胡麗萍，肖軼婧，唐子春，孫 典，沈 銘*

1南京醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院綜合診療科，2江蘇省口腔疾病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，3江蘇省口腔轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)工程研究中心，江蘇 南京 210029

新生血管能夠給新生組織提供氧及必要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，進(jìn)而在新骨生成過(guò)程中發(fā)揮重要作用［1-2］。研究表明，來(lái)自骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基的外泌體可以通過(guò)增強(qiáng)血管生成促進(jìn)骨再生［3］。但骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在促進(jìn)血管新生的廣泛應(yīng)用中受到以下因素的限制：需要一定的侵入性操作，以及供體年齡依賴性分化導(dǎo)致的不穩(wěn)定性［4］。研究表明人羊膜源間充質(zhì)干細(xì)胞（human amnion-derived mesenchymal stem cell，hAMSC）同樣顯示了較強(qiáng)的促進(jìn)血管生成的能力［5］，具有穩(wěn)定的活性［6］，且采集方便，對(duì)供者無(wú)風(fēng)險(xiǎn)。與通常用于分離種子細(xì)胞的其他組織類型相比，捐獻(xiàn)的羊膜組織數(shù)量豐富，較少產(chǎn)生倫理問(wèn)題［7］。因此，hAMSC 是一個(gè)具有發(fā)展前景的種子細(xì)胞。我們前期研究發(fā)現(xiàn)hAMSC 的培養(yǎng)上清具有較強(qiáng)的促血管生成作用［5］，然而機(jī)制尚不十分明確。

環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）是一種在真核細(xì)胞中廣泛表達(dá)的具有閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的長(zhǎng)鏈非編碼RNA［8-10］。研究發(fā)現(xiàn)circRNA 不僅是轉(zhuǎn)錄的副產(chǎn)品，還可以在疾病和發(fā)展過(guò)程中介導(dǎo)細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡［11-13］。目前發(fā)現(xiàn)circRNA 發(fā)揮功能的多種機(jī)制包括：①circRNA 可充當(dāng)分子海綿，吸附miRNA 以減少其對(duì)mRNA 的降解和翻譯的抑制［14-16］；②部分circRNA 可調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄［17］；③circRNA可與功能蛋白相互作用［18-19］；④circRNA可被翻譯成蛋白［13］。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，hAMSC培養(yǎng)上清（conditioned medium，CM）可促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVEC）內(nèi)多種circRNA的表達(dá)，其中包括circ-0001649。因此，本研究旨在探究circ-0001649 是否參與hAMSC促血管生成的作用以及潛在機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

胎牛血清、α-MEM 培養(yǎng)基、DMEM 培養(yǎng)基（Hy-Clone公司，美國(guó)），過(guò)濾器（Merck公司，美國(guó)），基質(zhì)膠（BD 公司，美國(guó)），Image J（1.8.0 版本；http：//imagej.nih.gov/ij/）；Transwell 小室（北京康寧公司）；Lipofectamine?2000 轉(zhuǎn)染試劑、TRIzol?（Invitrogen 公司，美國(guó)），抗GAPDH、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP9）單克隆抗體（Santa Cruz 公司，美國(guó)）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

hAMSC 從足月妊娠（健康懷孕女性、妊娠期為38～41 周）的女性供者胎盤中分離。本研究所有實(shí)驗(yàn)方法均通過(guò)南京醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（PJ2013-037-001）。本研究涉及的研究均遵循《赫爾辛基宣言》，招募的每位捐獻(xiàn)者對(duì)實(shí)驗(yàn)條款內(nèi)容均已知情同意。

細(xì)胞貼壁培養(yǎng)于含10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基中，青、鏈霉素終濃度為100 U/mL。HUVEC 貼壁培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中，青、鏈霉素終濃度為100 U/mL。細(xì)胞均置于37 ℃含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 條件培養(yǎng)基的收集

當(dāng)hAMSC 在15 cm 培養(yǎng)皿中生長(zhǎng)至70%～80%融合時(shí)，去除培養(yǎng)液，并用1×PBS洗滌3次后，換成30 mL添加青霉素-鏈霉素（100 U/mL青霉素、100 g/mL鏈霉素）的DMEM∶α-MEM=1∶1 的混合培養(yǎng)基在含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后收集30 mL的培養(yǎng)基，4 ℃離心。然后，培養(yǎng)基經(jīng)0.45 μm 過(guò)濾器過(guò)濾，分裝并儲(chǔ)存在-80 ℃深低溫冰箱作為CM 使用。后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用的hAMSC-CM 含80% CM，我們之前的結(jié)果表明，這一比例理想地促進(jìn)了HUVEC的生存能力。hAMSC 來(lái)源于3 個(gè)不同的供體，每個(gè)供體的hAMSC-CM進(jìn)行了3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。采用無(wú)血清培養(yǎng)基作為對(duì)照。

1.2.3 血管生成實(shí)驗(yàn)

將HUVEC 接種在預(yù)先鋪有基質(zhì)膠的96 孔板上（50 μL 每孔，37 ℃靜置30 min），接種密度為每孔4 000個(gè)細(xì)胞，用均添加了1%胎牛血清的hAMSC-CM 或?qū)φ张囵B(yǎng)基，在37 ℃含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～6 h。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3 次，在100 倍的光學(xué)顯微鏡下獲取成管圖像，然后在每孔中隨機(jī)選取3個(gè)視野，使用Image J軟件定量分析總成管長(zhǎng)度。

1.2.4 瘢痕愈合實(shí)驗(yàn)和Transwell穿梭實(shí)驗(yàn)

待HUVEC 在含有10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中（6 孔板中每孔1×104個(gè)細(xì)胞）長(zhǎng)滿形成單層后用移液管尖端刮出一條直線形成一個(gè)間隙，用1×PBS 洗滌去除細(xì)胞碎片。換成含2%胎牛血清的hAMSC-CM（80%CM）或含2%胎牛血清的對(duì)照培養(yǎng)基培養(yǎng)13 h。在0 h 和13 h 使用光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞遷移狀態(tài)并獲得顯微圖像（標(biāo)記位置每孔3 張）。對(duì)于每一幅圖像，使用Image J 軟件測(cè)量縫隙的面積。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次，對(duì)于每一組，測(cè)量每個(gè)間隔內(nèi)的3個(gè)隨機(jī)位置。細(xì)胞的遷移率計(jì)算為［（0 h的縫隙面積-13 h的縫隙面積）/0 h的縫隙面積］，最終用各組與陰性對(duì)照組的比值顯示，以對(duì)照組為標(biāo)準(zhǔn)化1。

Transwell 穿梭實(shí)驗(yàn)：準(zhǔn)備8.0 μm的Transwell 小室和對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVEC。在下室中預(yù)先加入600 mL 含5%胎牛血清的hAMSC-CM（80% CM）或含5%胎牛血清的對(duì)照培養(yǎng)基，上室加入200 mL 無(wú)血清對(duì)照培養(yǎng)基（8 000個(gè)細(xì)胞）。小室放置在37 ℃培養(yǎng)箱孵育12 h后，將附著在小室下表面的遷移細(xì)胞在室溫下用含10%甲醇的0.1%結(jié)晶紫固定染色1 h。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次，光學(xué)顯微鏡下觀察并隨機(jī)對(duì)3個(gè)視野的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)和拍照。細(xì)胞的遷移率最終用各組與陰性對(duì)照組穿出細(xì)胞的比值顯示，以對(duì)照組為標(biāo)準(zhǔn)化1。

1.2.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

針對(duì)circ-0001649的特異性小干擾RNA（siRNA）和miR-203a 抑制劑購(gòu)于廣州銳博公司。siRNA（50 nmol/L）或抑制劑（100 nmol/L）用Lipofectamine?2000轉(zhuǎn)染試劑按照說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

1.2.6 蛋白印跡實(shí)驗(yàn)

收集細(xì)胞進(jìn)行裂解、離心收集總蛋白。使用10% SDS-PAGE 電泳分離蛋白，并電轉(zhuǎn)移至PVDF膜。在室溫下用5%脫脂牛奶封閉1 h 后分別加入相應(yīng)的一抗：GAPDH、VEGFA、MMP9，4 ℃孵育過(guò)夜，加入對(duì)應(yīng)二抗，室溫孵育1 h。用ECL 發(fā)光液進(jìn)行增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)，使用Image Lab軟件計(jì)算條帶灰度值。

1.2.7 RNA提取與實(shí)時(shí)熒光定量PCR

使用TRIzol?提取總RNA 后，使用Nanodrop 2000 分光光度法測(cè)量RNA 的質(zhì)量和濃度。用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將1 μg 總RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用Hieff qPCR SYBR Green Master Mix 和PCR 檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRTPCR）實(shí)驗(yàn)。分別用GAPDH 和U6 作為檢測(cè)circ-RNA 和miRNA 的內(nèi)參。用循環(huán)相對(duì)表達(dá)量計(jì)算閾值（Ct值）和2-ΔΔCt來(lái)表示目的基因相對(duì)表達(dá)量。

1.2.8 分組處理

CM 組：培養(yǎng)體系為hAMSC-CM（80%CM）培養(yǎng)基；CM+si-NC 組：先在DMEM 完全培養(yǎng)基條件下轉(zhuǎn)染對(duì)照siRNA，再換成hAMSC-CM（80% CM）培養(yǎng)基；CM+si-circ-0001649 組：先在DMEM 完全培養(yǎng)基條件下轉(zhuǎn)染siRNA 敲低circ-0001649，再換成hAMSC-CM（80%CM）培養(yǎng)基。使用miR-203a 的類似物miR-203a mimic 和抑制劑miR-203a-inhibitor 處 理HUVEL細(xì)胞，分為：mimic-NC組、mimic組、inhibitor-NC 組、inhibitor 組：在DMEM 完全培養(yǎng)基培養(yǎng)下進(jìn)行相應(yīng)的轉(zhuǎn)染；si-NC+inh-NC 組、si-circ-0001649+inh-NC 組、si-circ-0001649+inh 組、si-NC+inh 組：在DMEM 完全培養(yǎng)基培養(yǎng)下進(jìn)行相應(yīng)的共轉(zhuǎn)染后換成hAMSC-CM（80%CM）培養(yǎng)基。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS15.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。定量數(shù)據(jù)顯示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（）。兩組數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)。多組數(shù)據(jù)比較采用ANOVA-SNK 檢驗(yàn)。所有的統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)都是雙尾檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 hAMSCs-CM 通過(guò)促進(jìn)circ-0001649 表達(dá)誘導(dǎo)HUVEC的成管和遷移

與對(duì)照組相比，HUVEC與hAMSC-CM共同孵育24 h 后，細(xì)胞內(nèi)circ-0001649 的表達(dá)水平明顯升高（圖1A），提示circ-0001649 可能參與了hAMSC-CM的促血管生成過(guò)程。為了驗(yàn)證這一猜想，轉(zhuǎn)染siRNA來(lái)敲低HUVEC 中circ-0001649 的表達(dá)（圖1B）。hAMSC-CM刺激組與對(duì)照組相比，HUVEC的成管能力和遷移能力均提高。然而當(dāng)在HUVEC 中敲低circ-0001649 后，其成管能力和遷移能力均減弱（圖1C、D、E）。說(shuō)明circ-0001649 在hAMSC-CM 促血管生成過(guò)程中起著重要作用。同時(shí)也檢測(cè)了成血管相關(guān)蛋白，得到的結(jié)果一致：hAMSC-CM刺激后HUVEC細(xì)胞內(nèi)VEGFA和MMP9蛋白表達(dá)水平升高，敲低circ-0001649則抑制了蛋白表達(dá)（圖1F）。

圖1 hAMSC-CM通過(guò)促進(jìn)circ-0001649表達(dá)誘導(dǎo)HUVEC的成管和遷移Figure 1 The up-regulation of circ-0001649 in HUVEC induced by hAMSC-CM promoted the angiogenesis and migration of HUVEC

2.2 circ-0001649 通過(guò)miR-203a 提高VEGFA/MMP9表達(dá)促進(jìn)HUVEC的成管和遷移

circ-RNA 可作為內(nèi)源性競(jìng)爭(zhēng)性RNA 與miRNA結(jié)合而發(fā)揮作用，經(jīng)circular RNA interactome 網(wǎng)站（https：//circinteractome.nia.nih.gov/）預(yù) 測(cè) circ -0001649 與miR-203a之間存在結(jié)合位點(diǎn)（圖2A），提示兩者可能結(jié)合。同時(shí)通過(guò)miRTarBase 網(wǎng)站（http：//mirtarbase.cuhk.edu.cn/php/index.php）預(yù)測(cè)，VEGFA 和MMP9 是miR-203a 的靶基因。本研究結(jié)果顯示，miR-203a的類似物miR-203a-mimic 和抑制劑miR-203a-inhibitor 分別抑制和促進(jìn)VEGFA 和MMP9的蛋白表達(dá)（圖2B），提示VEGFA和MMP9可能是miR-203a的靶基因。為了驗(yàn)證circ-0001649是否通過(guò)結(jié)合miR-203a 發(fā)揮作用，對(duì)circ-0001649 敲低的HUVEC細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染miR-203a抑制劑miR-203a-inhibitor 和對(duì)照inhibitor-NC 來(lái)進(jìn)行拯救實(shí)驗(yàn)。qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染miR-203a-inhibitor后并不影響circ-0001649 的敲低效率（圖2C），但是與inhibitor-NC 相比，轉(zhuǎn)染miR-203a-inhibitor卻能部分逆轉(zhuǎn)circ-0001649敲低引起的成管和遷移能力的降低（圖2D、E、F）。同時(shí)與此一致的是，蛋白印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果同樣顯示：miR-203a-inhibitor能部分恢復(fù)因敲低circ-0001649而引起的VEGFA和MMP9蛋白水平的下降（圖2G）。以上實(shí)驗(yàn)證實(shí)了hAMSCs-CM的促血管生成作用可部分通過(guò)上調(diào)HUVEC 細(xì)胞內(nèi)circ-0001649的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)，circ-0001649與miR-203a存在內(nèi)源性競(jìng)爭(zhēng)，促進(jìn)下游VEGFA和MMP9表達(dá)。

圖2 circ-0001649通過(guò)miR-203a提高VEGFA/MMP9表達(dá)促進(jìn)HUVEC的成管和遷移Figure 2 Circ-0001649 promoted angiogenesis and migration of HUVEC through increasing VEGFA/MMP9 by miR-203a

3 討論

由于先天性原因和后天的外傷、腫瘤、炎癥，頜骨缺損在臨床中較為常見(jiàn)。其不僅可以導(dǎo)致咀嚼及語(yǔ)言功能障礙，還可導(dǎo)致顱頜面畸形，從生理、心理兩方面對(duì)患者造成嚴(yán)重影響。近年來(lái)出現(xiàn)了一種新型的材料——組織工程化骨，給治療頜面部骨缺損提供了新的思路。組織工程化骨通過(guò)采取合適的支架材料復(fù)合生物活性分子及種子細(xì)胞，于體外構(gòu)建結(jié)構(gòu)功能與自然骨相近的組織工程材料。

促進(jìn)血管生成是促進(jìn)骨再生及構(gòu)建組織工程化骨的重要策略，因?yàn)楣堑挠匣蛑厮芏夹枰律軄?lái)提供氧和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以維持正常代謝。通過(guò)干細(xì)胞促進(jìn)血管新生已被認(rèn)為是一種潛在的解決方案［20］。既往研究表明，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分泌多種相關(guān)生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子，如VEGF、胰島素樣生長(zhǎng)因子1、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子等，以旁分泌方式促進(jìn)骨再生過(guò)程中的血管新生［21］。但骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在促進(jìn)血管新生的應(yīng)用中受到以下因素的限制：需要一定的侵入性操作，可能對(duì)供者產(chǎn)生一定損傷，以及供體年齡依賴性分化導(dǎo)致的不穩(wěn)定性。于是較容易獲得、穩(wěn)定性較好、且涉及倫理問(wèn)題較少的hAMSC具有更好的應(yīng)用前景。同樣，本課題組之前的數(shù)據(jù)顯示，hAMSC 能明顯增強(qiáng)HUVEC 的血管生成［5］。

近年來(lái)circRNA由于其在血管新生中發(fā)揮重要作用而備受關(guān)注。例如circRNA hsa_circ_0074834通過(guò)作為miR-942-5p 的ceRNA 進(jìn)而增加ZEB1 和VEGF 的表達(dá)來(lái)促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨-血管生成耦合過(guò)程［22］；circ-002136 通過(guò)與miR-138-5p結(jié)合緩解對(duì)轉(zhuǎn)錄因子SOX13的抑制，促進(jìn)SPON2表達(dá)進(jìn)而調(diào)控膠質(zhì)瘤血管生成［23］；circ-0003204 通過(guò)促進(jìn)E-cadherin表達(dá)，降低N-cadherin和Vimentin的表達(dá)進(jìn)而抑制氧化修飾低密度脂蛋白誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和血管生成等。本研究探討了circRNA 在促血管生成過(guò)程中的作用。結(jié)果表明，hAMSC-CM 可顯著上調(diào)HUVEC 中circ-0001649 的表達(dá)。此前其他研究表明circ-0001649可通過(guò)與多個(gè)miRNA結(jié)合進(jìn)而抑制肝細(xì)胞癌進(jìn)展，在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤中circ-0001649 的下調(diào)與其不良預(yù)后有關(guān)，并通過(guò)AKT/mTOR 信號(hào)通路調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡。本研究通過(guò)生物信息學(xué)分析和拯救實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)circ-0001649 可通過(guò)與miR-203a 結(jié)合上調(diào)VEGFA、MMP9的表達(dá)進(jìn)而發(fā)揮促血管生成因子的作用。然而，hAMSC-CM 上調(diào)HUVEC 中circ-0001649 表達(dá)的具體機(jī)制尚不清楚。推測(cè)可能是hAMSC-CM 中含有的一些生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子進(jìn)入HUVEC 中，通過(guò)一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，促進(jìn)circ-0001649 轉(zhuǎn)錄。這些還需要通過(guò)后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究。

綜上，本研究表明circ-0001649參與了hAMSCCM 誘導(dǎo)的HUVEC 的血管生成。這種促血管生成作用可能是部分通過(guò)上調(diào)HUVEC 細(xì)胞內(nèi)circ-0001649 表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的，circ-0001649與miR-203a內(nèi)源性競(jìng)爭(zhēng)，促進(jìn)下游VEGFA和MMP9表達(dá)。本研究為探究hAMSC 促進(jìn)血管新生的作用機(jī)制提供了新思路。