在市場上隨機(jī)購買。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別準(zhǔn)確稱取4-MEI和2-MEI標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg用乙腈配制成濃度為1000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，于4℃下避光保存。取上述標(biāo)準(zhǔn)儲備液逐級稀釋，用乙腈-水溶液(V/V=9/1)配制成濃度為20.0、10.0、5.0、2.0、1.0、0.5 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

1.3 提取和凈化

準(zhǔn)確稱取2.0 g食糖樣品于50 mL離心管中，加入10 mL乙醇渦旋混勻2 min，超聲提取5 min后，以4000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min，吸取5 mL上清液氮吹干后，加入2 mL 2%甲酸水復(fù)溶，渦旋混勻，待凈化。

PCX柱依次用5 mL甲醇和5 mL 2%甲酸水活化，取待凈化液上柱，控制流速為1 mL/min，上樣完成后，依次用6 mL 2%甲酸水和6 mL甲醇淋洗，棄去淋洗液。然后用6 mL 5%氨化甲醇洗脫，收集洗脫液，氮吹干，殘渣加入1 mL乙腈-水溶液(V/V=9/1)定容，充分溶解，混合均勻，過0.22 μm濾膜，可根據(jù)樣品實際濃度適當(dāng)稀釋至標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍內(nèi)，供高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀分析。

1.4 HPLC-MS/MS分析

1.4.1 HPLC條件

色譜柱：ACQUITY UPLC BEN HILIC 色譜柱(1.7 μm，100 mm×2.1 mm)；進(jìn)樣量：5.0 μL；柱溫箱溫度為45℃；流動相A：5 mmol/L乙酸銨水溶液(含0.1%甲酸)，流動相B：乙腈；梯度洗脫程序見表1。

表1 液相色譜梯度洗脫程序

1.4.2 質(zhì)譜條件

電離模式：ESI+；儀器參數(shù)：氣簾氣壓力為241.3 kPa，碰撞氣檔位中檔，離子源電壓5500.0 V，離子源溫度為500℃，噴霧氣壓力344.8 kPa，輔助加熱氣壓力344.8 kPa，接口加熱為開；采集模式：多反應(yīng)監(jiān)測MRM，具體參數(shù)如表2所示。

表2 4-MEI和2-MEI的MRM質(zhì)譜參數(shù)

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜和質(zhì)譜條件選擇

4-MEI和2-MEI是同分異構(gòu)體，具有相同的分子質(zhì)量和離子碎片，只依靠質(zhì)譜分析不能準(zhǔn)確區(qū)分2種物質(zhì)，為了準(zhǔn)確地定性定量分析，需要合適的液相色譜條件將其分離。

本研究比較了ACQUITY UPLC BEH C18和ACQUITY UPLC BEH HILIC色譜柱對食糖中的4-MEI和2-MEI分離效果。結(jié)果表明：采用C18作為色譜柱時，這2種待測物均在0.56 min處同時出峰，分離效果差，無法準(zhǔn)確分辨4-MEI和2-MEI，如圖1所示；而采用HILIC作為色譜柱時，4-MEI保留時間為4.66 min，2-MEI保留時間為5.89 min，分離效果好，而且2種物質(zhì)的色譜峰峰形對稱尖銳(圖3)。因此本研究選用ACQUITY UPLC BEH HILIC色譜柱。

圖1 4-MEI和2-MEI標(biāo)準(zhǔn)溶液(20 μg/L)使用C18色譜柱得到的總離子流色譜圖

本研究比較了4-MEI和2-MEI在水-乙腈、5 mmol/L乙酸銨水溶液-乙腈和5 mmol/L乙酸銨水溶液(含0.1%甲酸)-乙腈作為流動相體系時的分析效果。使用水-乙腈為流動相體系時，4-MEI和2-MEI的峰高分別為1170000和2810000 cps，峰寬分別為0.72和0.26 min。使用5 mmol/L乙酸銨水溶液-乙腈時，4-MEI和2-MEI的峰高分別為5820000和4830000 cps，峰寬分別為0.41和0.27 min，所得譜圖如圖2所示；使用5 mmol/L乙酸銨水溶液(含0.1%甲酸)-乙腈作為流動相體系時4-MEI和2-MEI的峰高分別為7560000和8520000 cps，峰寬分別為0.32和0.12 min，得到的譜圖如圖3所示。對比可知使用5 mmol/L乙酸銨水溶液(含0.1%甲酸)-乙腈流動相體系時2種目標(biāo)物分離度最好、響應(yīng)最高、峰型尖銳而對稱。因此本實驗選擇5 mmol/L乙酸銨水溶液(含0.1%甲酸)-乙腈溶液作為流 動相。

圖2 4-MEI和2-MEI標(biāo)準(zhǔn)溶液(20 μg/L)不同流動相體系得到的總離子流色譜圖

本研究也比較了5 mmol/L乙酸銨水溶液(含0.1%甲酸)-乙腈溶液作為流動相時，不同梯度對4-MEI和2-MEI的分離度的影響，優(yōu)化得到最終的洗脫梯度，如表1所示。

質(zhì)譜條件優(yōu)化方法是：在注射泵直接進(jìn)樣的條件下，在正離子模式下進(jìn)行母離子全掃描，分別確定4-MEI和2-MEI的分子離子峰，然后以該分子離子峰為母離子，分別對其子離子進(jìn)行全掃描，獲得二級質(zhì)譜響應(yīng)較強的2個子離子，最后以多反應(yīng)監(jiān)測模式進(jìn)行采集，并獲得去簇電壓和碰撞能量等相關(guān)參數(shù)[19]，具體參數(shù)如表2所示，使所測的質(zhì)譜峰強度最優(yōu)。

在優(yōu)化的色譜和質(zhì)譜條件下進(jìn)樣分析，獲得的4-MEI和2-MEI的總離子流色譜圖如圖3所示，譜圖顯示4-MEI和2-MEI分離度好，峰型對稱，響應(yīng)高，滿足分析檢測的要求。

圖3 4-MEI和2-MEI標(biāo)準(zhǔn)溶液(20 μg/L)的總離子流色譜圖

2.2 提取溶液和固相萃取柱的選擇

4-MEI和2-MEI為同分異構(gòu)體，具有相似的物理性質(zhì)，兩者均易溶于水、醇及一般有機(jī)溶劑中，因此本研究通過加標(biāo)實驗比較了水、甲醇、乙腈和乙醇等4種提取溶劑對2-MEI和4-MEI的回收率的影響。結(jié)果如圖4所示：4-MEI的回收率由高到低對應(yīng)的提取溶劑依次為乙醇、甲醇、乙腈、水；2-MEI的回收率由高到低對應(yīng)的提取溶劑依次為乙醇、乙腈、甲醇、水。綜合考慮對回收率的影響、環(huán)保程度和成本等因素，最終選擇乙醇為提取溶劑。

圖4 分別使用水、甲醇、乙腈和乙醇提取時2-MEI和4-MEI的回收率

本研究也通過加標(biāo)回收實驗比較了MCX固相萃取柱、PCX固相萃取柱和SCX固相萃取柱3種陽離子交換固相萃取柱對待測目標(biāo)物凈化效果和回收率的影響。結(jié)果顯示：這3種固相萃取柱凈化后得到的樣液都是透明澄清的，使用MCX、PCX和SCX固相萃取柱得到的4-MEI回收率分別為76.2%、92.5%、90.0%；2-MEI回收率分別為85.2%、90.5%和88.3%，因此選擇PCX固相萃取柱作為凈化小柱。

2.3 方法線性范圍和檢出限

用乙腈-水(V/V=9/1)配制4-MEI和2-MEI的混合標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，濃度為20.0、10.0、5.0、2.0、1.0、0.5 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，按優(yōu)化后的儀器方法進(jìn)樣分析，以定量離子峰面積為縱坐標(biāo)(y)，以對應(yīng)的濃度為橫坐標(biāo)(x)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，得到線性方程，見表3。

空白食糖樣品加標(biāo)后經(jīng)過前處理得到的樣液，經(jīng)儀器分析，得到色譜圖，根據(jù)信噪比為3(S/N=3)和樣液的稀釋倍數(shù)計算得到檢出限(LOD)，根據(jù)信噪比為10(S/N=10)和樣液的稀釋倍數(shù)計算得到定量限(LOQ)，見表3。

表3 4-MEI和2-MEI的方法檢出限、定量限、線性范圍、線性方程和相關(guān)系數(shù)

2.4 回收率和精密度

空白食糖樣品分別加入5.0、10.0、15.0 μg/kg濃度水平的4-MEI和2-MEI，每個水平做6個平行實驗，得到結(jié)果顯示目標(biāo)物平均回收率在81.2%～96.9%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.4%～5.1%之間，見表4。

2.5 實際樣品測試

利用本方法檢測了市場上隨機(jī)購買的95份食糖樣品，其中白砂糖樣品6份，冰糖樣品2份，方糖樣品1份，赤砂糖樣品52份，紅糖樣品34份。檢測結(jié)果顯示：95份食糖樣品均未檢出2-MEI；6份白砂糖、2份冰糖和1份方糖均未檢出4-MEI；在52份赤砂糖樣品中，有5份未檢出4-MEI，其余47份檢出4-MEI，含量在3.25～518 μg/kg之間；在34份紅糖樣品中，有4份未檢出4-MEI，其余30份檢出4-MEI，含 量 在3.86～92.0 μg/kg之 間。GB1886.64-2015《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑焦糖色》中規(guī)定，4-MEI含量不能超過200 mg/kg[20]，參照此限量目前測得食糖樣品中的4-MEI均在允許范圍內(nèi)。

3 結(jié)論

本研究建立了食糖中4-甲基咪唑和2-甲基咪唑的高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法，樣品經(jīng)乙醇提取，提取液氮吹干，2.0%甲酸水溶液復(fù)溶后，采用PCX固相萃取柱凈化除雜，利用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測。結(jié)果表明，4-MEI和2-MEI在0.5～20.0 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，4-MEI和2-MEI檢出限分別為1.02和0.08 μg/kg，定量限分別為3.40和0.24 μg/kg。在5.0、10.0、15.0 μg/kg的加標(biāo)水平下，4-MEI和2-MEI的平均回收率在81.2%～96.9%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.4%～5.1%之間。本方法操作簡單、準(zhǔn)確可靠和靈敏度高，適用于食糖中4-MEI和2-MEI的殘留量測定。