謝 暉，周萬青，沈 瀚

0 引 言

腸球菌是臨床常見革蘭陽性條件致病菌，可導致人體多器官感染。鶉雞腸球菌(Enterococcusgallinarum，EG)作為腸球菌中少見菌種，近年來臨床感染及分離率不斷增加[1-3]，可造成泌尿道、腹腔、膽道感染以及敗血癥等。而耐萬古霉素腸球菌(vancomycin resistant enterococci，VRE)的不斷檢出[4-5]，給臨床該類感染帶來極大挑戰(zhàn)。造成耐藥的決定基因包括vanA、vanB、vanC、vanD、vanM等，不同基因的表達可表現(xiàn)對萬古霉素和替考拉寧的不同藥敏結(jié)果[6]，常見vanA介導屎腸球菌大多對萬古霉素和替考拉寧呈高水平耐藥。鶉雞腸球菌一般攜帶染色體介導的萬古霉素低水平耐藥vanC基因，雖然體外藥敏試驗可呈現(xiàn)低水平耐藥或敏感結(jié)果，但不建議臨床使用。目前，已有對萬古霉素高水平耐藥鶉雞腸球菌菌株臨床報道，可能與vanA基因的獲得有關[7]。因此，本研究調(diào)查我院臨床分離鶉雞腸球菌的耐藥性及攜帶萬古霉素耐藥相關基因情況,為鶉雞腸球菌耐藥監(jiān)測及耐藥基因的流行提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株收集我院2019年1-12月臨床分離非重復鶉雞腸球菌15株，主要分離自分泌物(2株)、腹水(3株)、膽汁(4株)、尿液(3株)及血液樣本(3株)。所有菌株均經(jīng)Vitek 2 Compact GP板卡鑒定并經(jīng)VITEK MS質(zhì)譜復核。糞腸球菌ATCC51299、金黃色葡萄球菌ATCC25923、糞腸球菌ATCC29212為本實驗室保存菌株。

1.2 主要試劑與儀器Vitek 2 Compact 全自動鑒定儀及配套 GP 鑒定卡、GP67 藥敏卡(法國生物梅里埃公司)；萬古霉素 E-test 試紙條(鄭州安圖生物公司)；DNA提取試劑盒及膠回收試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]；2×Taq Mix(DBI 公司)；營養(yǎng)肉湯(上海科瑪嘉微生物技術有限公司)；PCR 引物由上海生工生物有限公司公司合成；2720 Thermal Cycler PCR儀、ABI 3730XL基因測序儀(ABI公司)；Gel-Doc XR型凝膠成像分析系統(tǒng)(美國Bio-Rad 公司)。

1.3 藥敏試驗采用 Vitek 2 Compact 配套 GP67 藥敏卡檢測菌株對常規(guī)藥物敏感性。采用E-test法復核萬古霉素最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)，判定標準參照美國臨床和實驗室標準協(xié)會CLSI 2019[8]。

1.4 DNA提取挑取純培養(yǎng)菌落接種到營養(yǎng)液體培養(yǎng)基中，37 ℃ 180 r/min 16 h，采用DNA提取試劑盒提取菌液基因組DNA，具體操作依據(jù)試劑盒說明書進行。所提核酸用于全基因組測序及基因擴增。

1.5 PCR擴增和序列分析參照文獻[9]方法合成萬古霉素耐藥相關基因vanA、vanB、vanC1及vanC2/3，引物序列見表1。反應體系20 μL：2×TaqMix 10 μL，DNA模板2 μL，上、下游引物 (10 μmol/L)各1 μL，ddH2O 6 μL。 PCR反應條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共30個循環(huán)；72 ℃ 7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)15 g/L瓊脂糖凝膠電泳，陽性擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收，采用柱層析法純化后經(jīng)ABI 3730XL基因測序儀進行Sanger雙向測序，正反向測序片段采用DNAMAN8軟件拼接，結(jié)果經(jīng)堿基局部對準檢索工具(Basic Local Alignment Search Tool，BLAST)與GenBank進行比對，該部分由上海生工生物工程公司完成。

表1 萬古霉素耐藥基因的引物序列及產(chǎn)物大小

1.6 全基因組測序分析采用Illumina HiSeq 2000測序技術進行全基因組DNA測序，委托上海澤塔生物科技有限公司完成。簡要步驟：對樣本DNA進行雙端測序(Paired-end，PE)，構(gòu)建450 bp 文庫；對測序結(jié)果進行質(zhì)量剪切后，利用MicrobeTrakr plus v. 0.9.1軟件對序列進行拼接，得到最優(yōu)的組裝結(jié)果。采用GeneMarkS+v.4.11基因注釋軟件對測序結(jié)果進行預測。將預測得到的基因序列分別與KEGG、COG、GO數(shù)據(jù)庫進行BLAST比對，獲得預測基因的注釋信息。利用Center for Genomic Epidemiology 網(wǎng)站 (http://www.genomicepidemiology.org)中的ResFinder3.2及PlasmidFinder 軟件對耐藥基因及質(zhì)粒分型進行預測分析。

2 結(jié) 果

2.1 藥敏試驗結(jié)果15株鶉雞腸球菌對青霉素、氨芐西林、高濃度慶大霉素、左氧氟沙星耐藥率分別為20%、33.3%、33.3%、26.7%；對萬古霉素的MIC值集中在4 mg/L和8 mg/L，所占比例分別為40%和33.3%，MIC中位數(shù)為4 mg/L，檢出1株(6%)萬古霉素高水平耐藥株編號EG17906(MIC為256 mg/L)；所有菌株對利奈唑胺敏感。編號EG17906菌株對替考拉寧(MIC為24 mg/L)耐藥，對青霉素、氨芐西林、高濃度慶大霉素、左氧氟沙星均敏感。

2.2 耐藥基因檢測15株鶉雞腸球菌中均檢出vanC1基因；編號EG17906同時檢出vanA基因。電泳結(jié)果見圖1。

1：陰性對照；2、3: vanC1；4、5： vanA；6、7：van C2/3；8：Marker

2.3 全基因組測序分析EG17906基因組大小為3765197 bp，鳥嘌呤(Guanine, G)和胞嘧啶(Cytosine, C)所占的比率GC含量為40.4%，總基因數(shù)為3754，基因組含有3592個編碼序列，60個tRNA編碼基因以及10個完整的rRNA基因編碼的操縱子，有160個重疊群，其中N50含量達到190271，同時有8個L50。耐藥基因預測分析該菌株攜帶VanC1XY、VanHAX、erm(A)、erm(A)、tet(O)、cat(pC221)。全基因序列提交至美國國家生物技術信息中心(National Center of Biotechnology Information，NCBI)數(shù)據(jù)庫，GeneBank號為JABMDB000000000。

3 討 論

本研究結(jié)果顯示，鶉雞腸球菌對青霉素、氨芐西林、高濃度慶大霉素、左氧氟沙星的耐藥率在35%以下；對萬古霉素大多呈現(xiàn)為敏感或低水平耐藥(MIC值集中在4 mg/L和8 mg/L)，與該菌株天然攜帶vanC1基因相關。但仍有文獻報道檢出高水平耐藥菌株[10]。本研究亦檢出萬古霉素高水平耐藥菌株編號EG17906(MIC為256 mg/L)，該菌株對萬古霉素(MIC為256 mg/L)和替考拉寧(MIC為24 mg/L)耐藥，對青霉素、氨芐西林、高濃度慶大霉素、左氧氟沙星均敏感。所有菌株對利奈唑胺敏感。

鶉雞腸球菌的定植和感染流行率呈相關[11]。健康志愿者糞便樣本鶉雞腸球菌的攜帶率約為9%[12]；另兩個研究顯示住院患者直腸拭子中鶉雞腸球菌分離率分別為5.2%[13]和 1.2%[14]。而據(jù)日本2005-2014年回顧性研究，在腸球菌導致的血流感染中鶉雞腸球菌占2.7%，是萬古霉素耐藥致腸球菌血流感染的第三大病因[15]。

腸球菌對糖肽類藥物耐藥可表現(xiàn)為VanA表型、VanB表型和VanC 表型。VanA表型一般由vanA基因介導，造成菌株對萬古霉素和替考拉寧呈高水平耐藥，VanB表型一般由vanB基因介導，造成菌株對萬古霉素耐藥而對替考拉寧敏感，VanC 表型菌株一般對萬古霉素呈現(xiàn)出低水平的固有耐藥，由vanC基因介導。vanA基因可存在于可接合傳遞的質(zhì)粒上，并造成腸球菌間或葡萄球菌耐藥基因的獲得進而造成上述菌株對糖肽類藥物的高水平耐藥。作為染色體攜帶vanC基因的鶉雞腸球菌，一般對萬古霉素呈低水平耐藥或體外敏感。但不斷有文獻報道同時攜帶vanA和vanC基因菌株造成的臨床感染[10]，表明糖肽抗性的表型和基因型特征可能并不總是一致的。而在本研究調(diào)查中，同樣存在vanA和vanC1介導高水平萬古霉素耐藥的鶉雞腸球菌，提示這種耐藥菌株存在全球性的流行性。本院存在vanA介導耐藥屎腸球菌的播散流行，對于鶉雞腸球菌vanA基因的獲得是否與屎腸球菌有關尚待研究。耐藥表型與耐藥基因一般呈現(xiàn)一致性。而目前耐藥基因的確定一般采用PCR擴增及測序。本研究分離菌株經(jīng)PCR檢出vanA和vanC1基因，同時對該菌株進行全基因組測序同樣驗證了上述基因的存在，并發(fā)現(xiàn)vanA基因周圍存在表達調(diào)控基因。

雖然目前臨床未將萬古霉素作為鶉雞腸球菌的臨床首選治療藥物，但仍不能放松對鶉雞腸球菌在萬古霉素等藥物中的監(jiān)測，以更早地發(fā)現(xiàn)可能存在的菌株播散，預防可能存在的耐藥基因的水平傳遞或菌株的克隆播散。這一事實突出了嚴格執(zhí)行抗生素政策以及更嚴格遵守感染控制措施，以防止耐抗生素細菌出現(xiàn)和傳播的重要性。