劉勃興 ， 趙安奇 ， 柳翠翠 ， 康圓圓 ， 馬金換 ， 高桂生 ， 吳同壘 ， 史秋梅 ， 張志強(qiáng)

(河北科技師范學(xué)院 河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 ， 河北 秦皇島 066004)

腹瀉病是犢牛養(yǎng)殖過(guò)程中的常見(jiàn)疾病，導(dǎo)致?tīng)倥８篂a原因有許多，其中，沙門(mén)菌是該病的重要病原[1]。牛沙門(mén)菌病又稱(chēng)牛副傷寒，7～28日齡犢牛易發(fā)病，主要臨床癥狀為發(fā)熱、腹瀉脫水、關(guān)節(jié)腫大等，嚴(yán)重時(shí)可引起敗血癥而死亡，是致?tīng)倥８篂a主要細(xì)菌病原之一。目前，臨床治療沙門(mén)菌所致?tīng)倥８篂a病以抗生素類(lèi)為主，但隨著在臨床治療以及養(yǎng)殖過(guò)程中抗菌藥物的不合理應(yīng)用，細(xì)菌耐藥問(wèn)題日益嚴(yán)重，給細(xì)菌病的防治造成困難。因此，迫切需要篩選出有效的抗菌藥物指導(dǎo)臨床用藥。

中藥是我國(guó)的傳統(tǒng)藥材，多屬于天然藥物，部分中藥具有抗菌、消炎、滋補(bǔ)、提高免疫力等作用，并且價(jià)格低廉，不易產(chǎn)生耐性，毒副作用低，并有研究表明，中藥可以消除耐藥質(zhì)粒，對(duì)細(xì)菌耐藥具有逆轉(zhuǎn)作用，降低細(xì)菌的選擇壓力[2-6]。因此，研發(fā)中藥作為抗菌藥物的替代藥具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

本試驗(yàn)對(duì)13株致?tīng)倥８篂a的沙門(mén)菌對(duì)抗菌藥物和中藥的敏感性進(jìn)行檢測(cè)，為臨床治療該病用藥提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與藥品 中藥：黃連、蒲公英、桔梗、板藍(lán)根、石榴皮、知母、紫花地丁、白頭翁、秦皮、烏梅、蘇木、訶子、肉豆蔻、連翹、金銀花、五倍子、女貞子、魚(yú)腥草、黃柏、柴胡、五味子、黃芩，均購(gòu)自秦皇島唐人醫(yī)藥藥店。藥敏紙片，購(gòu)自杭州天和微生物科技股份有限公司。96孔細(xì)菌培養(yǎng)板，購(gòu)自美國(guó)Corning公司。2%的氯化三苯四氮唑，購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 菌株 河北地區(qū)犢牛腹瀉沙門(mén)菌地方流行株(NS1～NS13)，由河北預(yù)防獸醫(yī)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 菌液制備 將凍存的犢牛腹瀉沙門(mén)菌接種于LB瓊脂培養(yǎng)基，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h，挑取單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中，置于37 ℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)過(guò)夜，次日以1∶100的比例轉(zhuǎn)接，于37 ℃搖床培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期(OD600 nm≈0.6)，調(diào)整菌液濃度至1×106CFU/mL后備用。

1.4 沙門(mén)菌的抗菌藥物敏感性試驗(yàn) 采取K-B紙片法，參照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(CLSI)藥物敏感性試驗(yàn)方法檢測(cè)13株沙門(mén)菌對(duì)氨芐西林、頭孢曲松、阿莫西林等15種抗菌藥物敏感性。試驗(yàn)結(jié)果按照CLSI標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定。

1.5 中藥藥液制備 采用傳統(tǒng)的水煎煮法制備中藥藥液。稱(chēng)量100 g中藥，加入5～10倍量的蒸餾水浸泡1 h，浸泡后大火加熱至煮沸，文火煎煮0.5 h，共煎煮2次。將煎煮的藥液合并，用紗布過(guò)濾后離心，濃縮藥液至100 mL即含生藥濃度1 g/mL，高壓后分裝，置于4 ℃冰箱備用。

1.6 中藥的體外抑菌直徑的測(cè)定 參考文獻(xiàn)[7-8]，采用瓊脂打孔法測(cè)定中藥對(duì)13株沙門(mén)菌的體外抑菌直徑。每個(gè)LB平板加入100 μL 1.3中制備的菌液并涂勻，待平板吸收完全后用直徑為6 mm打孔器打孔，用酒精燈封底，每孔灌滿(mǎn)1.5中制備的中藥提取液(約0.1 mL)，對(duì)照孔加入滅菌后的PBS。置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h，測(cè)量抑菌圈直徑，試驗(yàn)重復(fù)3次，取3次抑菌圈直徑的平均值作為最終結(jié)果。判定標(biāo)準(zhǔn)：極敏(抑菌圈直徑≥20 mm),高敏(20 mm>抑菌圈直徑≥15 mm),中敏(15 mm>抑菌圈直徑≥10 mm),低敏或耐藥(抑菌圈直徑<10 mm)。

1.7 中藥的最小抑菌濃度(MIC)測(cè)定 參考文獻(xiàn)[7，9]，采用改良微量二倍稀釋平板法測(cè)定中藥的MIC。在96孔細(xì)菌培養(yǎng)板的第2～11孔加入100 μL滅菌蒸餾水，第2孔加入100 μL 1.5中制備的中藥提取液，混勻后取100 μL倍比稀釋至第9孔后棄100 μL，第2～11孔補(bǔ)加100 μL 2×LB液體培養(yǎng)基，在第2～10孔加入10 μL 1.3中制備的菌液，第10孔為陽(yáng)性對(duì)照組，不加入中藥液，第11孔為陰性對(duì)照組，不加入菌液。置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。判定結(jié)果時(shí)，在培養(yǎng)板中加入5 μL 2%的氯化三苯四氮唑(TTC)，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱2 h，以不顯紅的最高稀釋孔的中藥濃度為MIC。

1.8 中藥的最小殺菌濃度(MBC)測(cè)定 分別取1.7中96孔培養(yǎng)板培養(yǎng)后的液體50 μL，涂布于LB平板上，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h。以無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)的中藥濃度為MBC。

2 結(jié)果

2.1 沙門(mén)菌的抗菌藥物敏感性試驗(yàn) 抗菌藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示(表1)，13株分離菌對(duì)替米考星、土霉素、磺胺間甲氧嘧啶、復(fù)方新諾明高度耐藥，耐藥率高達(dá)100%，其他11種抗菌藥耐藥率在30.77%～92.31%。13株沙門(mén)菌對(duì)阿米卡星的敏感率最高，敏感率為69.23%。13株沙門(mén)菌分別對(duì)7～15種抗菌藥耐藥，菌株NS8、NS11對(duì)試驗(yàn)的15種抗菌藥全部耐藥(圖1)。試驗(yàn)結(jié)果表明，13株?duì)倥８篂a沙門(mén)菌具有多重耐藥性，并對(duì)檢測(cè)15種抗菌藥均表現(xiàn)出不同程度的耐藥。

圖1 13株分離菌對(duì)15種抗菌藥的耐藥數(shù)Fig.1 The resistance of 13 isolates to 15 antibacterial drugs

表1 13株沙門(mén)菌對(duì)抗菌藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Antimicrobial susceptibility test results of 13 Salmonella strains

2.2 中藥的體外抑菌直徑測(cè)定 試驗(yàn)結(jié)果顯示(圖2)，13株沙門(mén)菌對(duì)8種中藥表現(xiàn)出不同程度的敏感性，分別為五倍子、五味子、烏梅、訶子、女貞子、石榴皮、蘇木、黃芩。黃連、蒲公英、桔梗、板藍(lán)根、知母、紫花地丁、白頭翁、秦皮、肉豆蔻、連翹、金銀花、魚(yú)腥草、黃柏、柴胡、五味子15種中藥對(duì)試驗(yàn)的沙門(mén)菌表現(xiàn)為無(wú)抑菌效果。中藥的體外抑菌直徑測(cè)定試驗(yàn)結(jié)果表明，五倍子對(duì)13株沙門(mén)菌抑菌作用最強(qiáng)，五味子、烏梅、訶子、女貞子、石榴皮、蘇木、黃芩對(duì)沙門(mén)菌具有一定的抑菌作用，且不同菌株對(duì)同種中藥表現(xiàn)出的敏感程度不同。

圖2 13株沙門(mén)菌對(duì)8味中藥的體外抑菌敏感程度Fig.2 In vitro antimicrobial sensitivity of 13 Salmonella strains to 8 traditional Chinese medicines

2.3 中藥的最小抑菌濃度(MIC)測(cè)定 中藥MIC測(cè)定結(jié)果顯示(表2)，石榴皮對(duì)13株沙門(mén)菌的MIC為31.25～250.00 mg/mL，石榴皮對(duì)13株沙門(mén)菌的MIC為7.81～62.50 mg/mL，蘇木對(duì)13株沙門(mén)菌的MIC為62.50～250.00 mg/mL，訶子對(duì)13株沙門(mén)菌的MIC為15.63～31.25 mg/mL，五倍子對(duì)13株沙門(mén)菌的MIC為7.81～31.25 mg/mL，女貞子對(duì)13株沙門(mén)菌的MIC為31.25～250.00 mg/mL，五味子對(duì)13株沙門(mén)菌的MIC為7.81～62.50 mg/mL，黃芩對(duì)13株沙門(mén)菌的MIC為125.00～250.00 mg/mL，其余中藥對(duì)試驗(yàn)的沙門(mén)菌均表現(xiàn)無(wú)抑菌效果。

2.4 中藥的最小殺菌濃度(MBC)測(cè)定 中藥MBC測(cè)定結(jié)果顯示(表2)，石榴皮對(duì)13株沙門(mén)菌的MBC為62.50～125.00 mg/mL，烏梅對(duì)13株沙門(mén)菌的MBC為7.81～62.50 mg/mL，蘇木對(duì)13株沙門(mén)菌的MBC為125.00～250.00 mg/mL，訶子對(duì)13株沙門(mén)菌的MBC為15.63～62.50 mg/mL，五倍子對(duì)13株沙門(mén)菌的MBC為7.81～31.25 mg/mL，女貞子對(duì)13株沙門(mén)菌的MBC為31.25～250.00 mg/mL，五味子對(duì)13株沙門(mén)菌的MBC為7.81～31.25 mg/mL，黃芩對(duì)13株沙門(mén)菌的MBC為125.00～250.00 mg/mL，其余中藥對(duì)13株沙門(mén)菌表現(xiàn)為無(wú)抑菌效果。綜合抑菌直徑測(cè)定試驗(yàn)、MIC和MBC測(cè)定試驗(yàn)，22種單味中藥中只有8種中藥對(duì)13株沙門(mén)菌具有抑菌效果，抑菌強(qiáng)度從強(qiáng)到弱依次為五倍子、五味子、烏梅、訶子、女貞子、石榴皮、蘇木、黃芩，并且MIC與MBC數(shù)值存在一定的差別。

表2 13株沙門(mén)菌對(duì)8味中藥的MIC和MBC測(cè)定結(jié)果Table 2 MIC and MBC test results of 8 traditional Chinese medicines by 13 Salmonella strains (mg/mL)

3 討論

沙門(mén)菌是人獸共患病菌，對(duì)人類(lèi)與畜禽健康造成嚴(yán)重的威脅[10]。在畜牧生產(chǎn)中，沙門(mén)菌感染幼齡動(dòng)物可引起腹瀉、敗血癥等，造成較高的淘汰率；感染成年動(dòng)物后經(jīng)常無(wú)臨床癥狀，但感染動(dòng)物長(zhǎng)期帶菌，成為感染源，并且該菌可垂直傳播，給畜禽養(yǎng)殖造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[11-13]。沙門(mén)菌的防治依靠抗生素類(lèi)藥物，但在畜牧養(yǎng)殖過(guò)程中，經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)抗生素藥物濫用現(xiàn)象，這加速了細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生。有研究報(bào)道，從犢牛分離的細(xì)菌多重耐藥情況十分嚴(yán)重[14]。根據(jù)當(dāng)?shù)胤乐吻闆r，本試驗(yàn)對(duì)從河北地區(qū)分離的13株致?tīng)倥８篂a沙門(mén)菌對(duì)抗菌藥物和中藥的敏感性進(jìn)行了研究。

在本試驗(yàn)中，13株沙門(mén)菌均具有多重耐藥性，耐藥數(shù)從7～15種不等，且不同菌株之間的耐藥情況不同。檢測(cè)的15種抗菌藥中，13株沙門(mén)菌對(duì)替米考星、土霉素、磺胺間甲氧嘧啶和復(fù)方新諾明耐藥率高達(dá)100%，表明在河北地區(qū)犢牛腹瀉沙門(mén)菌對(duì)這4種抗菌藥物的耐藥性較高，不推薦臨床繼續(xù)使用這4種藥物。13株沙門(mén)菌對(duì)阿米卡星的敏感率最高，但仍有個(gè)別菌株對(duì)阿米卡星表現(xiàn)耐藥，臨床應(yīng)用時(shí)應(yīng)注意合理用藥。據(jù)喻華英等[15]報(bào)道，其分離出牛腹瀉沙門(mén)菌對(duì)慶大霉素、卡那霉素、頭孢噻肟敏感度較高，和本試驗(yàn)中的結(jié)果不同，這可能與地區(qū)和牛群飼養(yǎng)和治療用藥等方面有關(guān)。

致?tīng)倥Ｉ抽T(mén)菌對(duì)抗菌藥的耐藥性較高，為解決該問(wèn)題，中藥作為抗菌藥的替代藥成為熱點(diǎn)研究對(duì)象。本試驗(yàn)采取臨床上較為常用的水煎煮法提取中藥，檢測(cè)13株沙門(mén)菌對(duì)22味中藥提取液的敏感性。22種單味中藥只有8種中藥對(duì)13株沙門(mén)菌具有抑菌效果，抑菌強(qiáng)度從強(qiáng)到弱依次為五倍子、五味子、烏梅、訶子、女貞子、石榴皮、蘇木、黃芩。據(jù)吳美云[16]報(bào)道，烏梅、黃芩、黃連和大黃對(duì)奶牛腸道沙門(mén)菌有抑菌效果，其中烏梅的抑菌效果最佳；呂信[17]報(bào)道的“犢泄康”能有效的防治犢牛腹瀉，“犢瀉康”由黃連、黃柏、白頭翁、烏梅、訶子等13味中藥組成。在本試驗(yàn)中，烏梅、訶子、黃芩、訶子的水煎煮提取液同樣對(duì)13株沙門(mén)菌具有抑菌效果，但白頭翁、黃連、大黃無(wú)抑菌效果，這可能與提取方法、菌株來(lái)源不同有關(guān)。據(jù)李東等[18]報(bào)道，五倍子對(duì)豬霍亂沙門(mén)菌具有良好的抑菌效果；陳虹[19]報(bào)道，五倍子對(duì)豬傷寒沙門(mén)菌和豬霍亂沙門(mén)菌具有較好的抑菌效果，在本試驗(yàn)中，五倍子對(duì)犢牛腹瀉沙門(mén)菌的抑菌效果同樣最佳，與李東等和陳虹的試驗(yàn)結(jié)果相同，表明五倍子對(duì)動(dòng)物腸道沙門(mén)菌具有較好的抑菌效果，可以作為沙門(mén)菌病的治療藥物進(jìn)行研究。

通過(guò)對(duì)13株?duì)倥８篂a沙門(mén)菌對(duì)抗菌藥以及中藥敏感性研究發(fā)現(xiàn)，13株沙門(mén)菌對(duì)抗菌藥耐藥情況較為嚴(yán)重，而部分中藥對(duì)沙門(mén)菌具有良好的體外抑菌效果，為臨床應(yīng)用抗菌藥和中藥治療沙門(mén)菌所致?tīng)倥８篂a病提供科學(xué)依據(jù)。