呂 磊，李 瑤，王永園，金 濤，鐘 勇

0 引 言

大強度超負荷運動可誘發(fā)心肌缺血缺氧。近年研究發(fā)現(xiàn)，運動預(yù)適應(yīng)可以通過反復(fù)短暫、高強度的間歇性運動誘發(fā)機體產(chǎn)生內(nèi)源性保護作用，從而使心肌對后續(xù)長時間的缺血、缺氧產(chǎn)生耐受，減輕心肌損傷。研究證實，運動預(yù)適應(yīng)能減少缺血后心梗面積，改善缺血后心功能，減少心律失常，還可能改善心肌細胞能量代謝[1]。既往研究表明，細胞凋亡參與了運動性心肌損傷，運動預(yù)適應(yīng)能通過上調(diào)凋亡相關(guān)基因Bcl-2和下調(diào)Bax的表達，減少動脈硬化大鼠急性心肌缺血所致的心肌細胞凋亡[2]。一氧化氮(NO)能改變線粒體通透性，阻斷含半胱氨酸蛋白水解酶(caspase)的激活，減少凋亡信號的釋放，從而減少細胞凋亡[3]。然而，運動預(yù)適應(yīng)對力竭運動所致心肌細胞凋亡的作用及其具體機制尚未明確。本研究觀察運動預(yù)適應(yīng)對一次性運動力竭大鼠心肌形態(tài)改變、氧化應(yīng)激水平、心肌細胞凋亡和內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)的影響，初步探討其相關(guān)作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物健康雄性Sprague Dawley大鼠21只，體重150～170 g，購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司(SPF級)，動物合格證號：SCXK(滬)2018-0006。大鼠分籠飼養(yǎng)，室內(nèi)溫度(22±2)℃，濕度(50±5)%，標(biāo)準(zhǔn)實驗大鼠飼料喂養(yǎng)，自由進食，純凈水自由飲用，自然光照，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，進行跑臺適應(yīng)性訓(xùn)練(跑臺速度15 m/min，坡度0°)，每天訓(xùn)練15 min，共5 d。本研究動物操作方法遵循國家實驗動物管理條例和細則，動物處置方法均符合倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)(倫理批準(zhǔn)號:2018JLHZXKT-001)。

1.2 實驗動物分組和模型建立參照文獻[4]，適應(yīng)性訓(xùn)練后，將大鼠采用隨機數(shù)字表法分為3組：安靜對照組(不運動)、運動力竭組和運動預(yù)適應(yīng)組，每組7只。一次性力竭運動模型參照文獻[5]標(biāo)準(zhǔn)建立，大鼠在跑臺上進行持續(xù)性運動(跑臺速度30 m/min，坡度0°)，直至力竭。判斷力竭狀態(tài)的標(biāo)準(zhǔn)為: 大鼠伏臥于跑道，雙眼無光，四肢癱軟，聲、光等外界刺激均不能使其繼續(xù)運動，翻轉(zhuǎn)后無法翻正[6]。運動預(yù)適應(yīng)組大鼠在跑臺上進行重復(fù)4次的間歇性運動(跑臺速度28～30 m/min)，每次運動15 min、休息15 min，30 min后行一次性力竭運動。

1.3 HE染色觀察心肌形態(tài)改變力竭運動后，留取大鼠新鮮左心室心尖部，4%多聚甲醛溶液固定，修剪脫水后石蠟包埋，標(biāo)本按4～5 μm連續(xù)切片脫蠟至水后進行蘇木素-伊紅(HE)染色，鏡下觀察大鼠心肌組織改變。

1.4 TUNEL染色法檢測心肌細胞凋亡指數(shù)大鼠新鮮左室心肌組織固定后制作石蠟切片，常規(guī)方法脫蠟水化，按原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記法(TUNEL)凋亡檢測試劑盒(美國Roche公司)說明進行心肌細胞凋亡原位檢測。熒光顯微鏡下正常心肌細胞細胞核呈藍色，凋亡心肌細胞細胞核呈綠色(TUNEL陽性)。隨機計數(shù)5個非重疊高倍鏡視野(×400)下凋亡心肌細胞數(shù)和心肌細胞總數(shù)，兩者的比值即為心肌細胞凋亡指數(shù)。

1.5 氧化應(yīng)激指標(biāo)和一氧化氮測定實驗結(jié)束后取靜脈血，1500×g離心5 min，留取上清，4 ℃保存。嚴(yán)格按試劑盒(南京建成生物工程研究所有限公司)步驟操作，硫代巴比妥酸比色法在532 nm處測定丙二醛(MDA)含量，黃嘌呤氧化酶法在450 nm處測定超氧化物歧化酶(SOD)含量，比色法在550 nm處測定一氧化氮(NO)含量。

1.6 Western blot法測定大鼠心肌內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)水平力竭運動后，留取大鼠左心室心肌組織，液氮冷凍后-80℃保存。取大鼠心肌組織在組織裂解液中勻漿并離心，提取心肌組織總蛋白，考馬斯亮藍法蛋白定量。取蛋白40 μg，聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜后分別用eNOS一抗(1∶1000，美國CST公司)，內(nèi)參GAPDH抗體(1∶2500，美國CST公司)封閉，4 ℃過夜。再用辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗(1∶5000稀釋)室溫封閉，孵育2 h。使用Gel Doc2000凝膠圖像專用軟件(Bio-Rad公司)對目標(biāo)條帶進行分析，測積分吸光度值，以目的條帶與GAPDH條帶灰度值的比值表示結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 心肌組織HE染色結(jié)果光鏡下，安靜對照組大鼠心肌纖維、膠原纖維等紅染，染色均勻，結(jié)構(gòu)清楚，心肌纖維形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，無水腫，心肌細胞排列規(guī)則，細胞核藍染。運動力竭組大鼠心肌細胞染色欠均，排列較紊亂，部分肌纖維斷裂、排列紊亂和局限性間質(zhì)水腫。運動預(yù)適應(yīng)組大鼠心肌染色比較均勻，少量心肌纖維排列紊亂、腫脹。見圖1。

a：安靜對照組；b：運動力竭組；c：運動預(yù)適應(yīng)組

2.2 心肌細胞TUNEL染色及心肌細胞凋亡指數(shù)比較安靜對照組大鼠未見心肌細胞凋亡，運動力竭組和運動預(yù)適應(yīng)組均可見凋亡細胞，見圖2。運動力竭組凋亡指數(shù)為(12.48±2.88)%，運動預(yù)適應(yīng)組凋亡指數(shù)為(3.51±0.78)%，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

a：安靜對照組，未見凋亡心肌細胞；b：運動力竭組，可見凋亡細胞；c：運動預(yù)適應(yīng)組，僅見少許凋亡心肌細胞

2.3 各組大鼠SOD活性、MDA含量和NO含量運動力竭組大鼠血清MDA含量較安靜對照組明顯升高，SOD活性和NO含量降低(P<0.05)。運動預(yù)適應(yīng)后，MDA含量下降，SOD活性和NO含量均高于運動力竭組(P<0.05)，見表1。

表1 各組大鼠SOD活性、MDA含量和NO含量比較

2.4 運動預(yù)適應(yīng)對大鼠心肌組織中eNOS蛋白表達的影響Western blot法測定結(jié)果顯示，運動力竭組eNOS蛋白表達(0.56±0.17)較安靜對照組(1.00±0.12)下降，而運動預(yù)適應(yīng)組(1.91±0.22)顯著高于運動力竭組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果提示運動預(yù)適應(yīng)增加了大鼠心肌組織中eNOS的蛋白表達水平。見圖3。

GAPDH(內(nèi)參)：甘油醛-3-磷酸脫氫酶

3 討 論

反復(fù)短暫的高強度運動，即運動預(yù)適應(yīng)，可通過誘導(dǎo)內(nèi)源性保護作用，增強機體對隨后高強度運動的耐受性，減少機體損傷。研究表明，運動預(yù)適應(yīng)可明顯降低大強度力竭運動時心肌肌鈣蛋白I和N端腦鈉肽激素原的濃度，保護心肌[7]。運動預(yù)適應(yīng)對心肌保護作用分早期保護和晚期保護兩個時相，早期保護更為明顯[8]。本研究觀察光鏡下心肌細胞的病理改變，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，運動力竭組大鼠心肌細胞排列紊亂，伴部分肌纖維斷裂和局限性間質(zhì)水腫，而運動預(yù)適應(yīng)后再進行力竭運動，心肌細胞損傷較輕，提示運動預(yù)適應(yīng)減輕了力竭運動所致大鼠心肌的組織病理改變。

SOD是調(diào)節(jié)過氧化水平、清除過氧化物的主要酶，通過催化超氧陰離子的歧化反應(yīng)，抑制超氧自由基的連鎖反應(yīng)，有效減緩機體內(nèi)脂質(zhì)過氧化程度，降低機體氧化應(yīng)激損傷，是機體重要的氧自由基清除劑。MDA是氧自由基攻擊細胞膜中不飽和脂肪酸，產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化作用的產(chǎn)物之一，可反映體內(nèi)氧自由基活性[9-10]。本研究結(jié)果顯示，大鼠力竭運動后血清SOD活性較安靜對照組明顯降低，MDA含量顯著增加，運動預(yù)適應(yīng)組與運動力竭組比較，SOD活性升高，MDA含量下降，提示力竭運動增加了機體氧化應(yīng)激水平，而運動預(yù)適應(yīng)提高抗氧化酶活性，使機體對活性氧產(chǎn)生適應(yīng)能力，減少因機體組織缺血缺氧所致的氧自由基生成。

本研究進一步觀察了運動力竭組和運動預(yù)適應(yīng)組大鼠心肌凋亡指數(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)運動預(yù)適應(yīng)組顯著低于運動力竭組，提示一次性力竭運動可導(dǎo)致心肌細胞凋亡，而運動預(yù)適應(yīng)能減少心肌凋亡。力竭運動導(dǎo)致心肌細胞凋亡可能與氧自由基過度生成和細胞能量代謝障礙有關(guān)。力竭運動時心肌細胞缺血缺氧，氧自由基大量生成，葡萄糖和脂質(zhì)過氧化，細胞膜損傷，蛋白質(zhì)氧化和核內(nèi)DNA鏈斷裂，誘導(dǎo)心肌細胞凋亡[11]。此外，力竭運動時心肌缺血缺氧，抑制線粒體氧化磷酸化，ATP生成減少，細胞能量代謝障礙，鈣離子轉(zhuǎn)運功能被抑制，胞漿和線粒體鈣超載，通過激活磷脂酶破壞細胞膜和激活蛋白酶使蛋白分解，導(dǎo)致心肌細胞凋亡[12]。

NO是一種舒張血管的小分子化學(xué)物質(zhì)，廣泛存在于多種組織細胞中，通過升高環(huán)磷酸鳥苷含量誘導(dǎo)平滑肌舒張，在人體心腦血管、中樞神經(jīng)系統(tǒng)和炎癥免疫反應(yīng)中參與生理和病理過程。生理濃度水平NO參與調(diào)節(jié)血管通透性和血管張力、穩(wěn)定血壓等生理過程。缺氧時，內(nèi)皮細胞釋放NO，激活鳥苷酸環(huán)化酶增加細胞內(nèi)環(huán)磷酸鳥苷水平，通過降低血管平滑肌中鈣離子水平，擴張血管平滑肌[13]。NO還能通過減少凋亡信號的釋放來減少細胞凋亡[3]。一氧化氮合酶(NOS)是一氧化氮合成的關(guān)鍵酶，eNOS也稱為NOS3，為鈣離子依賴性酶，以L-精氨酸為底物，在血管內(nèi)利用氧催化產(chǎn)生NO，參與生理調(diào)控，在維持血管穩(wěn)態(tài)、調(diào)節(jié)心肌細胞功能中起重要作用[14]。既往研究表明，短期平板運動能顯著增加大鼠腦血管和主動脈中eNOS的表達[15]，長期運動訓(xùn)練能增加慢性心衰大鼠左室eNOS的活性[16]。本研究表明，與安靜對照組相比，運動力竭組NO和心肌組織eNOS表達水平均下降，而運動預(yù)適應(yīng)能上調(diào)心肌組織eNOS的表達水平，增加NO濃度，抑制心肌細胞凋亡。

綜上所述，運動預(yù)適應(yīng)能減輕一次性力竭運動大鼠心肌損傷所致心肌細胞凋亡和自由基釋放，eNOS可能參與這一保護作用。