王玉舜 ， 成 杰 ， 王家偉 ， 吳竹青 ， 劉建文 ， 吳清民

(1. 中國農業(yè)大學動物醫(yī)學院 , 北京 海淀 100193 ； 2. 天津市北辰區(qū)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展服務中心 , 天津 北辰 300401 ； 3. 天津市動物疫病預防控制中心 , 天津 北辰 300401)

布魯氏菌病(簡稱布病)是一種重要的動物源性人獸共患傳染病。該病在全球170多個國家和地區(qū)流行并肆虐，僅人類每年新發(fā)病50萬～70萬例，直接損失超過50億美元[1]。2000年后，我國新發(fā)布病人數直線上升，2015年官方報告近6萬人。目前，我國每年新發(fā)病例上升趨勢雖有下降，但該病在動物群內疫情蔓延仍未得到有效遏制，成為《國家中長期動物疫病防治規(guī)劃(2012—2020年)》優(yōu)先防治的最重要病種之一。因此，加強該病防控勢在必行。

為了有效防控動物布病流行，世界衛(wèi)生組織(WHO)頒布的理想動物布病疫苗標準[2]，其中最基本的要求是首先要能滿足動物全群免疫的要求，在此基礎上理想疫苗應具備高度免疫保護力、對人安全無害、不干擾檢疫等特性。按該標準，國際參考疫苗—布魯氏菌弱毒活疫苗(S19株和Rev.1株)雖具備優(yōu)良的免疫原性，但因其接種孕畜導致流產，僅適于育成階段的動物接種，不能滿足全群免疫的基本要求[3]。我國常用的布魯氏菌弱毒疫苗S2株、A19株和M5株，在布病防控歷史上發(fā)揮過巨大貢獻，但現有免疫程序未能覆蓋不同日齡動物，距離理想布病疫苗要求相差較大，如A19株、S2株和M5株疫苗注射接種免疫原性高，但易引起孕母畜流產 ； S2株疫苗口服接種安全性良好，適合全群接種，但免疫原性較弱等。在現有條件下，按照理想疫苗標準選擇優(yōu)化疫苗接種對象和途徑，力爭通過疫苗接種阻斷動物群內布病傳播和蔓延，具有重要的實踐意義。本試驗將布魯氏菌病活疫苗(S2株)、布魯氏菌病活疫苗(M5株)和布魯氏菌弱毒活疫苗(BA0711株)中試制品，以標注劑量分別接種懷孕中后期綿羊、1月齡內羔羊和1～2月齡羔羊，測定3種疫苗或制品對綿羊和羔羊的安全性和免疫適應性，為布病防控尋找一種合理的免疫程序提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 制品 布魯氏菌病活疫苗(S2株)(批號：1711001)，中牧實業(yè)股份有限公司產品。布魯氏菌病活疫苗(M5株)(批號：2017002)，天康生物股份有限公司產品。布魯氏菌基因缺失弱毒疫苗(BA0711株)制品(批號：201702)，金河佑本生物制品有限公司中試產品。所用疫苗或制品均凍存于-20 ℃。

1.2 試劑 布魯氏菌病虎紅平板凝集試驗抗原和試管凝集抗原，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，批號分別為2016/10/03和2018/06/01。

1.3 試驗動物 布病陰性健康易感綿羊150只，天津市郊區(qū)某羊場。

1.4 方法

1.4.1 動物選擇及臨床健康檢查 試驗開始前，分別對當地8個綿羊群進行臨床健康檢查、編號并采血分離血清，按《動物布魯氏菌病診斷技術，GB/T18646—2018》規(guī)定的程序進行布魯氏菌虎紅平板凝集試驗檢測和結果判定。選取幼齡羔羊和懷孕85～100日齡健康母羊用于本試驗。

1.4.2 動物接種 選取布病陰性1月齡內羔羊、1～2 月齡羔羊和85～100日齡綿羊各50只，分別隨機分為5組，按表1程序和劑量分別接種3種疫苗或制品，每只接種1 mL。

表1 不同年齡段綿羊分組接種3種疫苗或制品的方法和劑量Table 1 Method and dose of three vaccines or products used for sheep of the different age groups

接種后連續(xù)觀察60 d，記錄接種羊體溫、采食、精神以及母羊懷孕狀況等臨床反應。在試驗觀察過程中，用5%漂白粉消毒圈舍，1 次/d；發(fā)現母羊流產立即隔離病羊，將胎兒轉入塑料袋進行無害化處理；污染的圈舍環(huán)境用5%漂白粉徹底消毒，試驗羊只體表用0.1%新潔爾滅消毒。

1.4.3 血樣采集 接種動物分別于第1周、第2周、第1個月、第2個月、第3個月、第4個月、第5個月、第6個月和第7個月采血分離血清，而對照動物則于第1個月、第3個月、第5個月和第7個月采血監(jiān)測，按《動物布魯氏菌病診斷技術GB/T18646—2018》操作程序及判斷方法，測定布病抗體轉陽狀況及其抗體滴度，評價各組動物布病抗體產生和消長規(guī)律以及疫苗菌株潛在的水平傳播狀況。

2 結果

2.1 臨床觀察 與對照組相比，口服接種S2后的3年齡段試驗羊無體溫反應，食欲和精神狀況無異常反應；但皮下接種S2株、M5株疫苗和BA0711株制品的3年齡段試驗羊均出現2～3 d體溫反應(升高0.5～1.0 ℃)，其食欲和精神狀況卻未見顯著異常，由此也說明布魯氏菌病疫苗接種幼齡羔羊安全良好。另外，截止至產羔結束，對照組、S2株口服組和BA0711株注射組孕羊未見流產和懷孕異常反應；而S2株和M5株疫苗皮下接種組試驗羊分別于接種23 d和19 d流產各1只。因此，布魯氏菌病疫苗接種應嚴格按照疫苗使用說明書操作，避免S2株和M5株疫苗接種孕羊。孕羊臨床觀察結果見表2。

表2 布魯氏菌病疫苗經不同途徑接種懷孕母羊的臨床觀察結果Table 2 Clinical observation of the pregnant ewes inoculated by the different routes of the Brucellosis vaccines

2.2 抗體產生及消長狀況 3個年齡段綿羊經不同途徑接種疫苗后，不同時間點采集血樣，檢測血清以虎紅平板凝集試驗出現“++”以上判為陽性，試管凝集試驗抗體滴度≥1∶25判為陽性，測定并統(tǒng)計1月齡內羔羊、1～2月齡羔羊和懷孕母羊不同時間點抗體轉陽結果分別見表3、表4和表5。3個年齡段對照組羊檢測結果可見不同時間點羊只抗體均為陰性，表明疫苗菌株水平傳播的概率極低。1月齡內羔羊口服接種S2株疫苗抗體陽轉率最高達30%且抗體反應緩慢，90 d后完全消失；3種疫苗/制品皮下接種組羊抗體產生時間、陽轉率和持續(xù)時間基本相似，最高陽轉率80%，持續(xù)時間至少5個月，見表3。

表3 布病疫苗經不同途徑接種1月齡羔羊抗體產生和消長狀況Table 3 Antibody growth and decline of lambs aged in less than one month inoculated by the different routes of Brucellosis vaccines

1～2月齡羔羊口服接種S2株疫苗的抗體陽轉水平和持續(xù)時間稍微高于1月齡內羔羊，但3種疫苗/制品皮下接種組羊抗體產生時間、陽轉率和持續(xù)時間均顯著高于1月齡內羔羊，7 d后陽轉率即達80%以上，14 d達100%，且持續(xù)時間可達6個月，見表4。

表4 布病疫苗經不同途徑接種1～2月齡羔羊抗體產生和消長狀況Table 4 Antibody growth and decline of lambs aged 1-2 months inoculated by the different routes of Brucellosis vaccines

懷孕母羊口服接種S2株疫苗抗體陽轉率最高達60%，接種14 d產生抗體且持續(xù)時間也相對較短；皮下接種組抗體產生時間、陽轉率和持續(xù)時間較1～2月齡羔羊顯著提高，7 d達90%以上陽性，14 d陽轉率100%，持續(xù)時間達7個月以上，見表5。

綜合以上抗體檢測結果，從抗體產生時間、陽轉率和持續(xù)時間看，布病疫苗口服接種顯著低于注射接種；按照接種動物日齡分析，1～2月齡羔羊接種的反應性接近成年懷孕母羊，但1月齡內羔羊的抗體反應性很弱。

3 討論

根據世界動物衛(wèi)生組織資料和我國動物布病疫苗使用說明，國內外廣泛應用的布魯氏菌弱毒疫苗，因傳統(tǒng)接種途徑均會造成孕畜流產，其標簽說明基本都是孕畜禁用。因此，盡管政府部門允許通過疫苗接種防控布病，但在一定地區(qū)或動物群中免疫動物群和非免疫動物群混養(yǎng)、臨床感染動物和易感動物混養(yǎng)，防控措施收效大打折扣。由于疫苗保護率限制和免疫與自然感染難以鑒別，動物分娩、哺乳、配種和調運等環(huán)節(jié)監(jiān)管困難，動物布病防控受到一定限制。針對這種局面，世界衛(wèi)生組織(WHO)頒布理想布病疫苗標準時，重點強調了疫苗接種不同性別和所有年齡段動物的基本要求。然而，從本試驗結果可以看出，S2株疫苗口服接種或BA0711株制品皮下接種對孕羊的安全性良好，可以滿足成年動物布病防控需求。此外，通過避開季節(jié)性發(fā)情動物期，或改變免疫途徑和劑量，S2株和M5株等疫苗注射接種盡管還存在一定的孕畜流產風險，但若能嚴格控制使用程序和方法，也可在一定程度上滿足成年動物的接種要求[4]。因此，預防孕羊流產的疫苗及其接種程序具有可行性。

全群接種的基本要求是所有年齡動物都接種。有關報道顯示，年齡越小，動物對布魯氏菌感染的先天性抵抗力越強[5]。另外，根據國內外疫苗免疫程序，除了S2疫苗規(guī)定無論年齡大小均可口服接種外，其余疫苗的最小接種日齡未做具體規(guī)定，且規(guī)定過于籠統(tǒng)，那么究竟布魯氏菌弱毒疫苗對綿羊的最小可接種日齡是多大才能激發(fā)其免疫反應并盡量滿足全群接種的要求？由于相關文獻未能系統(tǒng)明確布病疫苗對不同日齡動物接種抗體的反應程度，本試驗通過3種疫苗(制品)按要求途徑接種不同日齡綿羊的反應性結果顯示，1月齡內羔羊對布病疫苗接種的反應性很小，抗體呈現一過性反應；而1～2月齡羔羊對疫苗接種的反應性(陽性率和抗體滴度)接近成年羊，但持續(xù)時間比成年羊稍短。基于幼齡羔羊對布病疫苗接種反應性微弱，因此建議在大規(guī)模免疫防控時，羊群內2月齡以上所有羊只全部接種，以阻斷布病在群內傳播。然而，由于初生犢牛感染布魯氏菌抗體消失很快卻存在體內帶菌的現象[6]，以及布魯氏菌以細胞免疫為主的事實[7]。出生后幼齡動物的免疫具體時間尚待進一步研究確定。

綜上所述，動物布病防控實踐中對疫苗免疫防控的理想要求是在一定地區(qū)或牧場內，易感動物無論年齡大小，群內動物全群接種。通過疫苗選擇和控制免疫程序及接種方法避免孕畜流產。鑒于1月齡內羔羊對布病疫苗接種反應微弱，抗體反應呈一過性，建議全群接種時先避開2月齡內幼羔，待2月齡以后補免，以建立全群布病免疫力。