張海鵬，徐 琳，宋彥霖，徐盛嘉，楊 靖，馬繼政，鐘 勇

0 引 言

合理的體育活動是一種有效的干預(yù)措施，可以改善生活質(zhì)量，并延長預(yù)期壽命。目前，廣泛認(rèn)為有氧訓(xùn)練可以誘發(fā)獨特的心臟保護(hù)表型，用來預(yù)防和治療心血管疾病。心血管系統(tǒng)反映出急性和長期運動的明顯改變。這些適應(yīng)變化的核心涉及心血管系統(tǒng)內(nèi)細(xì)胞和分子信號通路變化的協(xié)同整合，使組織能夠應(yīng)答運動時人體的需求[1]。心臟肥大是機(jī)體對有氧運動主要適應(yīng)之一，可以正常化室壁應(yīng)力，減少氧氣消耗，并增加工作能力，使其存在明顯的機(jī)械優(yōu)勢[1]。因此，認(rèn)識運動性心肌肥大的適應(yīng)過程，具有重要的生理意義。

當(dāng)前，微小RNA分子(micro RNAs, miRNAs)已經(jīng)成為潛在的生物標(biāo)志物，可響應(yīng)并參與運動中的適應(yīng)性變化[2-3]。miRNAs是短的非編碼RNA，通過抑制蛋白質(zhì)翻譯或增強(qiáng)信使RNA(mRNA)的降解，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄后基因的表達(dá)[2-3]。miRNAs參與正常的功能性心臟組織的發(fā)育，控制細(xì)胞的生長、分化、凋亡和增殖，并參與心血管病理生理變化的調(diào)控，例如肥大、纖維化和心肌細(xì)胞的損害[2]。

左右心室是相互依存的，嵌套在心包內(nèi)，具有共同的隔膜，并被共同的心肌纖維包圍。研究表明耐力訓(xùn)練后左室中發(fā)生的結(jié)構(gòu)和功能適應(yīng)，可能與右室存在不同。鑒于上述原因，本研究選擇肌肉組織高表達(dá)的肌組織特異miRNAs(miR-208a、miR-208b和miR-499)[2,3]，以及其他的被認(rèn)為在心肌中重要的miR-21、miR-17-3p[2-3]，觀察長期的有氧練習(xí)左右心肌中這些miRNAs的變化，為有氧運動提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物取48只健康C57BL/6J雄性小鼠(8周齡)，購自北京生命實驗動物技術(shù)有限公司(SPF級)，小鼠置于光照/黑暗周期為12 h，溫度為(22±2)℃，濕度為45%～50%的屏障環(huán)境中，自由飲食。實驗程序經(jīng)南京大學(xué)動物保護(hù)和使用委員會批準(zhǔn)(IACUC-2006001)。將小鼠按體重隨機(jī)數(shù)字分組劃分為對照組和訓(xùn)練組，每組24只。2組在第0周進(jìn)行跑臺預(yù)適應(yīng)及遞增負(fù)荷測試(incremental load test，ILT)后，運動組進(jìn)行8周有氧跑臺訓(xùn)練，對照組正常飼養(yǎng)不進(jìn)行跑臺訓(xùn)練。動物于下午1點至5點在明亮室內(nèi)進(jìn)行跑臺訓(xùn)練或運動能力測試。

1.2 測試方法

1.2.1 ILT訓(xùn)練組小鼠使用運動跑臺進(jìn)行訓(xùn)練(型號：ZH-PT，安徽正華)，適應(yīng)階段對照組與訓(xùn)練組都以10 m/min的速度運動10 min，跑步機(jī)無傾斜角度，持續(xù)5 d[4]。48 h后進(jìn)行ILT測試，測試方案為：小鼠以6 m/min的速度在跑步機(jī)上進(jìn)行運動，每3分鐘增加3m/min的速度遞增直至小鼠力竭。當(dāng)小鼠在1 min內(nèi)觸碰跑步機(jī)末端5次及以上時，被定義為力竭。力竭速度計算公式為：

EV=V+(n/b)×a

其中V是最后一次完成階段的速度；n是未完成階段的保持的持續(xù)時間；b是每階段的持續(xù)時間；a是測試遞增速度[5]。

1.2.2 有氧訓(xùn)練方案和表現(xiàn)評估本實驗中使用的有氧訓(xùn)練方案參照文獻(xiàn)[4]進(jìn)行。期間每周第6天定時記錄小鼠的體重變化情況。并在第0周適應(yīng)性訓(xùn)練、第4周和第8周有氧訓(xùn)練結(jié)束后48 h對2組進(jìn)行ILT測試，對小鼠的運動表現(xiàn)進(jìn)行評估與記錄。

1.3 心肌樣本提取于第8周最后一次ILT測試結(jié)束48 h后，斷頸處死所有小鼠。在無菌無RNA酶的條件下，收集小鼠左、右心室心肌組織置于液氮中速凍，并存于-80°C中后續(xù)分析待測。

1.4 RNA的提取使用RNAiso Plus9(型號：9109，Takara)抽提試劑盒，將冷凍的左右心室心肌勻漿進(jìn)行總RNA的提取。并進(jìn)行定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-qPCR)，所有樣品都是在一個批次內(nèi)進(jìn)行處理的。以探針法為基礎(chǔ)進(jìn)行RT-qPCR，得到相應(yīng)的cDNA產(chǎn)物。使用TaqMan PCR試劑盒(Thermo Fisher Scientific，美國)和Roche LightCycler?96 (Roche,瑞士)進(jìn)行qPCR檢驗。qPCR條件為95℃預(yù)孵育5 min，95℃15 s、60℃60 s共 45個循環(huán)，最后37℃冷卻30 s。使用以下TaqMan?探針進(jìn)行對應(yīng)miRNA的檢測：snRNA U6 (ID: 001973)、hsa-miR-208a (ID: 000511)、hsa-miR-208b (ID: 002290)、mmu-miR-499 (ID: 001352)、hsa-miR-21 (ID: 000397)和mmu-miR-17-3p (ID: 002543)。所有反應(yīng)進(jìn)行3次技術(shù)重復(fù)。將心肌中miRNAs的相對snRNA U6歸一化表達(dá)，并使用2-ΔΔCt方法計算Ct值。

2 結(jié) 果

2.1 8周有氧訓(xùn)練小鼠體重變化情況整個實驗周期間，對照組與訓(xùn)練組在訓(xùn)練后期產(chǎn)生體重變化上的差異，其中對照組于第5周、第6周、第7周和第8周的體重顯著高于訓(xùn)練組(P<0.05；P<0.001；P<0.001；P<0.0001)，見圖1。8周的跑步機(jī)有氧訓(xùn)練方案結(jié)束時，對照組小鼠體重變化百分比(16.18±5.14)%與訓(xùn)練組(5.30±6.15)%比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.0001)，見圖2。

*P<0.05、**P<0.001、***P<0.0001

*P<0.0001

2.2 8周有氧訓(xùn)練小鼠ILT測試結(jié)果第0周時對照組與訓(xùn)練組的力竭速度差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；第4周訓(xùn)練后訓(xùn)練組力竭速度[(29.37±3.49)%]顯著高于對照組[(20.54±2.21)%，P<0.0001]；第8周時測試結(jié)果表明，訓(xùn)練組力竭速度[(35.71±4.53)%]仍顯著高于對照組[(21.28±5.47)%，P<0.0001]；見圖3。此外，隨著有氧訓(xùn)練方案的推行，訓(xùn)練組小鼠的有氧運動能力不斷提升，與第0周力竭速度比較，第4周時提升40.79%(P<0.0001)，第8周時提升71.15%(P<0.0001)，第8周較第4周成績上升21.56%(P<0.0001)。

*P<0.0001

2.3 8周有氧訓(xùn)練心肌組織中miRNAs的變化

2.3.1 左右心肌組織中肌組織特異miRNAs的變化與對照組比較，訓(xùn)練組中左心室心肌miR-208b和miR-499的水平顯著下降(P<0.01；P<0.05)，分別改變1.96倍與2.59倍，但在右室心肌中差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。值得注意的是，miR-208a在小鼠左右心室的心肌中差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖4。

*P<0.05、**P<0.01

2.3.2 左右心肌組織中心肌其他miRNAs的變化與對照組比較，訓(xùn)練組左心室心肌miR-21與miR-17-3p水平顯著減少(P<0.05；P<0.05)，分別改變2.53倍和1.13倍。與左心室心肌的顯著改變不同的是，miR-21與miR-17-3p在右心室心肌中的水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖5。有氧訓(xùn)練并不影響這些miRNAs在右心室心肌中的表達(dá)。

*P<0.05

3 討 論

長期有氧訓(xùn)練會導(dǎo)致心臟超負(fù)荷，引起結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生適應(yīng)變化，被稱為“運動員的心臟”。傳統(tǒng)上，認(rèn)為這種心臟重塑的量在左右心腔之間是平衡的。但是，在劇烈運動期間，右心室會承受不成比例的后負(fù)荷和室壁應(yīng)力，長期運動引起的變化可能更為明顯。本研究結(jié)果顯示心肌相關(guān)的miR-208b和miR-499水平僅在左心室心肌中下降，而miR-21與miR-17-3p僅在左心室心肌中增加。表明左、右心室心肌重構(gòu)存在不同。

有氧運動引起的心臟肥大是一種生理反應(yīng)，涉及對收縮和代謝成分的基因和蛋白質(zhì)表達(dá)的精確編排。miRNAs參與這些生理過程的變化。前期研究發(fā)現(xiàn)，miR-208a、miR-208b和miR-499均由肌球蛋白基因編碼，因此也被稱為“肌相關(guān)microRNAs(MyomiRs)”，調(diào)節(jié)多個mRNA靶標(biāo)，進(jìn)而調(diào)節(jié)心肌肥大和代謝途徑[6]。研究表明，游泳訓(xùn)練對miR-208a和miR-208b水平的表達(dá)存在抑制作用，會增加Med13、Purβ、Sox6、異染色質(zhì)蛋白1β(Heterochromatin Protein 1β, HP1β)和特異性蛋白(specificity proteins,Sp)/Kruppel樣轉(zhuǎn)錄因子3(Kruppel-like transcription factor 3, SP3)蛋白的表達(dá)，調(diào)節(jié)代謝，收縮途徑和表觀遺傳控制，從而調(diào)節(jié)α-MHC/β-MHC比率并傳遞信號，誘發(fā)生理性的肌肉肥大。但miR-499未發(fā)生變化[6]。本研究結(jié)果顯示，8周有氧跑臺訓(xùn)練可影響miR-208b和miR-499水平的變化，進(jìn)一步表明這些MyomiRs參與調(diào)控心臟肥大。其出現(xiàn)差異的原因可能和有氧練習(xí)的方式有關(guān)[2-3]。另外，研究發(fā)現(xiàn)游泳訓(xùn)練可增加miR-21水平[靶向磷脂酶和張力蛋白同源物(phosphataseandtensinhomolog, PTEN)和TSC-2]，可激活心肌細(xì)胞PI3K/Akt/mTOR信號途徑[7]；增加miR-17-3p的表達(dá)，可抑制PTEN(PI3K/Akt拮抗途徑)，而PI3K/Akt是參與心肌肥大最重要的一個途徑[8]；本研究同樣觀察到8周跑臺訓(xùn)練后左室心肌miR-21和miR-17-3p水平增加，進(jìn)一步支持體育活動的有益影響。但值得注意的是，在心血管疾病中，miR-21 的表達(dá)普遍升高[9]。

但在右心室的心肌中，未觀察到這些miRNAs的變化，表明左右心肌重構(gòu)存在不同。與左心室相比，長期耐力運動右心室的擴(kuò)大程度有所提高[10]。研究發(fā)現(xiàn)長期的有氧運動訓(xùn)練主要是通過增加線粒體產(chǎn)生ATP的能力，增強(qiáng)右心室的代謝重塑[11]。因此，評定代謝相關(guān)miRNAs的變化，有助認(rèn)識右心室的重構(gòu)現(xiàn)象。運動過程中右心室承受的負(fù)荷和室壁壓力大于左心室[12]。在健康個體中，右心室具有足夠的心力儲備，以適應(yīng)短期高強(qiáng)度運動期間肺動脈壓的升高[13]。但是，如果保持高強(qiáng)度運動數(shù)小時，則可能會影響右心室功能并導(dǎo)致心肌微損傷，最終導(dǎo)致心臟病理性改變[14]。認(rèn)識運動性心肌肥大的適應(yīng)過程，了解運動如何誘導(dǎo)心臟生長可能有助于確定新的治療靶標(biāo)，以減輕對病理應(yīng)激的不良心臟重塑。但這些途徑是否可以增強(qiáng)心臟有限的再生能力，從而幫助補(bǔ)償心肌細(xì)胞的損失，仍是未經(jīng)證實的[15]。