王茂鑫，陳賢明，龔宏勛，陳十燕，楊 帆，陳 函

0 引 言

鼻咽癌是頭頸部常見(jiàn)惡性腫瘤之一，我國(guó)東南地區(qū)多發(fā)，近年來(lái)有增多趨勢(shì)。放療是鼻咽癌的首選治療方法，但是鼻咽癌的放療抵抗和復(fù)發(fā)仍是鼻咽癌治療中的難點(diǎn)[1-3]。我們的前期工作已發(fā)現(xiàn)，抑制鼻咽癌細(xì)胞中環(huán)指蛋白8(ring finger protein 8, RNF8)的表達(dá)能夠提高腫瘤細(xì)胞對(duì)放射線的敏感性[4]。但有關(guān)干擾RNF8基因表達(dá)在體內(nèi)是否會(huì)提高鼻咽癌的放療敏感性，目前還未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用小干擾RNA(small RNA interference,siRNA)沉默CNE1細(xì)胞的RNF8基因,篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞,注入裸鼠體內(nèi)，建立移植瘤模型，探討RNF8與鼻咽癌放療抵抗的關(guān)系及沉默RNF8與鼻咽癌放療敏感性之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞和主要試劑鼻咽癌CNE-1細(xì)胞系購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。RNF8沉默的CNE-1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞來(lái)自原福州總醫(yī)院[1]。RNF8抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)，共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張癥突變基因(ataxia-telangiectasia mutate,ATM)抗體(美國(guó)Biovision公司)，DNA依賴(lài)蛋白激酶催化亞單位(DNA dependent protein kinase catalytic subunit,DNA-PKcs)抗體(美國(guó)Thermo公司)，異硫氰酸熒光素(Fluorescein Isothiocyanate， FITC)標(biāo)記的兔抗鼠二抗(美國(guó)Sigma公司)。AnnexinV-FITC (Abcam, Cambridge, UK)。

1.1.2 動(dòng)物BALB/c裸鼠30只購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：2019-0496)；本實(shí)驗(yàn)經(jīng)聯(lián)勤保障部隊(duì)第九○○醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào)：2016-021)。鼠齡3～4周齡，體重12～18 g，均為雄性，在無(wú)特定病原體(SPF)、恒定溫度(22～25 ℃)的無(wú)菌層流動(dòng)物房?jī)?nèi)飼養(yǎng)，經(jīng)高壓滅菌飼料和水供動(dòng)物自由食用。

1.1.3 主要儀器熒光倒置顯微鏡(德國(guó)Leica公司)，BCM-1000A型生物潔凈工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)，酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Rad公司)，流式細(xì)胞儀(美國(guó)Becton Dickinson FAC Sort公司)，2100C型直線加速器(美國(guó)Varian公司)。

1.2 方法先用Westernblot法檢測(cè)沉默和未沉默RNF8的細(xì)胞中RNF8的蛋白表達(dá)，用Image J軟件分析條帶灰度值，計(jì)算與內(nèi)參GAPDH灰度值的比值，驗(yàn)證siRNA對(duì)RNF8的沉默效果。

1.2.1 裸鼠成瘤取沉默和未沉默RNF8的CNE-1細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，CNE-1細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液(臺(tái)盼藍(lán)拒染法計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)占95%以上)，用RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)細(xì)胞懸液為2×106個(gè)/0.2 mL，于每只裸鼠背部皮下接種細(xì)胞懸液0.2 mL，2周后待腫瘤直徑達(dá)8～10 mm時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 成瘤裸鼠放療將成瘤裸鼠30只按隨機(jī)數(shù)字法分為RNF8未沉默組(RNF8+組)和RNF8沉默組(RNF8-組)，每組按放療照射劑量的不同又分5個(gè)亞組，每個(gè)亞組3只，分別給予0、4、8、12、16 Gy照射,其中0 Gy為對(duì)照亞組。采用局部分割照射，裸鼠均放入特制容器固定，放置于放療機(jī)，照射腫瘤局部，以1 cm厚鉛板防護(hù)動(dòng)物其余部位，照射距離為100 cm，照射野為4 cm×4 cm，劑量率為78 cGy/min。每次2 Gy。照射完成10 d后殺鼠取瘤，稱(chēng)重觀察抑瘤情況,計(jì)算抑瘤率，公式為：

抑瘤率=[(對(duì)照亞組平均瘤重-每個(gè)劑量亞組平均瘤重)/對(duì)照亞組平均瘤重]×100%

1.2.3 將放療后的腫瘤制成單細(xì)胞懸液取2組8 Gy劑量亞組腫瘤組織各約100 mg，在120目的不銹鋼網(wǎng)下方置一平皿，用眼科小剪刀將腫瘤組織剪碎，再用鑷子輕輕在網(wǎng)上搓組織塊，邊搓邊用等滲鹽水沖洗，直至將組織搓完為止。將平皿中的細(xì)胞混懸液用300目銅網(wǎng)過(guò)濾，收集細(xì)胞懸液，以800 r/min離心沉淀2 min(離心半徑15 cm)。調(diào)整細(xì)胞數(shù)至1×106/mL，取0.1mL細(xì)胞懸液，用專(zhuān)用磷酸鹽緩沖液[0.01%磷酸鹽緩沖液(PBS)+0.5%牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)]+2 mmol/L的乙二胺四乙酸(EDTA)洗滌，重懸。

1.2.4 Annexin V/propidium iodide (PI)雙染檢測(cè)RNF8+組8 Gy劑量亞組和RNF8-組8 Gy劑量亞組及其對(duì)照亞組凋亡率取100 μL細(xì)胞懸液加入10 μL AnnexinV-FITC, 輕輕搖晃，冰上避光孵育15 min，再加入 10 μL PI冰上避光孵育5 min，然后加入400 μL專(zhuān)用緩沖液制成單細(xì)胞懸液，流式細(xì)胞儀檢測(cè)?？瞻讓?duì)照不加Annexin V-FITC+PI。

1.2.5 應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)DNA-PK、ATM的表達(dá)100 μL的RNF8+組8 Gy劑量亞組和RNF8-組8 Gy劑量亞組細(xì)胞懸液加入FC受體10 μL孵育，加入抗體(50 μg/mL)10 μL，4 ℃避光孵育1 h，0.01%PBS洗滌，離心，再加入FITC標(biāo)記二抗，4 ℃避光孵育30 min，1%多聚甲醛固定，500目濾網(wǎng)過(guò)濾，重懸，空白對(duì)照不加一抗，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1 RNF8沉默效果的驗(yàn)證結(jié)果RNF8在RNF8-組中只有微量表達(dá)(0.11±0.03)，而在RNF8+組中表達(dá)明顯升高(1.18±0.23)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)圖1。

圖示RNF8+組的RNF8表達(dá)明顯高于RNF8-組

2.2 放療后2組細(xì)胞在各個(gè)劑量點(diǎn)抑瘤率的比較隨著放療劑量的增高，2組的腫瘤均有所縮小，見(jiàn)圖2。RNF8+組抑瘤率在各個(gè)劑量點(diǎn)均低于RNF8-組，其中，在8 Gy和12 Gy劑量點(diǎn)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),但其中RNF8+組8 Gy劑量亞組和RNF8-組8 Gy劑量亞組差異最大(P<0.01)，見(jiàn)表1。

圖示RNF8+組形成的腫瘤在各個(gè)劑量放療后均大于RNF8-組

表1 RNF8未沉默與沉默成瘤裸鼠在各個(gè)放療劑量點(diǎn)的抑瘤率比較

2.3 放療后2組細(xì)胞的8 Gy劑量亞組凋亡率的比較放療后RNF8+組8 Gy劑量亞組和 RNF8-組8 Gy劑量亞組凋亡率均較各自的對(duì)照亞組升高，且RNF8+組8 Gy劑量亞組凋亡率明顯低于RNF8-組8 Gy劑量亞組(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

a:RNF8+組;b:RNF8-組

2.4 放療后2組細(xì)胞的8 Gy劑量亞組的ATM和DNA-PKcs表達(dá)水平的比較放療后RNF8+組8 Gy劑量亞組ATM的表達(dá)明顯高于RNF8-組8 Gy劑量亞組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；RNF8+組8 Gy劑量亞組DNA-PKcs的表達(dá)亦高于RNF8-組8 Gy劑量亞組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 8 Gy放療后RNF8未沉默與沉默裸鼠移植瘤的ATM、DNA-PKcs的表達(dá)比較

3 討 論

鼻咽癌的放療后殘留和復(fù)發(fā)與多種因素有關(guān)，如腫瘤的分期、大小、侵犯范圍、病理類(lèi)型有關(guān)，但鼻咽癌細(xì)胞對(duì)放射線的抵抗亦是重要因素。而這種抵抗是通過(guò)對(duì)損傷的腫瘤細(xì)胞DNA進(jìn)行修復(fù)實(shí)現(xiàn)的。放射線導(dǎo)致細(xì)胞DNA損傷，此時(shí)腫瘤細(xì)胞可以激活多種蛋白來(lái)修復(fù)損傷的DNA，從而使腫瘤細(xì)胞存活下來(lái)，放療停止后，腫瘤細(xì)胞可以再次增殖導(dǎo)致復(fù)發(fā)。研究表明，細(xì)胞主要通過(guò)非同源性末端連接(DNA nonhomologous end-joining，NHEJ)和同源重組(homologous recombination，HR)兩種途徑來(lái)修復(fù)損傷的DNA，DNA依賴(lài)蛋白激酶(DNA-dependent protein kinase，DNA-PK)是前者關(guān)鍵酶，ATM是后者關(guān)鍵酶[5-8]。而RNF8是一個(gè)包含環(huán)指結(jié)構(gòu)的E3泛素連接酶家族成員，在細(xì)胞受到電離輻射時(shí)，RNF8泛素化多種底物并募集多種因子至DNA損傷部位，進(jìn)行DNA的修復(fù)[9-13]。Lu等[14]發(fā)現(xiàn)RNF8泛素化多種蛋白使Nijmegen斷裂綜合征1(Nijmegen breakage syndrome, Nbs1)等分子聚集在DNA損傷位點(diǎn), 通過(guò)HR途徑修復(fù)DNA。Wu等[15]發(fā)現(xiàn)RNF8與FHA和環(huán)指檢查點(diǎn)(checkpoint with FHA and ring finger,Chfr)共同調(diào)控ATM的活性，進(jìn)而調(diào)節(jié)ATM依賴(lài)的DNA損傷應(yīng)答。我們前期從細(xì)胞和分子水平的研究表明，RNF8-的鼻咽癌細(xì)胞比RNF8+細(xì)胞對(duì)放射線更加敏感，凋亡率更高，即RNF8+細(xì)胞的抵抗力更強(qiáng)，表明RNF8參與DNA的損傷修復(fù)。而放療后RNF8+細(xì)胞ATM的表達(dá)較RNF8-細(xì)胞高，表明RNF8激活A(yù)TM為主的HR途徑，導(dǎo)致放療抵抗[4]。本研究還從人鼻咽癌標(biāo)本中檢測(cè)RNF8的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)RNF8陽(yáng)性者殘留和復(fù)發(fā)的發(fā)生率升高，生存率降低，提示RNF8參與鼻咽癌放療抵抗[16]。

我們?cè)诨铙w內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果也得出類(lèi)似結(jié)論。本研究通過(guò)對(duì)裸鼠移植瘤的研究發(fā)現(xiàn)，RNF8-組腫瘤較RNF8+組放療后的生長(zhǎng)抑制率高，提示RNF8-組更容易受到放射線損傷，而RNF8+組有放療抵抗，由此可以推論RNF8參與DNA的損傷修復(fù)。在檢測(cè)凋亡率的實(shí)驗(yàn)中，RNF8沉默后，放療后腫瘤細(xì)胞凋亡率較RNF8+組明顯升高，進(jìn)一步證實(shí)了這一點(diǎn),即缺少了RNF8, 腫瘤細(xì)胞更容易被放射線殺傷，表明RNF8在腫瘤細(xì)胞的放療抵抗中具有重要作用。進(jìn)一步的研究顯示，RNF8+組放療后ATM表達(dá)升高，而RNF8-組放療后的ATM表達(dá)無(wú)明顯變化，即腫瘤的RNF8表達(dá)受抑制后，接受射線照射其ATM表達(dá)也受抑制，表明ATM的表達(dá)是受RNF8調(diào)節(jié)或控制的，提示RNF8通過(guò)調(diào)節(jié)ATM，通過(guò)HR途徑修復(fù)損傷的DNA。而DNA-PKcs在放療后的RNF8-組和RNF8+組均有所升高，提示DNA-PK可能也參與了DNA的修復(fù)，但組間無(wú)明顯差異，表明DNA-PK并不受RNF8的調(diào)節(jié)，與我們之前的研究結(jié)果有較好的一致性[4]。

總之，RNF8通過(guò)激活以ATM為主的HR途徑來(lái)修復(fù)腫瘤細(xì)胞DNA，從而導(dǎo)致腫瘤的放療抵抗。但鼻咽癌的放療抵抗機(jī)制非常復(fù)雜，RNF8激活HR途徑修復(fù)損傷的DNA只是其中的一個(gè)方面，這就需要更加深入地研究鼻咽癌的放療抵抗機(jī)制，從而采取針對(duì)性的措施，減少放療抵抗，提高腫瘤的放療敏感性，進(jìn)而提高患者生存率。