李武杰，李大軍，張樊蘋，楊振剛，潘新良

(1.泰安市中心醫(yī)院 耳鼻咽喉科,山東 泰安 271000； 2.山東大學(xué)齊魯醫(yī)院 耳鼻咽喉頭頸外科,山東 濟(jì)南 250012)

下咽鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生部位比較隱匿，不易發(fā)現(xiàn)，其生物學(xué)特性惡劣，同時下咽部有豐富的淋巴管網(wǎng)，因此極易出現(xiàn)頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，使患者就診時多為晚期[1]?；颊叩目傮w生存率相對較低，5年總生存率為30%～45%[2]。緊密連接(tight junction, TJ)存在于機(jī)體的上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞間，維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和保持細(xì)胞的極性，其主要封閉蛋白是claudin蛋白[3]，其表達(dá)數(shù)量和分布結(jié)構(gòu)的變化直接影響細(xì)胞膜表面功能區(qū)緊密連接的結(jié)構(gòu)和功能。Claudin-1是目前發(fā)現(xiàn)的claudins家族成員中的一個，在不同的腫瘤中有不同的表達(dá)方式，這種差異性的表達(dá)方式已被證實(shí)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。

D2- 40是目前已發(fā)現(xiàn)的最具有特異性的淋巴管標(biāo)記物，能識別特異性表達(dá)于淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的唾液酸糖蛋白[4]，不僅能識別極少量淋巴管的存在，還能特異性判斷腫瘤的淋巴源性及血管源性[5]。因而廣泛的應(yīng)用于腫瘤淋巴管生成的研究。

本研究通過檢測97例下咽鱗狀細(xì)胞癌患者癌組織中claudin-1與D2- 40蛋白的表達(dá)，分析claudin-1及微淋巴管密度(microlymphatic vessel density，MLVD)之間的相互關(guān)系，探討它們與下咽鱗狀細(xì)胞癌浸潤、轉(zhuǎn)移及預(yù)后的關(guān)系，探索下咽鱗狀細(xì)胞癌淋巴轉(zhuǎn)移的機(jī)制，從而為下咽鱗狀細(xì)胞癌的治療和抑制其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本收集

收集2008年1月—2011年4月在山東大學(xué)齊魯醫(yī)院耳鼻咽喉科手術(shù)治療并經(jīng)病理確診的下咽鱗狀細(xì)胞癌97例，同期取癌旁組織90例，距腫瘤切緣2 cm以上的形態(tài)學(xué)正常的黏膜組織作為對照。所有病例術(shù)前均未接受放射治療、化療或免疫治療等治療，均行標(biāo)準(zhǔn)根治性手術(shù)，且手術(shù)切緣均為陰性，術(shù)后均行放療治療，劑量為50～65Gy。按國際抗癌聯(lián)合會(UICC，2002)的TNM分期標(biāo)準(zhǔn)對所有病例進(jìn)行病理分期和分型等。所有患者的具體臨床資料見表1。所有樣本收集前都經(jīng)過山東大學(xué)齊魯醫(yī)院倫理委員會審核通過并征得患者或家屬書面同意。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

免疫組織化學(xué)染色claudin-1(ZA-0365)和D2- 40(ZM-0465) 試劑均購于北京中衫金橋生物公司。按免疫組織化學(xué)染色PV9000二步法進(jìn)行染色。

1.3 結(jié)果判定

由兩位有經(jīng)驗(yàn)的病理科醫(yī)生獨(dú)立閱片并觀察記錄染色結(jié)果，claudin-1陽性顆粒為黃色或棕黃色，定位于細(xì)胞膜/細(xì)胞質(zhì)。參照金浩等[6]改良法的標(biāo)準(zhǔn)，按照至少10個400倍視野下染色細(xì)胞計(jì)數(shù)所占比例進(jìn)行分級。綜合染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞所占比例進(jìn)行半定量測定。染色強(qiáng)度評分標(biāo)準(zhǔn):不著色(0分)，黃色(1分)，棕黃色(2分)，黃褐色(3分)；陽性細(xì)胞數(shù)評分標(biāo)準(zhǔn)：<10%(0分)，10%～40% (1分)，40%～70%(2分)，>70%(3分)。兩者評分相加，0～2分為陰性(-)，2分為弱陽性(+)，3～4分為陽性(++)，5～6分為強(qiáng)陽性(+++)。所有結(jié)果均進(jìn)行雙盲讀片，3分及以上為高表達(dá)，2分及以下為低表達(dá)。

MLVD計(jì)數(shù)：D2- 40染色微淋巴管內(nèi)皮，陽性表達(dá)于微淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的胞質(zhì)，呈棕黃色顆粒，染色陽性的微淋巴管的管壁較薄，多由單層內(nèi)皮細(xì)胞組成，不含有肌層，形狀也不規(guī)則，并且管腔內(nèi)無紅細(xì)胞，可呈圓形、擴(kuò)張狀或閉塞呈條索狀，部分微淋巴管的管壁不完整。參照Weidner等[7]報(bào)道的方法，首先在低倍鏡下(×100)掃視整個切片，確定腫瘤組織內(nèi)微淋巴答最豐富的區(qū)域即“hot spot”，然后在高倍鏡下(×400)計(jì)數(shù)每一視野的微淋巴管數(shù)目，單個或者成群無管腔的棕黃色染色的淋巴內(nèi)皮細(xì)胞或細(xì)胞叢可作為一個獨(dú)立的淋巴管，其分枝結(jié)構(gòu)不相連亦可作為一個微淋巴管計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)均由兩位病理科醫(yī)師采用雙盲法獨(dú)立進(jìn)行，分別計(jì)數(shù)癌巢中心、癌巢周邊及癌旁正常組織的微淋巴管，取其均值。結(jié)果采用5個400倍視野下微淋巴管數(shù)目的平均值作為MLVD。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。兩組樣本間的比較分別采用獨(dú)立樣本Mann-Whitney雙尾檢驗(yàn)。分析標(biāo)志物和臨床病理特征之間的關(guān)系時采用Pearsonχ2檢驗(yàn)。采用Log rank實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行了生存分析。MLVD與claudin-1表達(dá)相關(guān)性檢驗(yàn)用Spearman相關(guān)分析。所有統(tǒng)計(jì)分析均為雙側(cè)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Claudin-1蛋白免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

2.1.1 Claudin-1蛋白在下咽癌組織及癌旁組織中的表達(dá) 我們對97例下咽鱗狀細(xì)胞癌組織和90例癌旁黏膜組織進(jìn)行了免疫組織化學(xué)染色，結(jié)果顯示claudin-1在細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中都有表達(dá)，但是主要表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)的核膜周圍,且表現(xiàn)為異質(zhì)性，有些區(qū)域呈彌漫性，有些區(qū)域呈局灶性。Claudin-1在73.2%(71/97)的癌組織中高表達(dá)，而僅在30%(27/90)的癌旁組織中高表達(dá)。經(jīng)過統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 Claudin-1在腫瘤中的表達(dá)(PV9000二步法) A：claudin-1在腫瘤中陰性表達(dá) (×200)； B：claudin-1在腫瘤中弱陽性表達(dá) (×200)； C：claudin-1在腫瘤中的中度陽性表達(dá) (×200)； D：claudin-1在腫瘤中強(qiáng)陽性表達(dá) (×200)

2.1.2 Claudin-1蛋白在腫瘤中的表達(dá)與臨床病理學(xué)指標(biāo)的相關(guān)性分析 我們采用Pearsonχ2檢驗(yàn)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示claudin-1蛋白表達(dá)與腫瘤的分化程度(P=0.004)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.026)有關(guān)；其余臨床病理學(xué)指標(biāo)和claudin-1蛋白表達(dá)無明顯相關(guān)性。具體數(shù)據(jù)見表1。

表1 Claudin-1表達(dá)、MLVD與臨床資料之間的關(guān)系

2.1.3 Claudin-1與患者生存分析 97例下咽鱗狀細(xì)胞癌患者，術(shù)前均留存詳細(xì)聯(lián)系方式，術(shù)后均通過門診復(fù)診或電話獲得隨訪，隨訪3～5年。我們采用Log rank實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行生存分析發(fā)現(xiàn)claudin-1與患者的生存率相關(guān)(P=0.003)，見圖2。

圖2 Claudin-1與患者生存分析

2.2 D2- 40免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

2.2.1 D2- 40在下咽鱗狀細(xì)胞癌和癌旁正常黏膜組織中MLVD的表達(dá)情況 D2- 40陽性表達(dá)于微淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的胞漿，呈棕黃色顆粒，在下咽鱗狀細(xì)胞癌癌巢中心區(qū)、周邊區(qū)及癌旁正常黏膜組織中均可見到D2- 40染色陽性的微淋巴管分布，淋巴管的形態(tài)不一，數(shù)量多少不一。癌巢中心區(qū)的微淋巴管較少或缺失，多呈塌陷條索狀(圖3A)，形狀不規(guī)則且管腔小、管壁薄；而在下咽癌周邊區(qū)的淋巴管多呈擴(kuò)張狀，形態(tài)多不規(guī)則(圖3B)，部分淋巴管內(nèi)可見癌栓(圖3C)。癌旁正常組織中的微淋巴管形態(tài)比較規(guī)則，大多呈擴(kuò)張狀，而且多分布于黏膜下(圖3D)。97例下咽鱗狀細(xì)胞癌標(biāo)本中，癌巢周邊區(qū)的MLVD數(shù)目(14.15±4.46)顯著高于癌巢中心區(qū)MLVD(3.35±2.32)，兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。癌巢周邊區(qū)的MLVD數(shù)目(14.15±4.46)也顯著高于癌旁正常黏膜組織中MLVD(4.52±2.65)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而癌巢中心區(qū)MLVD與癌旁正常黏膜組織中MLVD相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖3 不同部位組織中微淋巴管的表達(dá)(PV9000二步法) A：癌巢中心區(qū) (×200)； B：癌巢周邊區(qū) (×200)； C：癌巢周邊區(qū)微淋巴管內(nèi)可見癌栓 (×400)； D：癌旁正常組織 (×200)

2.2.2 MLVD與臨床資料的關(guān)系 癌巢中心區(qū)的MLVD與患者年齡、性別、吸煙史、飲酒史、組織病理學(xué)分級、臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)分析均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

癌巢周邊區(qū)的MLVD與患者年齡、性別、吸煙史、飲酒史等無關(guān)，而與組織病理學(xué)分級、臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等指標(biāo)顯著相關(guān)，分析均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 Claudin-1和MLVD的相互表達(dá)關(guān)系

癌巢中心區(qū)的claudin-1表達(dá)陽性組的MLVD為4.68±1.42，與陰性組(3.54±2.75)相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.667)；癌巢周邊區(qū)claudin-1表達(dá)陽性MLVD為16.58±3.36，與陰性組(12.16±2.54)相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。相關(guān)分析表明在下咽鱗癌癌巢周邊區(qū)中claudin-1表達(dá)與MLVD之間呈正相關(guān)表達(dá)(r=0.54,χ2=9.6，P=0.012)。

3 討論

目前研究發(fā)現(xiàn)，claudin-1的異常表達(dá)使上皮細(xì)胞滲透屏障功能破壞、細(xì)胞極性喪失、細(xì)胞間黏附力下降，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生發(fā)展[8]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)claudin-1高表達(dá)可以抑制E-鈣黏蛋白(E-cadherin)表達(dá)，失去E-cadherin表達(dá)使E-cadherin/Tcf信號通路上調(diào)；claudin-1在細(xì)胞膜上定位的改變、E-cadherin表達(dá)減少、E-cadherin /Tcf信號通路上調(diào)共同作用促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[9]。在多種腫瘤中可檢測到claudin-1高表達(dá)[10-11]；Dos Reis等[12]在口腔鱗狀細(xì)胞癌的研究中發(fā)現(xiàn)，claudin-1高表達(dá)與腫瘤組織的脈管侵犯和外周神經(jīng)侵犯有關(guān)。在本研究中發(fā)現(xiàn)claudin-1在下咽癌中的表達(dá)明顯高于癌旁組織中的表達(dá)，且claudin-1蛋白表達(dá)與腫瘤的分化程度(P=0.004)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.026)均有關(guān)，而與其他臨床病理學(xué)指標(biāo)無關(guān)；Kaplan-Meier分析顯示：claudin-1高表達(dá)患者的生存率低于低表達(dá)患者，且兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.003)，原因考慮claudin-1的高表達(dá)促進(jìn)了細(xì)胞遷移活性，同時伴隨基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)激活、層黏連蛋白-5y2裂解物和表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)受體激活[13]；而目前普遍認(rèn)為MMP-2表達(dá)水平的上調(diào)可以提高腫瘤的侵襲能力，患者往往預(yù)后不良[14]。說明claudin-1可能參與了下咽鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移過程，這個發(fā)現(xiàn)為下咽鱗狀細(xì)胞癌的診斷、預(yù)后評估和治療方案的選擇提供了重要依據(jù)，claudin-1高表達(dá)患者術(shù)后需要更多的干預(yù)措施。

D2- 40分子是由166個氨基酸構(gòu)成的一種唾液酸黏蛋白，是一種特異性的淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物，能特異性地判斷腫瘤淋巴源性還是血管源性[15]。在電子顯微鏡下對超微結(jié)構(gòu)的進(jìn)一步研究也顯示，D2- 40主要表達(dá)于微淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的腔面，而在大淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞以及血管的內(nèi)皮細(xì)胞中均不表達(dá)[16]，認(rèn)為D2- 40的特異性和敏感性均高于其他淋巴管分子標(biāo)記物[17]。本研究發(fā)現(xiàn)D2- 40在下咽鱗狀細(xì)胞癌組織中標(biāo)記的微淋巴管主要集中在癌巢周邊區(qū)及周圍間質(zhì)中，而血管內(nèi)皮細(xì)胞無明顯著色，與周圍組織也無明顯交叉染色，標(biāo)記MLVD有顯著的特異性，顯示了很好的臨床效果。它標(biāo)記的下咽鱗狀細(xì)胞癌癌巢周邊區(qū)的微淋巴管多呈擴(kuò)張的管腔狀，形態(tài)多不規(guī)則，內(nèi)無紅細(xì)胞，部分淋巴管內(nèi)可見癌栓，而下咽鱗狀細(xì)胞癌癌巢區(qū)的微淋巴管很少，有的甚至完全缺乏，管腔多閉鎖，形態(tài)呈閉鎖的線狀或者扁平的管狀，癌旁正常組織中的微淋巴管形態(tài)則相對比較規(guī)則，多呈擴(kuò)張的管腔狀，而且多分布于黏膜下，此結(jié)果說明，D2- 40對于下咽鱗狀細(xì)胞癌的淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞具有很高的特異性，是一種很好的微淋巴管標(biāo)記物。

Beasley 等[18]認(rèn)為，在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌中，腫瘤內(nèi)MLVD呈高表達(dá)，并且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，認(rèn)為這些新生淋巴管是有功能的，腫瘤通過這些淋巴管轉(zhuǎn)移到淋巴結(jié)。本研究發(fā)現(xiàn)在下咽癌中MLVD癌巢周邊區(qū)明顯高于癌巢區(qū)(14.15±4.46 vs 3.35±2.32)，兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，癌巢周邊區(qū)MLVD與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，而癌巢區(qū)則與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)，原因考慮可能是隨著腫瘤細(xì)胞過度生長及增殖，腫瘤組織內(nèi)部間隙壓力升高，癌巢區(qū)淋巴管呈高壓狀態(tài)，受到腫瘤細(xì)胞擠壓、入侵、破壞，導(dǎo)致微淋巴管受壓、塌陷、萎縮，并喪失功能[19]。而癌巢周邊區(qū)組織間隙壓力較低，所產(chǎn)生的間質(zhì)靜水壓較低，不足以使微淋巴管閉塞，使新生淋巴管多為擴(kuò)張狀，淋巴系統(tǒng)增生活躍，成為功能性淋巴管，為腫瘤細(xì)胞周邊轉(zhuǎn)移等提供了有利的條件[20]，腫瘤細(xì)胞可能通過這些淋巴管到達(dá)淋巴結(jié)，從而促進(jìn)了腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。Padera 等[21]研究認(rèn)為：腫瘤內(nèi)淋巴管受到腫瘤組織的破壞，僅殘留部分內(nèi)皮細(xì)胞，從而喪失了功能，腫瘤通過侵襲瘤旁具有功能性的淋巴管而實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)移，與我們的研究結(jié)果基本一致。Nitti等[22]也認(rèn)為瘤內(nèi)微淋巴管為無功能的淋巴管，與腫瘤的轉(zhuǎn)移無關(guān)，而腫瘤周邊的微淋巴管則具有功能，可導(dǎo)致腫瘤的轉(zhuǎn)移，因此，我們認(rèn)為在下咽鱗狀細(xì)胞癌中，癌巢周邊區(qū)淋巴管可能是引起腫瘤轉(zhuǎn)移的功能性淋巴管，在局部淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移過程中可能發(fā)揮重要的作用，通過檢測癌巢周邊區(qū)的MLVD可能作為預(yù)測是否存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的一個重要指標(biāo)。

Yoon等[23]研究發(fā)現(xiàn)claudin-1過表達(dá)可增強(qiáng)MMP-2的表達(dá)和活性，MMP-2能有效促進(jìn)血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)-C, VEGF-D的釋放，使VEGF-C, VEGF-D表達(dá)上調(diào)[24]，而VEGF-C和VEGF-D是目前公認(rèn)的主要的淋巴管生成調(diào)節(jié)因子，通過與血管內(nèi)皮生長因子受體(vascular endothelial growth factor receptor,VEGFR)-3結(jié)合而特異性引起淋巴管的增生與新淋巴管的形成[25]。目前認(rèn)為腫瘤誘導(dǎo)的微淋巴管生成是腫瘤淋巴管轉(zhuǎn)移的重要部分[26]，這些新生成的微淋巴管結(jié)構(gòu)簡單，僅由單層內(nèi)皮細(xì)胞組成，無基底層，細(xì)胞間TJ較少，這些均有利于腫瘤細(xì)胞進(jìn)入淋巴管。同時微淋巴管生成導(dǎo)致MLVD增加，細(xì)胞-細(xì)胞之間的黏附力下降，使癌細(xì)胞更容易自原發(fā)灶釋放脫落，更容易接近微淋巴管，浸潤并侵入微淋巴管，經(jīng)淋巴道轉(zhuǎn)移進(jìn)入?yún)^(qū)域淋巴結(jié)，從而發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[27]。

本研究發(fā)現(xiàn)：在下咽鱗癌癌巢周邊區(qū)中，claudin-1陽性表達(dá)的MLVD明顯高于claudin-1陰性表達(dá)組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，考慮claudin-1過表達(dá)可能通過增強(qiáng)MMP-2的表達(dá)，導(dǎo)致VEGF-C, VEGF-D的釋放和表達(dá)上調(diào)，通過特定的途徑，特異性引起淋巴管的增生與新淋巴管的形成，導(dǎo)致MLVD增加，同時，claudin-1過表達(dá)抑制了E-cadherin表達(dá)，后者表達(dá)降低，細(xì)胞-細(xì)胞間的粘附力下降，使腫瘤細(xì)胞更容易自原發(fā)灶脫落，接近微淋巴管，浸潤并侵入相鄰微淋巴管，經(jīng)淋巴管轉(zhuǎn)移進(jìn)入淋巴結(jié)，從而導(dǎo)致淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)claudin-1在下咽鱗狀細(xì)胞癌中存在過表達(dá)現(xiàn)象，并且與下咽癌的分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均有關(guān)，同時，claudin-1陽性表達(dá)的MLVD明顯高于claudin-1陰性表達(dá)組，考慮淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與MLVD有關(guān)，高表達(dá)claudin-1可能會誘導(dǎo)腫瘤淋巴管生成，從而促進(jìn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。此外，claudin-1與患者的生存率相關(guān)，可作為下咽鱗狀細(xì)胞癌術(shù)后的監(jiān)測指標(biāo)，可能成為下咽鱗狀細(xì)胞癌治療的一個新的靶點(diǎn)。