黃 維， 郭夢(mèng)云， 王玉啟 ， 林金壘， 張宇翔， 鄒雙全

(1.福建農(nóng)林大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,福建 福州 350004; 2.自然生物資源保育利用福建省高校工程研究中心,福建 福州 350004)

圓齒野鴉椿(EuscaphiskonishiiHayata)為省沽油科落葉灌木或小喬木，是優(yōu)良的觀賞植物[1-2]。同時(shí)圓齒野鴉椿果也是福建的民間傳統(tǒng)藥材，具有行氣鎮(zhèn)痛、消腫散結(jié)的功效，多用于治療偏頭痛、胃痛、腸炎等[3-4]?，F(xiàn)代化學(xué)和藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，圓齒野鴉椿果皮中主要含有三萜、黃酮、色原酮、多酚、多糖等成分[5-7]，藥用價(jià)值有抗炎、抗癌、抗氧化等[8-11]。多糖是圓齒野鴉椿果皮的主要成分之一，本研究對(duì)圓齒野鴉椿果皮多糖提取工藝及其單糖組成進(jìn)行研究與分析，并對(duì)多糖抗炎功效進(jìn)行檢測，可為圓齒野鴉椿多糖資源的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

圓齒野鴉椿(EuscaphiskonishiiHayata)，2018年10月于福建省邵武市天成巖采集果實(shí)，經(jīng)福建農(nóng)林大學(xué)鄒雙全研究員鑒定為圓齒野鴉椿。果實(shí)曬干后分離出果皮和種子，果皮以中藥打粉機(jī)粉碎后過篩，取粒徑小于0.42 mm的樣品備用。

從中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫購入RAW264.7巨噬細(xì)胞。鼠李糖、半乳糖、核糖、半乳糖醛酸和阿拉伯糖購于上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司(純度≥98%)；葡萄糖、木糖、葡萄糖醛酸和甘露糖購于北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司(純度≥98%)；巖藻糖購于成都曼斯特生物科技有限公司；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；四甲基偶氮唑鹽(MTT)、DEAE-52纖維素和內(nèi)毒素脂多糖(LPS)購于北京索萊寶科技有限公司；地塞米松購于上海生工生物；DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素-鏈霉素(青鏈雙抗)均購自美國Hyclone公司；前列腺素E2(PGE2)ELISA試劑盒購于上海酶聯(lián)生物公司；NO檢測試劑盒購于江蘇碧云天公司；色譜級(jí)乙腈購于德國默克公司。硫酸、苯酚、氯仿、三氟乙酸、無水乙醇、NaOH、NaCl均為分析純?cè)噭?/p>

Millipore Synergy-UV超純水機(jī)，美國密理博公司；Agilent 1260高效液相色譜(HPLC)儀，美國安捷倫公司；RE52CS-2旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；Thermo Varioskan Flash多功能酶標(biāo)儀，美國默賽飛公司。

1.2 圓齒野鴉椿果皮多糖的提取

稱取經(jīng)石油醚回流脫脂后的圓齒野鴉椿果皮干粉2.0 g，置于具塞錐形瓶中，以不同的液料比制成混合溶液后，加入超聲波容器中，按設(shè)定的溫度、功率，提取相應(yīng)的時(shí)間，獲得不同條件下果皮多糖的提取液。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件，選取單因素液料比(10 ∶1、 15 ∶1、 20 ∶1、 25 ∶1、 30 ∶1，mL ∶g)、提取時(shí)間(30～120 min)、提取溫度(30～70 ℃)、超聲波功率(100～500 W)分別進(jìn)行試驗(yàn)，每一組設(shè)置3個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)，探討這4個(gè)因素對(duì)多糖提取得率的影響。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)4因素3水平響應(yīng)面中心組合實(shí)驗(yàn)，使用Design-Expert 10.0.2軟件對(duì)其結(jié)果進(jìn)行優(yōu)化。

1.3 圓齒野鴉椿果皮多糖的分離純化

以優(yōu)化后的提取方案進(jìn)行圓齒野鴉椿果皮多糖提取，經(jīng)過乙醇沉淀后獲得圓齒野鴉椿果皮粗多糖。將50 mg 圓齒野鴉椿果皮粗多糖溶解于蒸餾水中，攪拌均勻后上樣于DEAE-52纖維素層析柱，用0.1、 0.3、 0.5、 0.7、 0.9 mol/L的NaCl溶液依次進(jìn)行梯度洗脫，每個(gè)濃度洗脫液200 mL，控制洗脫液流速為1.0 mL/min，收集洗脫液，每管5 mL。測定洗脫液在490 nm處的吸光度值，繪制洗脫時(shí)間與吸光度值的關(guān)系曲線，合并單一對(duì)稱峰的洗脫液，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至10 mL左右，用相對(duì)分子質(zhì)量3 000的透析袋在流動(dòng)的純水中透析過夜去除NaCl，再進(jìn)行冷凍干燥，收集得到圓齒野鴉椿果皮多糖的一個(gè)主要成分，將其標(biāo)記為PEP。

1.4 多糖的分析測定

1.4.1多糖中糖、蛋白和糖醛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定 采用苯酚-硫酸法測定果皮多糖中糖的含量，以葡萄糖為對(duì)照品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，測試波長490 nm[12]；采用考馬斯亮藍(lán)染色法測定多糖中蛋白質(zhì)含量，以牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，測試波長為595 nm[13]；采用硫酸-咔唑法測定多糖中糖醛酸含量，以半乳糖醛酸為標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，測試波長523 nm[14]。

1.4.2多糖分子質(zhì)量的測定 稱取分子質(zhì)量1～700 ku的葡聚糖為標(biāo)準(zhǔn)品，采用高效凝膠滲透色譜(GPC)法測定PEP的數(shù)均相對(duì)分子質(zhì)量(Mn)、重均相對(duì)分子質(zhì)量(Mw)，Z均相對(duì)分子質(zhì)量(Mz)[15]。色譜條件: Shodex OHpak SB-806HQ色譜柱(300 mm×8.0 mm，5 μm)，流動(dòng)相為超純水(0.02%疊氮化鈉)，pH值6，流速1.0 mL/min，柱溫25 ℃，示差折光檢測器，進(jìn)樣量20 μL。

1.4.3單糖組成的測定 精密稱取葡萄糖5.0 mg、鼠李糖 4.6 mg、阿拉伯糖5.0 mg、半乳糖醛酸 4.2 mg、半乳糖4.9 mg、巖藻糖4.7 mg、核糖5.2 mg、甘露糖4.6 mg、木糖4.3 mg和葡萄糖醛酸4.8 mg于磨砂具塞試管中，用10%甲醇定容至5 mL，混合均勻后得到標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

精密稱取冷凍干燥后的PEP 10.0 mg，加入2 mol/L三氟乙酸2 mL，于100 ℃下水解2 h，冷卻后用3 mol/L NaOH中和至pH值為7，然后用蒸餾水定容至5 mL，得到水解后的PEP樣品。

取標(biāo)準(zhǔn)品溶液和水解后的樣品溶液各200 μL，分別加入0.3 mol/L NaOH溶液200 μL，0.5 mol/L PMP 200 μL，混合均勻后置于70 ℃的水浴加熱100 min，冷卻后依次加入0.3 mol/L鹽酸和蒸餾水各200 μL?；靹蚝蠹尤? mL氯仿萃取，之后棄去氯仿層，再重復(fù)萃取3次，上清液以0.22 μm濾頭過濾后進(jìn)行HPLC檢測[16]。

1.5 多糖的抗炎活性研究

采用LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞RAW264.7構(gòu)建炎癥反應(yīng)細(xì)胞模型，考察PEP給藥后對(duì)細(xì)胞存活率和炎癥因子分泌量的影響。用DMEM培養(yǎng)基(含1%青鏈雙抗和10%胎牛血清)培養(yǎng)RAW264.7細(xì)胞。設(shè)置調(diào)零孔(僅有培養(yǎng)基，無細(xì)胞存在)為對(duì)照，以每毫升2×105個(gè)RAW264.7細(xì)胞接種至96孔板上，每孔180 μL細(xì)胞液。培養(yǎng)過夜后，將有細(xì)胞的孔劃分為模型組、空白對(duì)照組、給藥組和陽性對(duì)照組，每組各5個(gè)復(fù)孔。空白對(duì)照組和模型組給予含0.1%二甲基亞砜(DMSO)的DMEM培養(yǎng)基，陽性對(duì)照組以200 mg/L 給予地塞米松，給藥組分別以1、 2、 5 和10 g/L PEP給藥，每組所加入的體積均為20 μL。除空白對(duì)照組外，陽性對(duì)照組和給藥組以藥物作用2 h后，再以LPS(終質(zhì)量濃度為 1 mg/L)刺激22 h[17]。

取一定量的細(xì)胞培養(yǎng)液，用NO試劑盒對(duì)RAW264.7細(xì)胞上清液NO的分泌情況進(jìn)行檢測，用ELISA試劑盒對(duì)RAW264.7細(xì)胞上清液中炎癥因子PGE2 的表達(dá)量進(jìn)行檢測。取RAW264.7細(xì)胞于96孔板上，每孔180 μL細(xì)胞液，于恒溫箱培養(yǎng)24 h后，每孔加入10 μL 5 g/L的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng) 4 h 后，棄去上清液，向細(xì)胞中加入150 μL DMSO溶液振蕩溶解10 min，測定波長490 nm處的吸光度(A)，計(jì)算細(xì)胞存活率(%)=(A藥物-A調(diào)零)/(A空白-A調(diào)零)×100%，其中，A藥物表示經(jīng)藥物處理孔中樣品的吸光度值，A調(diào)零表示調(diào)零孔中樣品的吸光度值，A空白表示空白孔中樣品的吸光度值。

2 結(jié)果與分析

2.1 多糖提取的單因素試驗(yàn)

為了探究多糖提取的最佳條件，分別采用不同的液料比、超聲波功率、提取時(shí)間和提取溫度來提取圓齒野鴉椿果皮多糖。圖1(a)為不同的液料比對(duì)提取得率的影響情況，其他提取條件為溫度40 ℃、超聲波功率300 W、提取60 min，發(fā)現(xiàn)液料比達(dá)到25 ∶1(mL ∶g)后，液料比繼續(xù)增加，多糖提取得率趨于穩(wěn)定甚至略微降低，可能是由于液料比在超過一定比例后，多糖的溶出速度會(huì)變慢引起的。圖1(b)為不同超聲波功率對(duì)提取得率的影響，其他提取條件為液料比25 ∶1(mL ∶g)、提取溫度40 ℃、提取時(shí)間60 min，得出超聲波功率達(dá)到400 W時(shí)，多糖提取得率最大，當(dāng)超聲波功率達(dá)到500 W時(shí)，提取得率下降，可能是超聲波功率過大會(huì)引起多糖降解。圖1(c)為研究不同提取時(shí)間對(duì)果皮多糖提取得率的影響，其他提取條件為超聲波功率400 W、溫度40 ℃、液料比25 ∶1(mL ∶g)，得出提取時(shí)間為120 min時(shí)，提取得率最高，提取時(shí)間超過120 min會(huì)導(dǎo)致多糖提取得率下降，可能與提取時(shí)間過長引起多糖結(jié)構(gòu)破壞相關(guān)。圖1(d)研究了提取溫度在30～70 ℃間對(duì)提取得率的影響，其他提取條件為液料比25 ∶1(mL ∶g)、超聲波功率400 W、提取時(shí)間為120 min，得出提取溫度為60 ℃時(shí)，圓齒野鴉椿果皮多糖的提取得率達(dá)到最高，提取溫度進(jìn)一步升高提取得率下降，可能與高溫會(huì)引起多糖降解有關(guān)。因此，選取提取液料比25 ∶1(mL ∶g)、超聲波功率400 W、提取時(shí)間120 min和提取溫度60 ℃作為響應(yīng)面法試驗(yàn)的中心值。

圖1 液料比(a)、超聲波功率(b)、提取時(shí)間(c)和提取溫度(d)對(duì)圓齒野鴉椿果皮多糖提取得率的影響

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，采用中心組合原理，將液料比(X1)、超聲波功率(X2)、提取時(shí)間(X3)、提取溫度(X4)設(shè)為自變量，多糖提取得率為因變量(Y)，進(jìn)行響應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計(jì)，試驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 響應(yīng)面分析方案及結(jié)果

續(xù)表1

表2 回歸模型方差分析

通過Design Expert 10.0.2分析，得出多糖提取工藝的最佳條件為液料比28.94 ∶1(mL ∶g)、超聲波功率384.76 W、提取時(shí)間102.16 min和提取溫度62.7 ℃，提取得率高達(dá)29.50%。根據(jù)實(shí)際實(shí)驗(yàn)條件調(diào)整，最佳提取條件是液料比30 ∶1(mL ∶g)、超聲波功率400 W、提取時(shí)間100 min和提取溫度60 ℃。在進(jìn)行5次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)后，得到多糖提取得率平均值為(29.15±0.26)%，與理論值較為接近，說明此響應(yīng)面模型可靠。

2.3 圓齒野鴉椿果皮多糖的分離純化

圖2 圓齒野鴉椿果皮多糖的洗脫曲線

將提取的多糖溶液進(jìn)行醇沉后，用DEAE-52纖維素柱對(duì)其進(jìn)行分離純化。采用0.1、 0.3、 0.5、 0.7、 0.9 mol/L的NaCl溶液依次進(jìn)行梯度洗脫，每個(gè)濃度洗脫液體積200 mL，收集每管洗脫液5 mL，采用苯酚-硫酸比色法于490 nm波長下檢測每管洗脫液的吸光值。通過繪制洗脫液的管數(shù)與其吸光值的關(guān)系曲線，得到一個(gè)明顯的峰(見圖2)。合并此峰相應(yīng)的洗脫液(40～53管)，先用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮后再透析除鹽，然后對(duì)其冷凍干燥，得到了圓齒野鴉椿果皮多糖的一個(gè)主要成分，命名為PEP。采用考馬斯亮藍(lán)染色法和苯酚-硫酸法檢測PEP中蛋白質(zhì)和多糖的含量，其中蛋白質(zhì)為0.02%，多糖為89.26%，糖醛酸為7.38%。采用高效GPC法測定PEP的相對(duì)分子質(zhì)量，結(jié)果表明：PEP化學(xué)均一性較好，基本呈現(xiàn)單一峰形，重均相對(duì)分子質(zhì)量(Mw)為4 958，數(shù)均相對(duì)分子質(zhì)量(Mn)為3 664，Z均相對(duì)分子質(zhì)量(Mz)為5 866，聚合物分散性指數(shù)(PDI)為1.353，接近1，說明PEP多糖分子質(zhì)量分布比較均勻。

2.4 PEP單糖組成分析

1.甘露糖mannose； 2.核糖ribose； 3.鼠李糖rhamnose； 4.葡萄糖醛酸gluconose； 5.半乳糖醛酸galactose aldose； 6.葡萄糖glucose； 7.半乳糖galactose； 8.阿拉伯糖 arabinose； 9.木糖xylose； 10.巖藻糖fucose

PEP經(jīng)過柱前衍生化，并用HPLC檢測其單糖組成情況，結(jié)果如圖3所示。PEP含有10種單糖，分別為甘露糖、半乳糖、葡萄糖醛酸、巖藻糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、核糖。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品中單糖濃度、樣品和標(biāo)準(zhǔn)品單糖峰面積的比值，計(jì)算出PEP中含甘露糖5.65%、葡萄糖37.06%、半乳糖19.51%、巖藻糖2.24%、木糖26.10%、 核糖1.33%、 葡萄糖醛酸0.89%、 鼠李糖2.33%、 半乳糖醛酸0.68% 和阿拉伯糖4.20%。分析結(jié)果表明：圓齒野鴉椿果皮多糖中的葡萄糖、木糖和半乳糖含量較高。葡萄糖和半乳糖為主要的供能糖類，而木糖為優(yōu)質(zhì)的無熱量甜味劑，對(duì)改善人體腸道微環(huán)境亦具有良好的功效[18]。文獻(xiàn)報(bào)道圓齒野鴉椿果實(shí)對(duì)痢疾等胃腸疾病有較好的療效[3-4]，可能與其多糖中的木糖含量較高有關(guān)。

2.5 PEP抗炎活性檢測

PEP對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞炎癥因子的分泌和細(xì)胞存活率的影響如表3所示。

表3 PEP對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞炎癥反應(yīng)和存活率的影響

當(dāng)PEP質(zhì)量濃度為1、 2、 5和10 g/L時(shí)，RAW264.7細(xì)胞上清液分泌的NO和PGE2含量均顯著低于模型組的含量(P<0.05或P<0.01)，且上述兩個(gè)炎癥因子的含量隨PEP質(zhì)量濃度增大而降低，說明PEP能抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞NO和PGE2炎癥因子的分泌；MTT法對(duì)給藥后的細(xì)胞進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)PEP給藥濃度在0～10 g/L范圍內(nèi)時(shí)，RAW264.7細(xì)胞的存活率變化不顯著(P>0.05)，表明PEP對(duì)RAW264.7細(xì)胞無明顯細(xì)胞毒作用。

3 結(jié) 論

3.1采用超聲波輔助提取圓齒野鴉椿果皮多糖，通過單因素法和響應(yīng)面法結(jié)合，優(yōu)化了多糖的提取條件。考察了不同液料比、超聲波功率、提取時(shí)間和提取溫度對(duì)多糖提取得率的影響，結(jié)果表明：優(yōu)化后的提取條件為液料比30 ∶1(mL ∶g)、超聲波功率400 W、提取時(shí)間100 min、提取溫度60 ℃，響應(yīng)面法優(yōu)化得到的最高理論提取得率為29.50%，該條件下5次驗(yàn)證試驗(yàn)的平均提取得率為(29.15±0.26)%，說明此工藝多糖提取得率高且重復(fù)性較好。

3.2采用DEAE-52纖維素柱對(duì)醇沉后的多糖進(jìn)行分離純化，得到一個(gè)主要組分PEP，經(jīng)高效凝膠滲透色譜測得多糖的分子質(zhì)量約為5 ku，柱前衍生化HPLC分析結(jié)果顯示：PEP中含有10種單糖，其中甘露糖5.65%、葡萄糖37.06%、半乳糖19.51%、巖藻糖2.24%、木糖26.10%、核糖1.33%、葡萄糖醛酸0.89%、鼠李糖2.33%、半乳糖醛酸0.68%和阿拉伯糖4.20%。

3.3采用LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞RAW264.7構(gòu)建炎癥反應(yīng)細(xì)胞模型，考察PEP給藥后對(duì)細(xì)胞存活率和炎癥因子分泌量的影響。結(jié)果顯示：1～10 g/L的PEP能降低LPS誘導(dǎo)的炎癥因子NO和PGE2的分泌，并呈現(xiàn)劑量依賴性，且對(duì)RAW264.7細(xì)胞的存活率無顯著影響，體現(xiàn)了圓齒野鴉椿果皮多糖具有高抗炎活性和無細(xì)胞毒性的優(yōu)點(diǎn)，提示圓齒野鴉椿果皮多糖具有良好的開發(fā)利用前景。